METALLOPROTEINASES MATRICIELLES ET LEURS INHIBITEURS ENDOGENES DANS DES ATTEINTES NEURO-INFLAMMATOIRES : EFFET DE L'INTERFERON BETA SUR LEUR EXPRESSION

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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Aurélie CHALON Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes METALLOPROTEINASES MATRICIELLES ET LEURS INHIBITEURS ENDOGENES DANS DES ATTEINTES NEURO-INFLAMMATOIRES : EFFET DE L'INTERFERON BETA SUR LEUR EXPRESSION Soutenu le 5 Février 2003 devant le jury suivant : Pr. Cordier G. Président Pr. Exbrayat JM. Rapporteur Pr. Confavreux C. Examinateur Dr. Khrestchatisky M. Examinateur Dr. Giraudon P. Examinateur Laboratoire de stage : INSERM unité U433 Neurobiologie Expérimentale et Physiopathologie Faculté Laennec 8, rue Guillaume Paradin 69372 LYON Cedex 8 Directeur de laboratoire : Dr MF Belin Responsable de stage : Dr P Giraudon e-mail : Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des vertébrés Faculté Catholique de LYON 25, rue du Plat 69288 LYON Cedex 2 Responsable : Pr JM Exbrayat e-mail : ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre METALLOPROTEINASES MATRICIELLES ET LEURS INHIBITEURS ENDOGENES DANS DES ATTEINTES NEURO-INFLAMMATOIRES : EFFET DE L'INTERFERON BETA SUR LEUR EXPRESSION Aurélie CHALON 5 Février 2003 EPHE Banque de Monographies SVT 1

activation protein

molécules inflammatoires

astrocytes

substance grise en association étroite avec les corps cellulaires des neurones

fibrillaire acide

neurone

substance blanche

cellules gliales

Sujets

Sclérose en plaques

Chalon

Institut national de la santé et de la recherche médicale

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Publié par	profil-nechor-2012
Publié le	01 février 2003
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Langue	Français

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Aurélie CHALON Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes METALLOPROTEINASES MATRICIELLES ET LEURS INHIBITEURS ENDOGENES DANS DES ATTEINTES NEURO-INFLAMMATOIRES : EFFET DE L’INTERFERON BETA SUR LEUR EXPRESSION Soutenu le 5 Février 2003 devant le jury suivant : Pr. Cordier G. Président Pr. Exbrayat JM. Rapporteur ExaminateurPr. Confavreux C. Dr. Khrestchatisky M. Examinateur Gi audon P. aminateur Dr. r Ex Laboratoire de stage : INSERM unité U433 Neurobiologie Expérimentale et Physiopathologie Faculté Laennec 8, rue Guillaume Paradin 69372 LYON Cedex 8 Directeur de laboratoire : Dr MF Belin Responsable de stage : Dr P Giraudon e-mail : giraudon@lyon.inserm.fr Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des vertébrés Faculté Catholique de LYON 25, rue du Plat 69288 LYON Cedex 2 Responsable : Pr JM Exbrayat e-mail : jmexbrayat@univ-catholyon.fr ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre METALLOPROTEINASES MATRICIELLES ET LEURS INHIBITEURS ENDOGENES DANS DES ATTEINTES NEURO-INFLAMMATOIRES : EFFET DE L’INTERFERON BETA SUR LEUR EXPRESSION Aurélie CHALON 5 Février 2003

