Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Gwendaline LLEDO pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome le 19 Novembre 2007 Devant le jury suivant: Dr. Thierry DUPRESSOIR - Président Pr. Yves BENYAMIN - Rapporteur Dr. Olivier COUX - Examinateur Dr. Isabelle JARIEL-ENCONTRE - Examinatrice Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN Motilité cellulaire - UMR 5539 Université Montpellier II Place Eugène Bataillon 34095 MONTPELLIER Cedex 05 Laboratoire d'accueil: Directeur: Pr. Paul MANGEAT CNRS-CRBM UMR 5237 Tuteur: Dr. Olivier COUX 1919, route de Mende 34095 MONTPELLIER Cedex 05 ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • interface ubiquitylation

  • procédure générale de la méthode

  • identification de substrats du système ubiquitine

  • méthode permettant la purification

  • purification

  • préparation de l'extrait protéique

  • ubiquitylation des protéines

  • protéasome


Publié le : jeudi 1 novembre 2007
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET
DE LA RECHERCHE

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE
présenté par

Gwendaline LLEDO

pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes

Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines
ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome

le 19 Novembre 2007

Devant le jury suivant:
Dr. Thierry DUPRESSOIR - Président
Pr. Yves BENYAMIN - Rapporteur
Dr. Olivier COUX - Examinateur
Dr. Isabelle JARIEL-ENCONTRE - Examinatrice


Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN
Motilité cellulaire - UMR 5539
Université Montpellier II
Place Eugène Bataillon
34095 MONTPELLIER Cedex 05


Laboratoire d'accueil: Directeur: Pr. Paul MANGEAT
CNRS-CRBM UMR 5237 Tuteur: Dr. Olivier COUX
1919, route de Mende
34095 MONTPELLIER Cedex 05

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

EPHE Banque de Monographies SVT 1Gwendaline LLEDO

Etude du système Ubiquitine / Protéasome : identification des protéines
ubiquitylées et analyse des mécanismes de dégradation par le protéasome


RESUME

La dégradation régulée des protéines intracellulaires joue un rôle essentiel dans la plupart des
processus biologiques, notamment dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires,
dans la réponse appropriée aux stimuli extracellulaires, ainsi que dans l'élaboration de la réponse
immunitaire anti-cancéreuse et anti-virale. Chez les eucaryotes, la protéolyse intracellulaire est assurée en
grande partie par un système multi-enzymatique, appelé le système Ubiquitine / Protéasome. Ce système
implique des centaines de composants, qui permettent la reconnaissance et le marquage des protéines à
dégrader, puis leur dégradation par le protéasome 26S.
L'objectif de l'équipe est d'essayer de mieux comprendre les mécanismes des différentes étapes de la
dégradation des protéines par ce système multi-enzymatique. Au cours de mon stage, je me suis intéressée,
dans un premier temps, au développement d’une méthode permettant la purification et l’analyse quantitative
des protéines ubiquitylées, et dans un deuxième temps, à l’identification par fractionnement biochimique
d'extraits cellulaires, de facteurs stimulant la dégradation par le protéasome 26S de la protéine p53 poly-
ubiquitylée. Mon travail a consisté à mettre au point les procédures nécessaires à ces deux approches
expérimentales, et à entreprendre la recherche de cofacteurs du protéasome 26S par fractionnement de lysat
de réticulocytes. Ce travail a abouti à la purification d’une fraction protéique capable de stimuler le
protéasome 26S, dont la caractérisation est actuellement en cours au laboratoire.

Mots clés: ubiquitylation, dégradation, protéasome.

SOMMAIRE




LISTE DES ABREVIATIONS......................................................................................................................1

INTRODUCTION..........................................................................................................................................3

I / Généralités sur le système Ubiquitine / Protéasome 5
I.1 / Historique de la découverte du système UbPr 5
I.2 / Généralités sur les grandes fonctions du système Ubiquitine / Protéasome 7
EPHE Banque de Monographies SVT 2I.3 / Présentation générale du système UbPr 8

II / L’ubiquitylation des protéines 10
II.1 / L'ubiquitine et les différents types d'ubiquitylation 10
II.1.1 / 10
II.1.2 / Les différents types d'ubiquitylation 11
II.2 / La cascade enzymatique ou ubiquitylation 12
II.3 / Spécificité du système ubiquitine / protéasome : les E3s 14
II.4 / Le devenir des substrats ubiquitylés 14
II.4.1 / Les protéines à UBD 15
II.4.2 / Réversibilité de la réaction d’ubiquitylation : la déubiquitylation 15

