Cytokines et homéostasie lymphocytaire T

Erwan Corcuff

Description

Niveau: Supérieur

• mémoire

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté Par Erwan CORCUFF Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : Cytokines et homéostasie lymphocytaire T Soutenu le : devant le jury suivant : Président : Dr Canque Bruno Rapporteur : Dr Bettaïeb Ali Maître de stage : Dr Di Santo James Examinatrice : Dr Garcia Sylvie Examinateur : Dr Eberl Gérard Laboratoire de : Immunophysiologie et immunothérapie des cancers Dr JF Jeannin EPHE (Sciences de la vie et de la terre ) . Faculté de médecine,7 bd Jeanne d'Arc 21079 Dijon Laboratoire : Unité des cytokines et développement lymphoïde Institut Pasteur, Département d'immunologie. 25 Rue du Dr Roux Paris. Dr Di Santo : ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Cytokines et homéostasie lymphocytaire T CORCUFF Erwan EPHE Banque de Monographies SVT 1

• molécule d'adhésion des leucocytes


• tcr-tg antihy-cd8


• souris rag


• homéostasie lymphocytaire


• injection de cellules


• quantification des cd4 tg thymiques


• tcr-cd3

Sujets

• Immunologie
• Mémoire
• Institut Pasteur
• Philippe Corcuff
• García

Informations

• Publié par: profil-nechor-2012
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• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

TITRE : Cytokines et homéostasie lymphocytaire T

Soutenu le : devant le jury suivant :

MEMOIRE Présenté Par Erwan CORCUFF

Président : Dr Canque Bruno Rapporteur : Dr Bettaïeb Ali Maître de stage : Dr Di Santo James Examinatrice : Dr Garcia Sylvie Examinateur : Dr Eberl Gérard

Laboratoire de : Immunophysiologie et immunothérapie des cancers Dr JF Jeannin EPHE (Sciences de la vie et de la terre ) . Faculté de médecine,7 bd Jeanne d’Arc 21079 Dijon Laboratoire : Unité des cytokines et développement lymphoïde Institut Pasteur, Département d’immunologie. 25 Rue du Dr Roux Paris.  Dr Di Santo : [e-mail] ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Cytokines et homéostasie lymphocytaire T CORCUFF Erwan  

RESUME Les lymphocytes, acteurs clés du système immunitaire, sont soumis tout au long de leur existence aux mécanismes physiologiques de régulation homéostatique. L’homéostasie permet de garantir un système immunitaire efficace, en maintenant un remplissage lymphocytaire optimal. Le contrôle et la stabilité du compartiment lymphocytaire périphérique impliquent que, à tout moment, l’organisme doit pouvoir induire la mort cellulaire ou apoptose, la survie, la prolifération et l’expansion, pour pouvoir ajuster la quantité et la qualité lymphocytaires. Les signaux induisant ces événements cellulaires sont d’origines diverses. Pour les lymphocytes T, cellules de l’immunité acquise propre aux vertébrés, responsables de la reconnaissance antigénique de haute affinité et de la mémoire immunologique, il a été mis en évidence au moins deux types de signaux. Le récepteur T, responsable de la reconnaissance antigénique et en grande partie de l’activation cellulaire, joue aussi un rôle important dans la transduction de signaux contrôlant la mort, la survie et les capacités prolifératives de la cellule T qui le porte, ces événements pouvant avoir lieu dans le compartiment périphérique ou au moment du développement thymique. Les récepteurs à cytokines et plus spécifiquement le récepteur commun gc des interleukines 2, 4, 7, 9, 15 et 21, ainsi que les cytokines correspondantes, jouent un rôle important dans l’induction de signaux permettant le contrôle de la durée de vie du lymphocyte T et de ses capacités de prolifération, en périphérie tout comme dans le thymus. Les effets des signaux induits par le TCR et les cytokines, sur la survie, l’apoptose et la prolifération périphériques des lymphocytes T sont l’objet de cette étude.