RESUME Dans des pathologies neuro-inflammatoires telles que la sclérose en plaques (SEP) ou la myélopathie associée à l’infection par HTLV-1 (TSP/HAM), des lymphocytes T sont anormalement activés en réponse à une altération de la réponse immune. Résistants à l'apoptose et infiltrés dans le système nerveux central (SNC), ces lymphocytes T joueraient un rôle important dans le développement des lésions caractérisées par une destruction de la myéline et une perte axonale. Un des mécanismes supposés est un effet “bystander via la libération par ces lymphocytes T infiltrés de molécules inflammatoires. Certaines d'entre elles, les cytokines et les métalloprotéinases (MMPs) sont suspectées de favoriser une amplification du processus inflammatoire par l’activation des cellules résidentes, en particulier des astrocytes. Par ce biais, elles seraient impliquées dans la mort des oligodendrocytes et de leurs progéniteurs. Ainsi, les MMPs sont suspectées de participer activement à la physiopathogenèse d’atteintes neuro-inflammatoires. Prenant en compte cette hypothèse, nous avons évalué les taux de sécrétion des MMPs et de leurs inhibiteurs endogènes, les TIMPs, dans des conditions inflammatoires. Pour ces analyses, nous avons mis au point la zymographie permettant de détecter l'activité gélatinolytique de MMP-9 et MMP 2 et optimisé l’utilisation des dosages ELISA de MMP 9, MMP-3, TIMP-1 et TIMP-2. La présence de MMP-9 et de TIMP-1 a été évaluée dans le LCR et le plasma de patients atteints de SEP ou de TSP/HAM. Nous montrons que le taux de MMP-9 est élevé dans ces atteintes inflammatoires. De ce fait, MMP-9 pourrait être un bio marqueur de l’inflammation. Le taux de TIMP-1, inhibiteur de MMPs et facteur de croissance hématopoïétique, est augmenté en fonction de la charge virale dans le plasma de patients infectés par HTLV 1. L’évaluation de TIMP-1 pourrait permettre, chez ces patients, un suivi de la prolifération lymphocytaire induite par l’infection virale. L’effet de traitement anti-inflammatoire visant à moduler l’expression de ces protéases a été recherché. Les sécrétions des MMPs et TIMPs ont été analysées : 1) gliale dans lequel des astrocytes humains en culture sont traités simultanémentdans un modèle d'inflammation par une cytokine pro-inflammatoire, le TNF-a, inducteur de MMPs et TIMPs, et par une cytokine anti-inflammatoire : IL-4, IL-10 ou IFN-b. Nous montrons que les sécrétions astrocytaires de MMP-9 et de MMP-3, augmentées dans un contexte pro-inflammatoire, sont réduites par les cytokines anti-inflammatoires. L’expression de TIMP 1 est amplifiée par ce traitement. Un traitement anti inflammatoire permet donc de rétablir la balance protéase/inhibiteur. 2) dans des sérums de patients atteints de SEP traités pendant un an par l’IFN-b1a Rebif®, puisque des travaux de la littérature ont rapporté que l’IFN-b module le rapport TIMP-1/MMP-9 sérique, modulation associée à une amélioration des patients (IRM). Les taux sériques de MMP-9 et de TIMP-1 chez les patients atteints de SEP traités par l’IFN-b ont été corrélés aux données cliniques : nous n’avons pas pu établir de lien entre le rapport TIMP-1/MMP-9 et le devenir clinique des patients (amélioration ou détérioration de l’état clinique, survenue de poussée). Cependant, nous montrons qu’une diminution du rapport TIMP-1/MMP-9 est notable chez des patients développant des anticorps neutralisant l’activité de l’IFN-b. Nous émettons l’hypothèse que la mesure de ce rapport pourrait nous renseigner sur l’activité biologique de l’IFN-b en périphérie, donc de définir les patients “non-répondeurs au traitement par l’IFN b et d’ajuster leur traitement. MOTS CLES: en Plaques - Métalloprotéinase - Inhibiteur de Inflammation TSP/HAM ScléroseSystème nerveux central métalloprotéinases cytokines Table des matières ABRÉVIATIONS 2 INTRODUCTION ET OBJECTIFS 4 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 7 I Le système nerveux central 8 I. 1 Les cellules constitutives du SNC 8 I. 1. 1 Les neurones 8 I. 1. 2 8Les cellules gliales I. 2 Les barrières isolant le SNC du reste de l’organisme 9 I. 3 Communications entre le SNC et le système immunitaire 10 I. 3. 1 Le passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) 10 II Le système immunitaire 11 II. 1 Les médiateurs de l’immunité : les cytokines 12 II. 1. 1 Historique 12 II. 1. 2 Définition 12