III / Structure et fonctions des protéasomes 16
III.1 / Le protéasome 20S 17
III.2 / Les régulateurs de l’activité du protéasome 20S 19
III.2.1 / Le complexe régulateur 19S ou PA700 19
III.2.2 / L’activateur 11S ou PA28 20
III.3 / Le protéasome 26S 21
III.3.1 / Reconnaissance du substrat ubiquitylé par le complexe 19S 22
III.3.2 / Mécanismes de la dégradation 23
a) Dépliement du substrat 23
b) Accès du substrat aux sites actifs du corps catalytique 24
c) Translocation du substrat à l’intérieur du corps catalytique 25
d) Dégradation processive 25
III.3.3 / Recyclage de l’ubiquitine et déubiquitylation 25

IV / Intérêts de la recherche sur la voie protéolytique dépendante du système UbPr:
pathologies et perspectives thérapeutiques 26

SITUATION ET OBJECTIFS DU PROJET……………………………………………………………..29

Projet 1 : Ubiquitylome: purification et identification de substrats du système Ubiquitine /Protéasome
I.1 / Contexte scientifique et approche expérimentale 29
I.2 / Plan de travail 30

Projet 2: Interface Ubiquitylation / Dégradation: étude de la dégradation de la protéine p53
ubiquitylée par le protéasome 26S purifié
II.1 / Contexte scientifique et approche expérimentale 31
II.2 / Plan de travail 31

EPHE Banque de Monographies SVT 3MATERIELS ET METHODES……………………………………………………………………………33

I / Etude biochimique des protéines 33
I.1 / Production de protéines recombinantes à partir d’un système procaryote (E.coli) 33
I.1.1 / Transformation bactérienne 33
I.1.2 / Expression analytique des protéines d’intérêts 34
I.2 / Préparation d’extraits protéiques 34
I.3 / Purification des protéines exprimées 34
I.3.1 / Principe général des chromatographies sur colonne 35
I.3.2 / Purification par affinité de protéines de fusion 36
a) de protéines recombinantes étiquetées GST 36
b) Purification de Histidine 36
I.3.3 / Différentes chromatographies utilisées sur un système FPLC 37
I.4 / Synthèse protéique par traduction in vitro 37
I.5 / Analyse 38
I.5.1 / Détermination de la concentration protéique par la méthode de Bradford 38
I.5.2 / Electrophorèse en gel de polyacrylamide 38
a) Gel dénaturant en présence de SDS (gel SDS-PAGE) 38
b) Gel non dénaturant 40
I.6 / Détection des protéines 40
I.6.1 / Coloration au bleu de Coomassie Colloïdal 40
I.6.2 / à l’argent 41
I.6.3 / Détection de protéines radiomarquées 41
I.6.4 / Technique d’immunodétection : le western blot 41

II / Purification d’enzymes d’ubiquitylation 42
II.1 / L’enzyme E1 42
II.1.1 / Chromatographie par échange d'anions 42
II.1.2 / sur colonne d'affinité (colonne d’ubiquitine) 43
II.2 / Les enzymes E2s 43

III / Ubiquitylation des protéines et purification de conjugués 44
III.1 / in vitro de la protéine p53 44
III.2 / Ubiquitylation in vitro de la cycline B 44
III.3 / Purification de la cycline B poly-ubiquitylée 45

IV / Purification et test d’activité du Protéasome 26S 46
IV.1 / du protéasome 26S 46
IV.2 / Mesure de l’activité protéolytique du protéasome 47
EPHE Banque de Monographies SVT 4
V / Préparation d’extraits protéiques totaux à partir d’ovocytes de Xénope 47
V.1 / de la ponte de Xénope 47
V.2 / Préparation des extraits en arrêt CSF 48
V.3 / Vérification des extraits CSF 49

RESULTATS ET DISCUSSIONS…………………………………………………………………………50

Projet 1 : Ubiquitylome: purification et identification de substrats du système Ubiquitine/Protéasome