MOTS CLES : Lymphocytes -Homéostasie -Récepteur T -Cytokines

Introduction Immunité 1  Adaptative et innée  Rôle des lymphocytes T 2  Les lymphocytes T ab  Les lymphocytes T ab CD4 et CD8 3  Les lymphocytes T ab et leurs différents stades d’activations 4 Le développement des lymphocytes T 6  Thymus  Développement T ab

7  Différenciation CD4 et CD8 14  Export thymique 15 Homéostasie 16  Homéostasie lymphocytaire  Homéostasie des lymphocytes T  Événements majeurs liés à l’homéostasie 17  Dérégulation homéostatique 18  Apoptose 19  Compétition Survie 22  Notion et Définition  Interaction CM C H-T R  Cytokines 24

 Molécules de la famille des Bcl-2 Prolifération homéostatique 26  Notion et Définition  Interaction CMH-TCR  Cytokines 27 Projet 28 Modèles d’études 29 Matériels et méthodes Modèles murins 31  Lignées de souris TCR transgéniques  Lignées de souris receveuses 32 Anticorps et réactifs 33 Obtention des cellules T 34 Analyse par cytométrie de flux 34  Marquages cellulaires (CD)  Marquage intracellulaire (Bcl-2) 35 Transferts adoptifs de cellules T 35

Résultats

Les cytokines et l’homéostasie des cellules T CD4 tg 37 Détermination du rôle individuel des cytokines 38  Hôtes et transferts  Survie 39  Prolifération 40

La molécule Bcl-2 et la survie des cellules T CD4 tg 42  Expression endogénique  Expression transgénique 3 4

Quantification des CD4 tg thymiques et spléniques 43 Rôle de la molécule Bcl-2 en absence de l’interleukine 7 44  Transferts de CD4 Bcl-2 gc-

Résultats préliminaires

Les cytokines et l’homéostasie des cellules T CD8 tg 46  Rôle de la chaîne gc dans la génération et la survie des T CD8 transgéniques  Analyse phénotypique des trois modèles transgéniques

La protéine Bcl-2 et la survie des cellules T CD8 tg 47  Expression transgénique  Quantification des CD8 tg thymiques et spléniques

Discussion

Survie 49  Signaux de survie : rôle du CMH  Signaux de survie : rôle des interleukines 50  Cytokines essentielles 51  Autres signaux  Effets de l’hôte 52 Prolifération 53  Prolifération : rôle du CMH  Prolifération : interleukine 7 et Bcl 2 54 -  Origines des cellules transférées  Effets de l’hôte 55                                                                  Transgénèse et recombinaison homologue: limites des modèles 58

Perspectives

«Décryptage» des modèles CD8 TCR transgéniques 58  Nombre de récepteurs T Niveau d’activation des récepteurs T 59 Population CD8 tg «CD44 like»  Détermination des facteurs cytokiniques essentiels aux CD8 tg                      Conclusion                                                                                                                                                                       60

 Figures 61

 Bibliographie 86

  -/- : Déficience d’un gène par recombinaison homologue

Liste des abréviations

Ag Antigène APC : AlloPhycoCyanine Bcl-2-Tg: souris transgénique pour la protéine anti-apoptotique Bcl-2 CD : marqueur de différenciation ( Cluster of Differentiation ) CD25 : IL-2Ra CD44 : molécule liant l’acide hyaluronique afin de médier l’adhésion des leucocytes CD62L : L-sélectine, molécule d’adhésion des leucocytes médiant les interactions vers l’endothélium CFSE : 5, 6-CarboxyFluorescein diacetate Succinimyl Ester CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité TN : thymocyte immature Triple Négatif (TCR - CD3 - CD4 - CD8 - ) DN : thymocyte immature Double Négatif (TCR CD4 - CD8 - ) DP : thymocyte Double Positif (TCR - CD3 + CD4 + et CD8 + ) FITC : Fluorescéine IsoThioCyanate g c : chaîne g commune aux récepteurs des cytokines Hy : antigène mâle    HY : souris RAG-2 -/- TCR-Tg antiHY-CD8 + Ig : Immunoglobuline IL : Interleukine   I.V. : jection de cellules par intraveineuse  in J : jour Ml : souris RAG-2 -/- TCR-Tg antiHY-CD4 +   MATA: souis RAG-2 -/- TCR-Tg antiHY-CD8 + LCMV : Virus de la ChorioMeningite Lymphocytaire NK : cellules Natural Killer pAg-CMH : Complexe peptide antigénique-CMH PBS : Phosphate Buffered Saline P14 : souris RAG-2 -/- TCR-Tg gp33-41 LCMV-CD8 + RAG : gène activateur de recombinaison ( Recombinase Activating Gene ) SP : thymocyte mature Simple Positif (TCR-CD3 + CD4 + ou TCR-CD3 + CD8 + ) SVF : Sérum de Veau Fœtal TCR : récepteur pour l’antigène des cellules T ( T Cell Receptor ) TCR-Tg : souris transgénique pour le récepteur T aux antigènes