Abréviations

II. 1. 3 Classification des cytokines 12 II. 1. 4 13Rôle des Cytokines II. 1. 5 14Cytokines et SNC II. 2 Les métalloprotéinases matricielles : molécules effectrices des cytokines au sein du processus inflammatoire 14 II. 2. 1 Structure des MMPs 15 II. 2. 2 Régulation de l’expression et de l’activité des MMPs 15 II. 2. 3 17Relation Cytokines/MMPs II. 2. 4 Rôle physiologique et pathologique des MMPs 18 III Pathologies Neuro-Inflammatoires 18 III. 1 La sclérose en plaques (SEP) 18 III. 1. 1 19et facteurs de prédisposition à la SEPHistorique III. 1. 2 Diagnostic 20 III. 1. 3 Physiopathologie 21 III. 1. 4 25Traitement de la SEP III. 2 La TSP/HAM 27 III. 2. 1 27Le rétrovirus humain HTLV-1 III. 2. 2 Leucémies / Lymphomes à cellules T de l’Adulte (ATL) 30 III. 2. 3 (TSP/HAM) 1La paraparésie spastique tropicale ou myélopathie associée à HTLV 31 BIBLIOGRAPHIE 36 Ac Anticorps ADAM ADAMalysine ADN Acide DésoxyriboNucléique ADNc Acide DésoxyriboNucléique complémentaire Ag Antigène AP-1Activation Protein -1 APMA p-AminoPhenylMercuric Acetate APS persulfate d'ammonium ATFActivating Transcription Factor ATL/ATLLAdult T-cell Leukemia Lymphoma BHE Barrière Hémato-Encéphalique CD Cluster de Différenciation CMH Complexe Majeur d'Histocompatibilité CPA Cellule présentatrice de l'Ag CREBC MP Response Element Binding protein A CTL Lymphocyte T Cytotoxique Dev Ast Cellules Dev de type astrocytaire EAE Encéphalomyélite Allergique Expérimentale EDSSExpanded Disability Status Score EDTA Ethylène diamine acide tétra-acetique ELISAEnzyme Linked Immuno-Sorbent Assay ESL-1E-Selectin liguand 1 FITC Isothiocyanate de fluorescéine GABA Acide Gamma-AminoButyrique GFAP Protéine gliale fibrillaire acide GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor uman Leucocyte Antigen HLAH HTLV-1Human T-cell Leukemia Virus-1 ICAMInterCellular Adhesion Molecule IFN Interféron IL Interleukine IRM Imagerie par résonance magnétique LCR Liquide Céphalo-Rachidien LFA Lymphocyte Function associated Antigen LT Lymphocyte T LTRLong Terminal Repeat MAGMyelin Associated Glycoprotein MBPMyelin Basic Protein

