FACULTÉ DE PHARMACIE DE GRENOBLE

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Niveau: Supérieur

  • mémoire


UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER FACULTÉ DE PHARMACIE DE GRENOBLE Année : 2010 N° Caractérisation épigénétique du lymphome du manteau MÉMOIRE DU DIPLÔME D'ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE MÉDICALE Conformément aux dispositions règlementaires du décret n°90-810 du 10 septembre 1990, tient lieu de thèse THÈSE PRÉSENTÉE POUR L'OBTENTION DU DIPLÔME D'ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE CHAUVELIER épouse GROUILLER Stéphanie Née le 24 avril 1981 à LAVAL (Mayenne) THÈSE SOUTENUE PUBLIQUEMENT A LA FACULTÉ DE PHARMACIE DE GRENOBLE Le 4 juin 2010 DEVANT LE JURY COMPOSÉ DE Pr Emmanuel DROUET Président de Jury Dr Mary CALLANAN Directrice de Thèse Dr Blandine FABRE-BOCQUENTIN Dr Rémy GRESSIN Pr Dominique LEROUX du m as -0 05 92 39 8, v er sio n 1 - 1 2 M ay 2 01 1

  • conformément aux dispositions règlementaires du décret n°90

  • thèse soutenue

  • caractérisation épigénétique du lymphome du manteau


Publié le : mardi 29 mai 2012
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UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER
FACULTÉ DE PHARMACIE DE GRENOBLE

Année : 2010 N°


Caractérisation épigénétique du lymphome du manteau


MÉMOIRE
DU DIPLÔME D’ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE MÉDICALE
Conformément aux dispositions règlementaires du décret n°90-810 du 10 septembre 1990, tient lieu de thèse
THÈSE PRÉSENTÉE POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME D’ÉTAT DE
DOCTEUR EN PHARMACIE

CHAUVELIER épouse GROUILLER Stéphanie
Née le 24 avril 1981 à LAVAL (Mayenne)

THÈSE SOUTENUE PUBLIQUEMENT A LA FACULTÉ DE PHARMACIE DE GRENOBLE
Le 4 juin 2010

DEVANT LE JURY COMPOSÉ DE
Pr Emmanuel DROUET Président de Jury
Dr Mary CALLANAN Directrice de Thèse
Dr Blandine FABRE-BOCQUENTIN
Dr Rémy GRESSIN
Pr Dominique LEROUX
dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011Remerciements

Je souhaite remercier tout d’abord le Professeur Emmanuel Drouet pour avoir accepté la
présidence de mon jury de thèse.
Egalement un merci tout particulier à Mary Callanan pour m’avoir proposé ce sujet
passionnant et pour son soutien jour après jour.
Vraiment un grand merci au Pr Dominique Leroux, au Dr Rémy Gressin et au Dr Blandine
Fabre-Bocquentin d’avoir accepté de participer à mon jury de thèse et pour leur soutien au
cours de ce projet et de mon internat.
Occasion particulière pour moi de remercier Martine Chauvet pour son aide et son soutien si
précieux qui m’ont beaucoup apporté au cours de ce projet, ainsi que Christine Lefebvre
pour ses conseils, son aide, son soutien jour après jour qui m’ont été et me sont
indispensables.
Un grand merci à Juliana, Alexandra, Anne et Alicia pour leurs conseils, leurs formations
techniques et pour les bons moments passés ensemble.
Sincères remerciements à Sam, Sième, Aurélie, Céline, Laëtitia, Jean Jacques, Isabelle, Sarah
pour leur aide technique, leur patience et leur gentillesse.
Remerciements à Catherine B., Catherine C., Julien, Laure, Mélanie et Pauline pour ses
années de fac à Angers que je n’oublierai jamais…
Evidemment je n’oublie pas tous mes co-internes (Lauren, Géraldine, Yolande, Marion,
Antoine et tous les petits jeunes…) avec qui j’ai partagé tant de bons moments et que je
n’oublierais jamais. Merci à vous tous.
Merci à l’ensemble des biologistes, des techniciens, des aides de laboratoire, des secrétaires
des différents services où je suis passée pour leur accueil et pour m’avoir appris mon métier.
Encouragements et soutiens indispensables depuis toujours, je remercie mes grands-
parents, mes oncles et tantes, mes cousins et cousines pour tous les moments de bonheur
que l’on a partagé et que l’on continuera à partager.
Réconfortantes, relaxantes, merci Veela pour nos séances de ronronthérapie !
Clin d’œil particulier à ma gégé qui me soutient, m’encourage, éclaire mes coups de blues
depuis presque 15 ans. Merci pour tout.
Incontournablement, un merci particulier pour mes parents et mes deux petites sœurs
chéries qui m’ont toujours encouragé et soutenu au cours de ses longues années. Sans vous
je n’en serais pas là aujourd’hui, alors juste pour cela merci.
Enfin, Frédéric, mon petit mari que j’aime tant. Qu’aurais fais je sans toi? Merci pour ton
soutien et ton aide au cours de ces longs et nombreux nycthémères. Tu as eu le courage de
supporter mes sauts d’humeur, mes énervements répétés sur mon ordinateur, de jouer tout
seul à Mario Kart (du coup j’ai pas mal de retard à rattraper !). Merci de partager ta vie avec
moi. Je suis heureuse et fière d’être ta femme.


dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011SOMMAIRE

Index des abréviations
Introduction ....................................................................................................... 1
1. L’épigénome .................................................................................................................... 2
a. Définition ..................................................................................................................... 2
b. L’organisation de la chromatine, support de l’information épigénétique .................. 2
c. Epigénome et modifications chimiques ...................................................................... 7
d. L’hétérochromatine et le contrôle de l’expression génique ..................................... 16
e. Épigénétique et cancer .............................................................................................. 19
2. Physiologie de la maturation des lymphocytes B ......................................................... 22
a. La lymphopoïèse B médullaire : phase indépendante des antigènes étrangers ...... 23
b. Les cellules B transitionnelles .................................................................................... 30
c. Maturation antigène dépendante des lymphocytes B dans les follicules
lymphoïdes ........................................................................................................................ 32
d. La différenciation plasmocytaire ............................................................................... 40
e. Épigénome et lymphomagenèse ............................................................................... 41
3. Le lymphome à cellules du manteau (MCL) .................................................................. 45
a. Eléments du diagnostic du lymphome du manteau .................................................. 45
b. Physiopathologie des lymphomes du manteau ........................................................ 55
c. Épigénome et lymphome du manteau ...................................................................... 64
But et objectifs du projet ................................................................................. 66
Matériels et méthodes ..................................................................................... 67
1. Cellules et échantillons de patients .............................................................................. 67
a. Lignées cellulaires et conditions de culture .............................................................. 67
b. Lymphocytes B normaux ........................................................................................... 68
c. Sélection d’échantillons de patients présentant un MCL ......................................... 68
2. Profils épigénétiques des lymphomes du manteau ...................................................... 70
a. Immunohistochimie (IHC) sur tissus en paraffine ..................................................... 71
b. État de méthylation et d’acétylation des histones H3 et H4 en Western-blot ......... 71
c. Technique d’immunofluorescence sur cellules fixées ............................................... 73


dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011d. Immunoprécipitation de chromatine native (ChIP) sur lignées cellulaires ............... 73
3. Étude des mécanismes épigénétiques dérégulés dans le MCL ..................................... 75
a. Extraction, purification et qualification des acides nucléiques ................................. 75
b. Analyses en PCR quantitative (Q-PCR) ...................................................................... 76
c. Analyses du point de cassure de la t(11;14) et du statut mutationnel en PCR ......... 77
Résultats .......................................................................................................... 79
1. Quantification et organisation de marques épigénétiques dans des lignées de
lymphomes ............................................................................................................................ 79
2. Profil épigénétique de cellules primaires de lymphome du manteau .......................... 81
a. Profil physiologique des marques d’hétérochromatine au cours de la maturation B
antigène dépendante ........................................................................................................ 81
b. Modifications post-traductionnelles des histones H4 dans les lymphomes du
manteau ............................................................................................................................. 85
c. Méthylation des lysines de l’histone H3 dans les lymphomes du manteau ............. 86
d. Patrons des isoformes d’HP1 dans les lymphomes du manteau .............................. 87
e. Un ou des profils épigénétiques dans le lymphome du manteau ? .......................... 89
3. Expression de gènes modificateurs de la méthylation de lysines des histones
H3 et H4 ................................................................................................................................ 91
a. Variations physiologiques .......................................................................................... 91
b. Dérégulation de l’expression des histones méthyltransférases dans les MCL ......... 92
c. Corrélation de l’expression de Suv4-20h1 avec le statut MTC.................................. 95
Discussion ........................................................................................................ 98
Perspectives ................................................................................................... 102
Conclusion ...................................................................................................... 104
Bibliographie
Annexes
Serment des Apothicaires
Résumé


dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011INDEX DES ABRÉVIATIONS

Ac : acétylation H4 : histone H4
ADN : acide désoxyribonucléique H4K20 : lysine 20 de l’histone H4
ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated HAT : histone acétyltransférase
ATP : adénosine triphosphate HDAC : histone désacétylase
ARN : acide ribonucléique HMT : histone méthyltransférase
ARN : ARN interférant Hs : Homo sapiens i
ChIP : immunoprécipitation de la Ig : immunoglobuline
chromatine
IGH : chaine lourde d’immunoglobuline
CGH : Comparative Genomic Hybridization
IGκ : chaine légère kappa
DNMT : DNA méthyltransférase
IGL : chaine légère d’immunoglobuline
DLBCL : lymphome B diffus à grandes
IGλ : chaine légère lambda
cellules
IHC : immunohistochimie
FISH : Fluorescence in situ hybridization
LLC : leucémie lymphoïde chronique FL : lymphome folliculaire
LNH : lymphome non Hodgkinien
H2A : histone H2A
MCL : lymphome à cellules du manteau
H2B : histone H2B
Me : méthylation
H3 : histone H3
MTC : major translocation cluster
H3K4 : lysine 4 de l’histone H3
P : phosphorylation
H3K9 : lysine 9 de l’histone H3
pb : paires de bases
H3K27 : lysine 27 de l’histone H3
PHD : plant homeodomain
H3K36 : lysine 36 de l’histone H3
RT – Q – PCR : Reverse Transcription –
H3K79 : lysine 79 de l’histone H3
Quantitative – Polymerase Chain Reaction

WB : Western-blot


dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011INTRODUCTION

Les lymphomes à cellules du manteau (MCL) sont des lymphomes B diffus à petites cellules
particuliers de par leur pronostic sombre et leur évolution rapide (la maladie est
actuellement incurable avec une médiane de survie de 3-4 ans). Bien que décrits dans la
classification 2008 de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme une entité clinico-
biologique homogène, les malades ont des évolutions très différentes, certains succombant
de la maladie en quelques mois d’autres restant en vie au-delà de 7 ans. La recherche de
facteurs prédictifs de réponse aux traitements, de facteurs pronostics de survie et la
découverte de thérapies ciblées sont les objectifs pour améliorer le devenir des patients
atteints d’un lymphome du manteau.
De nombreuses études ont étayé le rôle important d’anomalies épigénétiques dans
l’initiation et la progression des cancers. Dans les lymphomes, ces études portent
essentiellement sur la méthylation de l’ADN, celles concernant la méthylation des histones
restent rares. Contrairement aux anomalies génétiques, les anomalies épigénétiques sont
réversibles et représentent donc de nouvelles cibles thérapeutiques très intéressantes dans
les cancers. Ces thérapies dites « épigénétiques » sont déjà bien développées puisqu’au
®stade d’essais cliniques de phases I et II : le Vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid),
inhibiteur d’histones déacétylases, dans le traitement des lymphomes T cutanés ou encore
®des lymphomes B diffus à grandes cellules ; le Vidaza (azacitidine) inhibiteur de DNA
méthyltransférases, dans les syndromes myélodysplasiques.
Dans ce contexte, notre laboratoire développe un projet de recherche visant à comprendre
le rôle de l’hétérochromatine constitutive et de la répression génique au cours de la
lymphomagenèse. L’intégration du lymphome du manteau dans un contexte épigénétique
semble importante à l’heure actuelle pour améliorer la compréhension de son origine, des
mécanismes mis en jeu et des solutions thérapeutiques à apporter. Dans ce cadre,
l’introduction de ce mémoire vise à montrer comment l’épigénome peut être impliqué dans
la régulation de processus physiologiques au cours de la lymphopoïèse et des mécanismes
altérés dans les cancers en s’appuyant sur l’exemple du lymphome du manteau. Dans une
première partie nous aborderons les notions fondamentales et les grands concepts de
l’épigénome. Ensuite, la physiopathologie de la lymphopoïèse B et des lymphomes seront
présentés. Enfin, nous définirons et exposerons les caractéristiques du lymphome du
manteau.
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dumas-00592398, version 1 - 12 May 2011

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