I / Principe et méthodes utilisées 50

II / Préparation des outils 51
II.1 / Le système des extraits d’ovocytes de Xénope 51
II.2 / Production des protéines recombinantes 53
II.3 / Ubiquitylation in vitro de la cycline B 54

III / Résultats 55
III.1 / Purification des formes ubiquitylées de la cycline B en conditions dénaturantes 55
III.2 / Déubiquitylation des formes ubiquitylées purifiées de la cycline B 56

IV / Discussion & Perspectives 59

Projet 2 : Interface Ubiquitylation / Dégradation: étude de la dégradation de la protéine p53
ubiquitylée par le protéasome 26S purifié

I / Procédure générale de la méthode 61
I.1 / Exploration des étapes « post-ubiquitylation » de la dégradation des protéines 61
I.2 / Contexte scientifique 62
II / Approche expérimentale 63
II.1. / Ubiquitylation in vitro de la protéine p53 63
II.2 / Recherche de cofacteurs du protéasome 64
a) La précipitation au TCA 64
b) Analyse électrophorétique sur gel SDS-PAGE 64
c) En gel natif 64

III / Résultats 65
III.1 / Dégradation de p53 ubiquitylée dans différents extraits protéiques totaux 65
III.2 / Le fractionnement cellulaire 69

EPHE Banque de Monographies SVT 5IV / Conclusions & Perspectives 73

CONCLUSION GENERALE……………………………………………………………………………....76

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………………………………………….78

ANNEXES…………………………………………………………………………………………………...89
ANNEXE 1 : Les sous-unités des sous-complexes constitutifs et inductibles et leurs fonctions 89 2 : L’enzyme E1 : préparation du lysat cellulaire 90
ANNEXE 3 : Préparation d’une colonne d’affinité covalente d’ubiquitine pour la purification de E1 91
























LISTE DES ABREVIATIONS




Å Angström
ADN Acide Désoxyribo-Nucléique
APS Ammonium Persulfate
ARN Acide Ribo-Nucléique
ATP Adénosine Tri-Phosphate
BSA Bovin Serum Albumin
CSF CytoStatic Factor
EPHE Banque de Monographies SVT 6DEAE DiEthylAminoEthyl
DTT Dithiotheitol
DUB DeUbiquitylating Enzyme
ECL EnhancerChimioLuminescence
FPLC Fast Performance Liquid Chomatographie
GST Glutathione-S-Transferase
h heure
His Histidine
IPTG IsoPropylThio-b-D-Galactoside
kDa kiloDalton
LB Luria Broth
M molaire
min minute
mM milli-molaire
PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
PBS Phosphate Buffered Salin
P Protéasome
Rpn Regulatory protein non-ATPase
rpm rotation par minute
Rpt Regulatory protein ATPase
SCF Skp1 Cul1 F-box
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
TEMED N,N,N’,N’-tétraméthylènediamine
TNF Tumor Necrosis Factor
Ub Ubiquitine
Ubal Aldéhyde
UBD Ubiquitin Binding Domain
UBL -Like Domain
UbPr Ubiquitine – Protéasome
Ub° Ubiquitylation
WB Western Blot
wt wild type
∆ délétion










EPHE Banque de Monographies SVT 7



























INTRODUCTION



Avant-propos


Chaque cellule est un système complexe devant maintenir son homéostasie en remodelant en
permanence son protéome, de manière à s'adapter à son environnement en produisant de nouvelles
protéines et en renouvelant ou en éliminant les protéines obsolètes ou défectueuses. La protéolyse
intracellulaire est une composante essentielle de plusieurs aspects de l’homéostasie cellulaire. Elle
participe entre autres au ménage cellulaire (en éliminant les protéines anormales), à
l’approvisionnement en acides aminés nécessaires à la synthèse de nouvelles protéines, au contrôle du
métabolisme, à la maturation de précurseurs polypeptidiques, à la réponse immunitaire en produisant
les peptides présentés à la surface des cellules par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe
I, et intervient également dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire programmée. Un aspect
important de la protéolyse intracellulaire est qu'elle participe au contrôle de l'expression des gènes, au
même titre que la synthèse protéique, en contribuant à déterminer les fenêtres d'expression des
protéines cellulaires.