MEC Matrice ExtraCellulaire MMP Métalloprotéinases matricielles MOGmyelin-oligodendrocyte glycoprotein MT-MMPmembrane type - matrix metalloproteinase MTT MéthylThiazol Tétrazolium = diméthylthiazodiphényltétrazolium NFkB Facteur nucléaire B des chaînes kappa des immunoglobulines NKNatural Killer NO oxyde de nitrite PAFPlatelet Activating Factor PEA-3Polyoma Enhancer A binding protein -3 Protéine phospholipidique PLP ProMMP Métalloprotéinase sous sa forme latente PSGL-1P-Selectin glycoprotein 1 qsp Quantité suffisante pour SEP Sclérose En Plaques SNC Système Nerveux Central STATSignal Transduction and Activation of Transcription TCRT Cell Receptor TEMED N,N,N',N'-tétramethyléthylène diamine TGFTransforming Growth factor Th1/2 T helper 1/2 TIMPTissue Inhibitor of MetalloProteinases TNFTumor Necrosis Factor TSP/HAMTropical Spastic Paraparesis / HTLV-1 Associated Myelopathy VCAMVascular Cell Adhesion Molecule VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine VLAVery Late Antigen Introduction et Objectifs Le système nerveux central (SNC) a longtemps été considéré comme un organe immuno privilégié du fait de la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui l’isole du reste de l’organisme. Ce concept a été abandonné après l’observation de la capacité des lymphocytes T activés (ie prolifératif, sécréteur de cytokines et de protéases) de traverser la BHE puis de circuler au sein du parenchyme cérébral afin d’assumer leurs fonctions de surveillance immune. Néanmoins, ces lymphocytes T activés infiltrés sont rapidement éliminés par apoptose. Cependant ces cellules immunes ne sont pas toujours éliminées et peuvent être associées au développement d’atteintes neuro-inflammatoires telles que la sclérose en plaques (SEP) ou la myélopathie associée à l'infection par HTLV-1 (TSP/HAM), caractérisées par une destruction de la myéline et une perte axonale. Un infiltrat inflammatoire, constitué en partie de lymphocytes T activés, est visible au sein de ces lésions. Dans le cas de la TSP/HAM, les lymphocytes T infectés par le rétrovirus HTLV-1 sont activés en permanence. Pour la SEP, l'étiologie de la maladie reste inconnue, cependant une anomalie de la réponse immune semble favoriser la survie des lymphocytes T activés. Ainsi, ces deux pathologies ont comme cause initiale une perturbation de la réponse immune et une résistance des lymphocytes T activés infiltrés à l’apoptose. La pathogénicité de ces cellules immunes est fortement suspectée dans ces deux pathologies bien que non démontrée. D'une part, la destruction de la myéline pourrait résulter d'une réponse immune spécifique. Des lymphocytes T autoréactifs (ie reconnaissent un antigène du “soi, comme les protéines de la myéline), activés en périphérie, pourraient induire une démyélinisation en détruisant les oligodendrocytes, cellules myélinisantes du SNC. D'autre part, la démyélinisation découlerait d'une réponse immune non spécifique via la production par les lymphocytes T activés, de molécules inflammatoires telles que les cytokines pro-inflammatoires, chimiokines et métalloprotéinases matricielles (MMPs). En effet, les cytokines pro inflammatoires sont surexprimées au cours de l’inflammation : letumor necrosis factor -a est suspecté posséder (TNF)une action toxique directe sur les oligodendrocytes et leur progéniteurs ; l'interféron (IFN) -g, connu pour moduler l'expression du récepteur de mort Fas et de son ligand Fas Ligand (FasL), régulerait la susceptibilité des oligodendrocytes à une apoptose médiée par les cellules T. Les MMPs ont un rôle crucial. Effecteurs des cytokines, elles favoriseraient leur activité délétère en facilitant l'entrée des cellules immunes dans le SNC par l'ouverture de la BHE et en maturant par clivage protéique les récepteurs de mort et le TNF-a. Ces molécules inflammatoires activeraient ainsi les cellules résidentes du SNC, en particulier les astrocytes, permettant une amplification du processus inflammatoire intrathécal. Quel que soit le mécanisme physiopathologique mis en jeu, l’oligodendrocyte est une cible privilégiée des cellules T infiltrées. La mort des oligodendrocytes matures myélinisants pourrait expliquer le processus de démyélinisation dans la SEP et la TSP/HAM tandis que la mort de leurs précurseurs aurait pour conséquence une incapacité à remyéliniser chez les patients atteints de ces pathologies. Enfin, les cellules immunes infiltrées pourraient également induire la dégénérescence des axones observée chez les patients atteints de SEP ou de TSP/HAM, observation qui fait actuellement considérer ces atteintes comme neuro-inflammatoires et neuro dégénératives. L’objectif de ce travail est d’étudier l'expression des MMPs et de leurs inhibiteurs endogènes, les TIMPs, dans la SEP et la TSP/HAM,