Immunité :

Le système immunitaire des vertébrés est composé de deux types d’immunité, l’une est dite innée et l’autre acquise ou adaptative. La réponse immunitaire chez les vertébrés se déroule en deux phases distinctes et complémentaires correspondant aux deux types d’immunité. Tout d’abord la réponse précoce, rapide et peu spécifique de l’immunité innée intervient dans les premières heures de l’infection. L’immunité adaptative plus spécifique, tardive et durable vient compléter cette défense, et constituer la mémoire immunologique [1]

Immunité Adaptative et innée

L’immunité innée constitue la première ligne de défense de l’organisme. La peau, le pH et la kératine constituent la barrière physique et chimique de cette défense [2]. Le complément et les peptides anti-microbiens en sont les molécules, et les acteurs cellulaires sont les cellules lymphoïdes «Natural Killer» ainsi que les cellules myéloïdes macrophagiques, les mastocytes, basophiles, neutrophiles et granulocytes. Les cellules NK possèdent des récepteurs activateurs et inhibiteurs permettant de répondre aux divers motifs protéiques bactériens, viraux ou parasitaires [3]. Elles peuvent également remarquer l’absence de molécules du « soi » du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) de classe I [4]. Ces reconnaissances entre les récepteurs et leurs ligands sont peu spécifiques.

L’immunité adaptative est propre aux vertébrés, plus particulièrement aux mammifères et a été acquise plus tardivement au cours de l’évolution, en même temps que les organes lymphoïdes secondaires [5]. La barrière physique de cette immunité est constituée par les anticorps exportés à la surface des épithéliums ainsi que par les lymphocytes intra-épithéliaux. Les anticorps circulants ainsi que les cytokines effectrices telles que le TNFa et l’IFNg
sont à l’œuvre ; les cellules T, B et Cellules Présentatrices d’Antigènes ou « CPA » en sont les acteurs cellulaires. Les cellules T sont d’origine thymique (T = Thymus) et les cellules B sont générées dans la moelle osseuse (B = Bone marrow). Les Cellules présentatrices d’Antigènes professionnelles sont les cellules dendritiques, qui captent les antigènes, les transportent jusque dans les organes lymphoïdes secondaires et les présentent aux lymphocytes T. Les CPA professionnelles sont représentées par les cellules dendritiques. Cette immunité se caractérise par l’acquisition d’une mémoire spécifique d’antigènes, de haute affinité. Cette immunité acquise permet une protection spécifique à long terme, c’est la mémoire immunologique [1].

Rôle des lymphocytes T

Les lymphocytes T, acteurs principaux de l’immunité acquise, ont pour rôle de protéger l’individu contre toute perturbation liée à l’intrusion de pathogènes dangereux pour celui-ci. Ils permettent de générer et maintenir la mémoire immunologique, spécifique d’antigènes. L’initiation et le développement de l’immunité acquise requièrent la capture des antigènes par les Cellules dendritiques, leur apprêtage puis leur présentation par les molécules du CMH de classe I et II, aux cellules T CD8 et CD4 respectivement.