EPHE Banque de Monographies SVT 8 Le système protéolytique Ubiquitine / Protéasome (UbPr) joue un rôle critique dans cette
dernière fonction de la protéolyse. Découvert dans les années 80, ce système protéolytique est
maintenant reconnu comme l'une des voies majeures de protéolyse intracellulaire, du fait de son
implication dans la plupart des processus cellulaires. En effet, le système Ubiquitine / Protéasome
joue un rôle essentiel dans les cellules en assurant notamment la dégradation régulée des protéines qui
permet le changement rapide et spécifique du niveau des nombreuses protéines contrôlant les
différents processus cellulaires. Ce rôle est particulièrement clair dans la régulation de la prolifération
cellulaire. En effet, la plupart des étapes de la division des cellules sont contrôlées en grande partie
par des changements rapides et régulés de la stabilité de protéines qui gouvernent l'entrée, la
progression ou la sortie de ces étapes.
Le système Ubiquitine / Protéasome a par conséquent un rôle fondamental dans la vie et
la mort de la cellule et des organismes pluricellulaires. Il est donc important d’en connaître
précisément la régulation, d’identifier les facteurs impliqués dans son fonctionnement, et de
comprendre les mécanismes de sa spécificité et son efficacité. Cette problématique constitue
l'axe de recherche de l'équipe du Dr Olivier Coux, dans laquelle j'ai effectué mon stage EPHE.




















EPHE Banque de Monographies SVT 9


I / Généralités sur le système Ubiquitine / Protéasome :



I.1 / Historique de la découverte du système UbPr:

Il est établi depuis longtemps que la demi-vie des protéines cellulaires est extrêmement
variable, se comptant en minutes pour certaines et en jours, voire en semaines, pour d'autres. Les
protéines régulatrices ou les enzymes limitantes de certaines voies métaboliques sont souvent très
instables, que ce soit de manière constitutive ou de manière régulée, ce qui permet de contrôler
étroitement, et éventuellement de modifier rapidement, leurs niveaux intracellulaires. De la même
façon, les protéines anormales, résultant de défauts de synthèse ou de modifications perturbant leur
fonctionnement, sont aussi éliminées rapidement du fait de leur toxicité potentielle. A l'inverse,
d'autres protéines (en général des protéines dites "de ménage") sont nécessaires aux cellules sur de
longues périodes et sont beaucoup plus stables. Puisque les concentrations intracellulaires des
protéines sont déterminées par le rapport de leurs taux de synthèse et de dégradation, l'adéquation de
ces concentrations aux besoins des cellules nécessite que la synthèse et la dégradation de chaque
protéine soient contrôlées de manière précise. Cela explique que la protéolyse fonctionne souvent de
manière extrêmement spécifique et que l'étude des mécanismes de cette spécificité ait suscité un
intérêt croissant ces dernières années.


A ce jour, les lysosomes, les calpaïnes, les caspases et le système UbPr constituent les quatre
grands « systèmes » protéolytiques intracellulaires.
Le système Ubiquitine / Protéasome (UbPr) est un système multienzymatique très sophistiqué, dont
il est admis qu’il assure une part très importante de la protéolyse intracellulaire chez les eucaryotes.
C’est un système qui utilise (i) l'ubiquitine (Ub) pour marquer les protéines à dégrader et (ii) un
complexe multiprotéique appelé le protéasome comme enzyme protéolytique.
Jusqu'à la fin des années 70, le système majeur protéolytique intracellulaire connu était la voie
lysosomale, considérée alors comme étant une voie passive ne nécessitant pas de dépense d'énergie
de la part de la cellule. Mais en 1977, un nouveau système de protéolyse non lysosomal et
consommant de l'ATP a été observé dans des lysats de réticulocytes (Etlinger & Goldberg, 1977).
Reprenant ces expériences en 1978, Aaron Ciechanover et Avram Hershko ont fractionné ces extraits,
et ont isolé un des composants qui était nécessaire à l'activité protéolytique dépendante de l'ATP. Ils
l'ont appelé APF-1 pour ATP-dependant Proteolysis Factor 1, qui s'est avéré par la suite correspondre
à l'ubiquitine, un polypeptide très conservé de 76 acides aminés (Ciechanover et al., 1978). Avec
Irwin Rose, ils ont ensuite montré que (i) cette petite protéine de 8,5 kDa pouvait être conjuguée de
EPHE Banque de Monographies SVT 10

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