et d’évaluer l’effet de traitement anti-inflammatoire sur ces expressions. Nous nous proposons d’étudier plus particulièrement MMP 9 et son principal inhibiteur endogène, TIMP-1 en raison de leur forte expression et modulation au cours d'atteintes neuro-inflammatoires. Nous évaluerons, tout d’abord, les sécrétions de MMP-9 et TIMP-1 chez des patients souffrant de SEP ou de TSP/HAM au niveau central (liquide céphalo-rachidien - LCR) et périphérique (plasma). Les taux de MMP-9 plasmatique et de TIMP-1 seront dosés par ELISA. La présence de MMP-9 dans le LCR des patients pourra être appréciée par zymographie, technique plus sensible que l'ELISA. Cette approche nous permettra de visualiser, chez ces patients, la production de protéases généralement associée à une inflammation intracérébrale. Par ailleurs, afin de mettre en évidence une éventuelle modulation des MMPs et TIMPs par des médicaments anti-inflammatoires, nous établirons un modèlein vitrod'inflammation gliale. Des astrocytes, cellules fortement impliquées dans l'homéostasie du SNC et dans le processus inflammatoire, seront traités par une cytokine pro-inflammatoire, le TNF-a, inducteur de MMPs et de TIMPs. Une perturbation de la balance protéase/inhibiteur est attendue. L’effet d’un traitement simultané par les cytokines IL-4, IL-10 ou IFN-b sur les sécrétions des MMPs et TIMPs permettra d’évaluer l’effet de cytokines anti-inflammatoires sur la balance protéase/inhibiteur. Enfin, dans une optique de suivi thérapeutique de patients atteints de SEP et traités par l’IFN-b1a Rebif®, nous analyserons, au cours d’une étude longitudinale, les effets de ce traitement sur le rapport TIMP-1/MMP-9. Rappels Bibliographiques

I Le système nerveux central Le système nerveux central (SNC) comprend la moelle épinière, le tronc cérébral et le cerveau. Ce dernier est constitué du parenchyme cérébral et de ventricules, cavités contenant le liquide céphalo-rachidien (LCR). Les neurones et les cellules gliales sont les deux grands types cellulaires qui composent le parenchyme cérébral. I. 1 Les cellules constitutives du SNC I. 1. 1 Les neurones Lesneuroneset de la transmission de l’information, sont désignés selon leur morphologie (neurones, responsables du stockage pyramidaux, cellule étoilée, cellule de Purkinje, ...), leur localisation et leur fonction (neurone excitateur ou inhibiteur). Ils ont la capacité de générer un signal électrique transmissible d’un neurone à l’autre au niveau d’une synapse grâce à un neurotransmetteur (Exemple : glutamate, principal neurotransmetteur excitateur ou le GABA, principal neurotransmetteur inhibiteur) qui, libéré par le neurone pré-synaptique, va se lier sur des récepteurs spécifiques présents sur la membrane du neurone post-synaptique. I. 1. 2 Les cellules gliales Les cellules gliales sont 10 fois plus nombreuses que les neurones. Elles sont réparties en différentes catégories cellulaires selon des critères morphologiques et fonctionnels. Ainsi, sont définis les astrocytes, les cellules microgliales, les oligodendrocytes et les épendymocytes. Au-delà de leur rôle de soutien, les cellules gliales participent au maintien de l’intégrité du SNC ; leur rôle est d’assurer le fonctionnement neuronal, que ce soit dans des situations physiologiques ou lors d’agressions du SNC (infection virale par exemple). Lesytoctrasse% du nombre total des cellules du SNC. Ils sont à la fois présents dans la substance grise et lareprésentent environ 50 substance blanche. Un des marqueurs classiques des astrocytes est la protéine glio-fibrillaire acide ou GFAP(Eng and Shiurba, 1988) qui constitue les filaments intermédiaires des astrocytes matures. Ce sont des cellules qui présentent de multiples extensions cytoplasmiques, pouvant former des manchons vasculaires. Ils peuvent communiquer entre eux par des jonctions communicantes et sont également en contact étroit avec les neurones. Le rôle essentiel des astrocytes est la régulation de la composition du milieu extracellulaire par capture des neurotransmetteurs et du glucose. Par ailleurs, leur capacité à métaboliser ces composés en fait également des fournisseurs d'énergie pour les neurones. Lescellules microgliales sont sont localisées des cellules de petite taille avec de nombreux prolongements fortement ramifiés. Elles en abondance dans la substance grise. Contrairement aux autres cellules du SNC, elles sont issues de cellules embryonnaires de la crête neurale. Les cellules microgliales, de même que les astrocytes, participent aux processus immunitaires et inflammatoires dans le SNC : elles prolifèrent en cas de lésions, sont capables de phagocytose et sont présentatrices de l’antigène aux lymphocytes T du système immunitaire. C’est pourquoi, elles sont encore appelées les “macrophages du SNC. Lesoligodendrocytes sont de petites cellules rondes localisées dans la substance blanche entre les fibres nerveuses et dans la substance grise en association étroite avec les corps cellulaires des neurones. Ils sont responsables de la formation de la gaine de myéline autour de certains axones dans le SNC. Les cellules de Schwann assurent la même fonction dans le système nerveux périphérique. En outre, les oligodendrocytes participent avec les astrocytes au métabolisme des neurotransmetteurs (Cammer, 1990). Enfin, lesépendymocytesforment un épithélium, l’épendyme, qui borde les ventricules cérébraux. Ce sont des cellules cuboïdales. Au