Les Lymphocytes T ab

Les lymphocytes T présentent à leur surface des récepteurs dits «TCR» = T Cell Receptor, ayant la capacité de reconnaître spécifiquement des motifs peptidiques associés aux molécules du CMH, présentés par les CPA. Il existe deux types de lymphocytes T, les T ab et les T gd. Nous nous intéresserons aux lymphocytes T ab qui constituent la population majoritaire T et les acteurs principaux de l’immunité adaptative. Les lymphocytes T ab , CD4 et CD8

Les lymphocytes T ab de l’immunité adaptative ont été définis en deux sous-populations majeures, en fonction de l’expression de leurs corécepteurs CD4 et CD8, ces deux types de cellules T pouvant être définis par leurs principales fonctions respectives. Schématiquement, les CD4 sont les lymphocytes auxiliaires (helper), et les lymphocytes CD8 cytotoxiques (CTL). Les lymphocytes auxiliaires ont la capacité de s’activer, de générer des cellules mémoires et de faire coopérer entre elles et par elles toutes les cellules de l’immunité acquise. Elles sécrètent de nombreuses cytokines, médiateurs cellulaires permettant une action locale et à courte distance sur les cellules environnantes. Ces lymphocytes jouent un rôle central dans le système de défense adaptatif. Leur absence peut créer de graves dérèglements et immunodéficiences fatales pour l’organisme, comme dans la maladie humaine du SIDA. Les lymphocytes CD8 cytotoxiques ont la capacité de détruire par sécrétion de molécules, telles que la perforine et les granzymes, les cellules ou microorganismes étrangers. Elles génèrent également des cellules mémoires, mais ne produisent que peu de cytokines comparativement aux cellules CD4. Ces deux molécules, CD4 et CD8, sont des corécepteurs essentiels pour les lymphocytes T. La différenciation thymique des lymphocytes T en l’absence de ces molécules est perturbée (), leurs fonctions dans l’activation sont aussi

primordiales. CD4 et CD8 participent dans les événements précoces de transduction du signal après reconnaissance du complexe CMH-peptide par le TCR [6]. Outre ces deux corécepteurs qui jouent un rôle primordial à la fois lors du développement et enfin pendant la réponse immunitaire, une multitude de molécules de co-stimulation interviennent aussi dans l’activation cellulaire T, telles les molécules thy1,1, CD28, CTLA-4, ou des molécules dites accessoires telles CD2, CD45….. D’autre part, la molécule CD3, dont les sous-unités sont associées au TCR, permet de transduire efficacement et finement le signal du récepteur T vers les cascades enzymatiques intracellulaires. Les lymphocytes T ab naïfs, mémoires et activés

Une cellule T naïve est une petite cellule quiescente ; elle exprime faiblement le récepteur aux hyaluronates CD44 [7], fortement la forme de haut poids moléculaire de la phosphatase CD45RB [8] chez la souris et la L-selectine CD62L [7] impliquée dans sa recirculation. Ce récepteur CD62L permet aux lymphocytes naïfs de pénétrer spécifiquement via des cellules épithéliales (High Endothelium Venule) dans les ganglions périphériques, sans avoir été activés. Lors du contact avec l’antigène, la cellule entre dans une phase d’activation et présente de nombreux changements phénotypiques et morphologiques. L’intensité d’expression de CD69 (marqueur d’activation précoce) puis de CD44 est augmentée. L’expression de nombreuses intégrines comme LFA-1 et de L-selectine diminue, tout comme celle de la molécule CD45RB. Une cellule effectrice est une cellule de grande taille en cycle, de phénotype CD44 fort-CD62L faible et qui sécrète des lymphokines ou présente une activité cytotoxique. Une cellule mémoire maintient une forte expression en surface de CD44, qui est considéré comme un marqueur stable des cellules mémoires. Les cellules mémoires seraient en partie en cycle[9], bien que des données contradictoires aient été rapportées [10], plus précisément, les cellules mémoires acquièrent au cours du temps une capacité d’auto renouvellement, et de réponse immunologique plus rapide [11]. Alors que la distinction phénotypique entre une cellule T naïve et une cellule T effectrice mémoire est claire, celle qui différencie une cellule effectrice d’une mémoire est plus difficile. Plus précisément, chez l’homme les cellules T mémoires ont été subdivisées en fonction de l’expression du récepteur aux chémiokines CCR7 et du récepteur CD62l [12]. Les lymphocytes T mémoires humains CCR7-, dits TEM (T Effector Memory), expriment des récepteurs leur permettant de migrer vers les sites d’inflammation. Ces TEM peuvent activer ainsi leurs fonctions effectrices immédiatement. Une autre population de cellules T mémoires CCR7+, dite TCM (T Central Memory) reste dans le circuit lymphatique. Ces TCM n’ont pas de fonctions effectrices immédiates, mais ont la capacité de stimuler les cellules dendritiques et de se différencier en cellules TEM. Ces populations TCM et TEM ont également été retrouvées chez la souris, mais elles ne représentent pas forcément deux populations distinctes, elles feraient partie d’un processus de différenciation linéaire au cours duquel toutes les populations sont représentées [13].