niveau des plexus choroïdes (épithélium différencié de l’épendyme), les cellules épendymaires, hautement différenciées et spécialisées,sont polarisées avec un côté apical distinguable par la présence de nombreuses microvillosités et un pôle basolatéral, en contact avec le stroma, qui possède de multiples invaginations entre lesquelles se trouvent un grand nombre de mitochondries. La principale fonction des plexus choroïdes est la synthèse du LCR et la neuroprotection du SNC (Ghersi-Egea and Strazielle, 2001). I. 2 Les barrières isolant le SNC du reste de l’organisme Les neurones nécessitent un environnement extracellulaire stable pour assurer leurs fonctions. Le parenchyme cérébral est isolé du compartiment liquidien dans lequel circule le sang par des barrières physiques et métaboliques qui permettent de réguler et de protéger le micro environnement cérébral contre un dérèglement de la concentration des composés du milieu extracellulaire ou contre l'intrusion de microorganismes étrangers. Ainsi, deux barrières principales sont distinguées : -la barrière hémato-encéphalique (BHE), à l’interface entre le sang et le parenchyme cérébral, est constituée par les cellules endothéliales de la paroi des vaisseaux sanguins cérébraux reliées entre elles par des jonctions serrées. Cette paroi empêche le passage de macromolécules (notamment des protéines), limite celui des petites molécules et favorise celui des molécules essentielles au fonctionnement du SNC comme le glucose ou les acides aminés (pour revue voir Spector and Johansson, 1990). -les plexus choroïdes, à l’interface entrele sang et le LCRconstitués de cellules épithéliales polarisées unies par des, sont jonctions adhérentes composées de cadhérines et de jonctions serrées de typezonula occludens, ce qui limite le passage de nombreuses molécules entre les cellules (Strazielle and Ghersi-Egea, 2000). Le passage au travers des cellules est dépendant de la lipophilie et de la taille du composé mais aussi de la présence de protéines de transport spécifiques sur la surface cellulaire (Strazielle and Ghersi-Egea, 2000). De plus, une troisième interface existe entrele LCR et le tissu cérébral l’épendyme. Dans les ventricules, elle est constituée par perméable. Au niveau sous arachnoïdien où l’épendyme n’est pas présent, cette interface est formée par laglia limitans. Elle est composée par des prolongements astrocytaires jointifs recouverts d’une lame basale. I. 3 Communications entre le SNC et le système immunitaire De par la présence de ces barrières, le SNC a été pendant longtemps considéré comme un organe isolé du reste de l’organisme. Par ailleurs, la faible expression des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II a conduit à le supposer immunologiquement privilégié. Ces concepts ont été abandonnés lorsqu’a été mise en évidence la présence de cellules immunes dans le LCR. Parallèlement, le système immunitaire, qui n’affectait, ni n’était affecté par aucun autre système physiologique, était considéré comme un système autonome. Or, lors de l’infection d’un individu, celui-ci présente divers symptômes (fièvre, tremblements, anorexie, ...) mettant en jeu différents systèmes ou organes. Il apparaît donc que le système immunitaire est fortement lié à d’autres systèmes physiologiques comme les systèmes neuroendocriniens (Besedovsky and del Rey, 1992) ou digestifs (Uehara et al., 1992). Des interactions cellulaires entre le SNC et le système immunitaire ont été suggérées. En effet, au cours d’une inflammation du SNC, l’infiltration dans le parenchyme cérébral et le LCR de lymphocytes T, de lymphocytes B et de nombreux macrophages, est corrélée à la présence de cellules microgliales activées (Plata-Salaman, 1991 ; Engelhardt et al., 2001). Cette hypothèse est renforcée par la mise en évidence dans le SNC de la présence de cytokines, molécules fortement impliquées dans le système immunitaire (Breder et al., 1988 ; Plata-Salaman et al., 1988), de chimiokines, molécules impliquées dans l’attraction cellulaire, et de leurs récepteurs respectifs. I. 3. 1 Le passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) Le passage des lymphocytes T dans le compartiment cérébral nécessite une migration à travers la BHE et tout d’abord, leur activation en périphérie. Ce passage est cependant antigène indépendant. Plus connue, la migration transendothéliale (passage de barrière hémato-encéphalique) implique l’interaction de molécules d’adhérence cellulaires présentes à la surface des lymphocytes et des cellules de l'endothélium vasculaire, et dont l'expression est induite par des cytokines pro-inflammatoires (Hickey et al., 1991). Les lymphocytes circulants activés sont d'abord ralentis par l'action des sélectines, formant un lien faible avec les cellules endothéliales. Puis ils sont immobilisés sur les vaisseaux par l'interaction des molécules d'adhérence intercellulaire (ICAM-1) et vasculaire (VCAM-1) avec leurs récepteurs LFA-1 et VLA-4, associées aux lymphocytes. Enfin, la migration cellulaire se termine par la diapédèse des lymphocytes à travers la paroi endothéliale sous l'influence de facteurs chimiotactiques présents dans les cellules endothéliales et gliales périvasculaires (chimiokines, PAF, C5a) (Hartung et al., 1995). Ce phénomène est facilité par la sécrétion par les cellules endothéliales et les lymphocytes activés de métalloprotéinases (MMPs) qui sont suspectées perméabiliser la BHE (Rosenberg et al., 1992 ; Rosenberg et al., 1995). Au niveau des plexus choroïdes, il a été également rapporté la présence de molécules d’adhérence au pôle apical des cellules épithéliales choroïdiennes au cours d’une inflammation. Les mécanismes de pénétration des leucocytes dans le LCR ne sont pas encore connus. Néanmoins, les plexus choroïdes semblent être un des sites d’entrée de lymphocytes T activés dans le SNC, comme lors de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) (Chen et al., 2000). Ceci suggère que des lymphocytes T autoréactifs