Les cellules mémoires dérivent de précurseurs naïfs, mais les modalités de leur génération restent à définir. Chez la souris, deux hypothèses sont avancées, l’une suppose que la génération des cellules mémoires est linéaire, une cellule mémoire est générée après activation d’un lymphocyte naïf. L’autre privilégie une progression non linéaire, les cellules mémoires pouvant être générées directement à partir d’une cellule naïve ou d’une cellule activée [14].

 

Développement des lymphocytes T:

Le thymus

Organe lymphoïde principal, le thymus est le siège de la production des lymphocytes T pendant toute la vie[15]. Le microenvironnement cellulaire spécialisé du thymus permet le développement des lymphocytes T. Les premières évidences du rôle central du thymus dans la génération des lymphocytes T matures ont été observées grâce à des expériences de thymectomie néo-natale chez la souris [16]. De même, les souris nude présentent un défaut génétique naturel dans la formation thymique, ne permettant pas de générer des lymphocytes T ab fonctionnels [17]. Les précurseurs T Le thymus est colonisé par des progéniteurs dérivant de cellules dites cellules souches. Ces cellules souches, ou CSH, ont été identifiées en 1951 [18] et possèdent plusieurs caractéristiques. Ces cellules sont pluripotentes et donc

capables de générer la plupart des cellules sanguines comme les lignées lymphoïdes, myéloïdes, mégacaryocytaires et érythroïdes. Elles ont également la capacité d’autorenouvellement, permettant de maintenir un niveau stable de production des cellules sanguines au cours de la vie. Le maintien de l’expression de la télomèrase dans les CSH est une des raisons de cette caractéristique d’auto renouvellement [19]. Les cellules colonisant le thymus peuvent être plus ou moins engagées dans la lignée lymphoïde. Les lymphocytes T, B et NK ont d’abord été définis comme provenant d’un Progéniteur Lymphoïde Commun (PLC) [20], mais des données plus récentes remettent en cause ces premières données.

Le PLC a été mis en évidence dans la moelle osseuse de souris, il est pluripotent et restreint aux lymphocytes T, B et NK, comme cela a été démontré in vivo [21] Il reste à définir les événements et les lieux permettant aux PLC de se différencier en lymphocytes T, l’environnement thymique étant favorable à cet engagement [22]. Cependant des études semblent indiquer qu’il est possible de retrouver des pro thymocytes dans le sang fœtal [23] ou dans la rate [24] ainsi que dans les ganglions de souris nude [25], suggérant ainsi que les PLC peuvent se différencier en pro thymocytes en dehors du thymus. Deux lignées lymphocytaires matures T ont été identifiés, les T ab et T gd, caractérisées par l’expression de leur récepteur T (TCR). La lignée ab constitue celle qui nécessite la présentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), alors que quelques gd semblent capables de reconnaissance antigénique en dehors de toute présentation par le CMH [26]

Développement T ab

Du stade Double Négatif au stade Double Positif

Le développement des précurseurs de cellules T ab dans le thymus se déroule en plusieurs étapes identifiables par l’expression de certaines molécules de surface (CD). A chaque stade du développement les cellules T expriment un panel variable de marqueurs de surfaces, permettant l’identification phénotypique de chacune des étapes. Le thymocyte le plus immature n’exprime pas de corécepteur CD4 ou CD8, et est alors identifié comme une cellule double négative (DN). Au stade précédent, la cellule est également négative pour le complexe du corécepteur CD3 et du récepteur TCR, et est appelée triple négative (TN).

 

 

 

 

 

 

 

  Analyse cytométrique et représentation schématique des populations thymiques d’une souris sauvage C57Bl6. Les étapes successives de développement des cellules DN sont représentées par l’acquisition et la disparition séquentielle des marqueurs de surface CD44 et CD25. Quatre étapes sont ainsi identifiées, DN1, 2,3 et 4.

 

 

 

 

Seulement 20% de ces cellules DN se différencient en cellules T gd, alors que le reste s’engage vers la différenciation T ab. Le premier stade DN1 se caractérise par l’expression unique du marqueur CD44. La déficience génétique pour la molécule c-kit ou le scf (stem cell factor) induit une réduction du nombre de cellules DN1 de l’ordre de 40 fois par rapport à un thymus normal [27]. Cette réduction peut être due à un défaut de colonisation thymique, ou de prolifération et de survie des thymocytes[28]. La transition du stade DN1 à DN2 (CD44 CD25) s’accompagne d’une intense prolifération. Les souris invalidées pour l’IL7 ont permis de supposer que cette cytokine est nécessaire et impliquée fortement, à ce stade de développement, dans la régulation de l’expansion thymique[29]. Les souris invalidées pour l’interleukine 7, le récepteur à l’interleukine IL7Ra[30, 31] et le gène du récepteur gc commun aux interleukines[32] présentent des défauts de développement lymphocytaire à ce stade précis. Mais ces anomalies peuvent êtres dues à un défaut de survie et de prolifération des thymocytes. Enfin, quelques lymphocytes Tab peuvent poursuivrent leur développement, alors que celui des gd est totalement abrogé [33]. L’utilisation de souris invalidées (Knock Out) a permis de décrypter les événements de maturation, des DN3 aux lymphocytes pré T. Durant cette transition, les gènes g,
d et b du récepteur T sont réarrangés, et les cellules sont engagées définitivement vers la lignée T. En même temps que le réarrangement productif de la chaîne b est effectué à la surface des lymphocytes, la chaîne pré-Ta est associée au complexe CD3 pour former le pré récepteur T, permettant ainsi la transduction du signal [34]. L’émergence du complexe pré récepteur T donne le signal pour l’expansion rapide et l’expression des corécepteurs CD4 et CD8, et les thymocytes deviennent Double Positifs, DP. La progression vers le stade DP est dépendante de l’activité de deux enzymes responsables du réarrangement des immunoglobulines, RAG1 et RAG2 [35, 36]

 

Du stade Double Positif au stade Simple Positif Les kinases intracellulaires jouent un rôle dans la transduction du signal durant la différenciation des thymocytes DP vers la maturation en simples positifs. Les souris déficientes pour des kinases de la famille des syk et ZAP-70, montrent un blocage de la différenciation des DP, avec absence de cellules matures SP [37]. La chaîne a du récepteur T est exprimée à ce stade de développement. Le réarrangement des chaînes a et b du TCR Le TCR et l’association de ses chaînes a
b sont les récepteurs essentiels qui permettent aux lymphocytes T d’agir spécifiquement contre la multitude et la diversité des pathogènes rencontrés.

La multitude d’antigènes présentés ne peut être contrôlée que par un ensemble de cellules T composé par un grand nombre de clones exprimant chacun un TCR précis. La diversité du répertoire des récepteurs T n’est pas due à un grand nombre de gènes codant pour un TCR, mais à la combinaison de plusieurs segments de gènes.

Les récepteurs T sont composés de deux chaînes protéiques, l’une dite bêta (b) et l’autre alpha (a). Ces deux chaînes sont constituées de parties intra cytoplasmiques permettant la transduction de signaux, de portions extracellulaires constituées de régions Constantes (C), Jonctionnelles (J), Diverses (D) pour la chaîne b, Variables et Hypervariables (V). Ces deux dernières régions variables et hypervariables sont la clé de la spécificité antigénique ou peptidique. Le réarrangement des segments de gène codant pour les chaînes a et b du TCR a lieu au niveau somatique, dans un ordre précis [38]. Les réarrangements du locus du TCRb ont lieu avant celui du TCRa
[39], le TCRb étant réarrangé au stade DN3, et le TCRa au stade DP et SP. Les réactions de recombinaison sont assurées par un complexe enzymatique, le RSS, dont les séquences sont localisées autour des segments de gène V, D et J, codant pour les chaînes a et b du TCR[40]. La réaction est initiée par deux enzymes RAG1 et RAG2 (recombinase activating gene), exclusivement exprimées dans les cellules lymphoïdes. Chez les souris déficientes pour l’expression de RAG1 et RAG2, le développement lymphocytaire est bloqué au stade DN2 [35, 36].

Représentation schématique du développement T :

 

 

 

 

 

 

 

La diversité additionnelle

Aux réarrangements s’ajoutent d’autres phénomènes permettant d’augmenter drastiquement la diversité des TCR dans un individu. En premier, lieu le processus de recombinaison permet de générer une diversité additionnelle ; les étapes de jonction des segments pour les chaînes a et b étant lâches quant à la position exacte de la jonction de recombinaison, elles permettent l’induction de glissement dans la séquence (nucléotides P). Enfin, la jonction parfois indirecte entre les segments et la recombinaison induit l’ajout de nucléotides entre les segments. Ce mécanisme a été défini comme étant la N-addition, dont l’enzyme TdT (Terminal deoxynucleotide Transferase) est responsable. La souris déficiente TdT montre après analyse du répertoire T que cette enzyme contribue à 90 % à la diversité des TCR ab
[41] L’appariement des chaînes a et b contribue aussi à augmenter la diversité du répertoire des TCR. Le domaine hypervariable des chaînes a et b est une région de haute diversité nommée CDR3 (Complementary Determining Region 3), située au niveau des jonctions de gènes [42]. Des études structurales ont permis de montrer que la région CDR3 joue un rôle déterminant dans l’interaction entre le TCR et le complexe formé par les peptides antigéniques et les molécules du CMH [43]. Exclusion allélique Les thymocytes sont sous le contrôle d’un mécanisme qui évite de mettre en place plusieurs réarrangements simultanés des gènes codant pour la chaîne b du TCR, évitant la production de deux chaînes b distinctes à la surface d’une cellule [44]. Cependant, on trouve environ 1% de lymphocytes T exprimant deux chaînes b [45]

L’exclusion allélique est abolie dans les souris déficientes pour des protéines impliquées au niveau du complexe TCR (CD3e, p56lck) ou pour des protéines adaptatrices comme SLP-76. Mais les voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la maturation des lymphocytes T sont distinctes de celles impliquées dans l’exclusion allélique [46].       Inclusion allélique Contrairement à la chaîne b, il est courant de voir exprimées deux chaînes a à la surface d’une cellule [47] [48, 49].

Les lymphocytes T ont les deux allèles de la chaîne a réarrangés et 30% de ceux-ci ont deux réarrangements en phase ouverte de lecture [50]. Ce phénomène est l’inclusion allélique. Mais l’exclusion allélique peut aussi avoir lieu, un thymocyte avec deux réarrangements productifs peut au final n’exprimer qu’une seule chaîne a , la compétition lors de l’association avec la chaîne b et les contraintes structurales jouant ce rôle d’exclusion [51, 52]. Sélection positive et négative Les thymocytes doubles positifs réarrangent activement la chaîne a du TCR et expriment de faibles niveaux d’hétérodimères du TCRab, qui interagissent avec les complexes CMH-peptides présents sur l’épithélium thymique. A ce stade, 90% des cellules meurent par apoptose, en absence de signaux leur permettant de poursuivre leur différenciation [53]. Les thymocytes qui ne peuvent interagir avec les molécules du CMH meurent par négligence. Ceux dont l’interaction avec le CMH est trop forte meurent par sélection négative. Cette sélection négative est essentielle pour le maintien de la tolérance au soi. Ainsi, au cours de la maturation thymique du stade DP TCR low au stade DP TCR high, des lymphocytes T spécifiques de superantigènes exprimés dans le thymus des souris sont tous délétés [54], cette sélection négative ayant pour but d’éviter toute réaction immunitaire contre l’hôte, origine de certaines maladies auto-immunes. La sélection négative est elle aussi fortement régulée par les signaux et molécules liées à l’apoptose. La famille des Bcl-2 joue un rôle central, via Bcl - 2, bax, bad et bim. Toutes ces molécules pro ou anti apoptotiques peuvent induire in vitro et in vivo la mort ou la survie des thymocytes DN, DP et SP.[55-57]. La sélection positive permet de sélectionner les thymocytes capables de reconnaître les molécules du CMH adéquates, et de générer une signalisation intracellulaire adaptée. En périphérie, les lymphocytes T matures sont ainsi capables de reconnaître de façon optimale les molécules du CMH et de l’antigène apprêté [58]. Cette sélection a également été mise en évidence dans des expériences de reconstitution hématopoïétique [59]. Avec ces expériences, il a notamment été démontré que la classe des molécules du CMH à laquelle le TCR est restreint influence le choix de la différenciation des cellules DP en simples positifs CD4 ou CD8. Les souris ZAP-70 et Syk déficientes ont un blocage complet au stade DN3 [60]. La molécule Lck est importante également dans la sélection positive des DP [61]. De plus, la déficience en CD45, une tyrosine phosphatase régulatrice de l’activité des kinases src, montre un arrêt de la différenciation au stade DP [62]. Ces derniers exemples permettent de démontrer le rôle du TCR et surtout des molécules impliquées dans la transduction du signal, au cours de ces sélections thymiques.

Différenciation CD4 ou CD8

La nature du mécanisme incitant les lymphocytes DP à se différencier en CD4 ou en CD8 est encore non établi. Deux modèles ont été proposés : le modèle stochastique (indépendant du lien TCR-CMH) et le modèle instructionniste (dépendant des interactions TCR-CMH). Pour le modèle instructionniste, les parties intra-cytoplasmiques des corécepteurs CD4 et CD8 sont impliquées dans le choix de l’engagement [63] Le modèle stochastique suggère que le choix dans la suppression des gènes codant pour CD4 ou CD8 n’est pas déterminé par la restriction du TCR aux molécules du CMH lors de la sélection positive [64, 65]. Plusieurs cascades moléculaires décrites pour l’engagement et la différenciation de lignées cellulaires dans d’autres systèmes expérimentaux, comme la drosophile ou la xénope, semblent jouer le même rôle dans la différenciation T [66]. Des expériences récentes ont impliqué la cascade des molécules Notch dans la différenciation des lignées T ab et gd, ainsi que la différenciation CD4 et CD8. La molécule TSLP, un facteur thymique dont le récepteur est associé au récepteur a de l’interleukine 7, a également été impliquée dans le développement thymique T, et plus précisément dans la différenciation des CD4 SP [67]. Plus récemment, le facteur de transcription cKrox a été identifié comme acteur important de la différenciation vers la lignée CD4 SP [68] [69]

Export thymique

Le rôle du thymus est, entre autres, d’assurer un niveau constant de lymphocytes T périphériques. Il a été établi que l’export de lymphocytes T thymiques en périphérie permet le remplacement des T naïfs périphériques sans