dirigés contre la myéline, pourraient emprunter cette même voie, atteindre le SNC et provoquer des atteintes neuro-démyélinisantes (Engelhardt et al., 2001). II Le système immunitaire Le système immunitaire a pour rôle de défendre un organisme contre l’agression d’un élément étranger ou devenu étranger en l’éliminant, et de favoriser la réparation des tissus puis leur guérison. Le maintien de l'intégrité de l'organisme face à un élément étranger est le résultat de l'interaction entre deux systèmes immunitaires : le système immunitaire inné et le système immunitaire spécifique. Tous deux font intervenir des cellules, issues du système hématopoïétique, ayant un caractère de cellule circulante (dans le sang, le liquide interstitiel, la lymphe canalisée), une aptitude à se déformer et à traverser les parois des capillaires (phénomènes de diapédèse), et possédant à leur surface des glycoprotéines spécifiques (molécules de CMH de classe I et II). Elles sont classées selon leur filiation et leur état de différenciation. Ainsi, on distingue les polynucléaires (neutrophiles, granulocytes, éosinophiles), les monocytes et macrophages, les cellules dendritiques, les cellules de Langerhans, les cellules Killer (K) et Natural Killer (NK), les lymphocytes T et B, et les plasmocytes. Le système immunitaire inné est caractérisé par une identification non spécifique de l'antigène par les phagocytes (neutrophiles et monocytes), les macrophages, les cellules dendritiques et/ou les cellules NK. Lorsque l'antigène est détecté et apprêté par ces cellules, il est présenté aux lymphocytes T et B. La reconnaissance de l’antigène et l’interaction entre des molécules du CMH et des récepteurs lymphocytaires vont permettre l'activation des cellules de l'immunité spécifique dont notamment la maturation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T auxiliaires, et leur expansion clonale. Par ailleurs, cette communication entre les différentes catégories de cellules qui composent les systèmes immunitaires inné et spécifique fait intervenir des médiateurs cellulaires : les cytokines. II. 1 Les médiateurs de l’immunité: les cytokines II. 1. 1 Historique La connaissance du premier médiateur cellulaire a été mise en évidence lors d’expérience dans laquelle la migration de polynucléaires neutrophiles et de macrophages était inhibée en présence de tissus sensibilisés à la tuberculine ou de lymphocytes activés. Ceci suggère que des facteurs solubles produits par ces cellules actives, pouvaient médier des effets biologiques. Depuis, de nombreuses études ont cherché à caractériser l’action biologique de ces substances solubles appelées cytokines. II. 1. 2 Définition Les cytokines, d’abord identifiées dans le système immunitaire, participent généralement à des processus de défense de l’organisme et de réparation. Ce sont des (glyco) protéines non immunoglobuliniques de faible poids moléculaire qui permettent une communication bidirectionnelle entre les cellules. Ces molécules régulent les fonctions de survie, de croissance, de différenciation et modifient l’expression de gènes et l’action de cellules cibles par l’intermédiaire de récepteurs de haute affinité. Elles agissent de façon auto- ou para-crine, pleïotropique (action sur différents types cellulaires) et redondante (plusieurs cytokines peuvent induire une même réponse cellulaire). Elles sont généralement induites, suite à un stimulus, et produites de façon transitoire par les cellules immunitaires, les cellules mésenchymateuses (fibroblastes, ) et, dans le SNC, par les neurones et les cellules gliales (oligodendrocyte, astrocyte et microglie). Leur action peut être régulée grâce à la présence de récepteurs solubles, issus par clivage de récepteurs membranaires, qui agissent en tant que réservoir ou inhibiteur. II. 1. 3 Classification des cytokines Suite à l’observation, dans diverses maladies infectieuses, de signes cliniques et pathologiques différents et polarisés (forte réaction d’hypersensibilité retardée avec un faible taux d’anticorps ou fort taux d’anticorps et une faible réaction d’hypersensibilité retardée), une dichotomie de la nature de la réaction immune spécifique a été mise en évidence. Ainsi, on différencie la réponse humorale favorisant la production d'anticorps et la réponse cellulaire ayant une action cytotoxique. De par l’implication des lymphocytes T auxiliaires dans l'initiation des réactions immunitaires spécifiques cellulaire et humorale, il a été montré l’existence de deux populations de ces lymphocytes T distinctes favorisant soit la phagocytose et une réaction cellulaire contre les agents infectieux (population Th1), soit une réaction d'hypersensibilité immédiate médiée par la dégranulation des mastocytes et une activation des éosinophiles (population Th2). L'identification de ces deux entités de lymphocytes T est basée sur leurs profils de production de cytokines (Mosmann et al., 1986).

Depuis, les cytokines sont classées en deux groupes : - les cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules de type Th1 : Interleukine-1 (IL-1) a/b,IL-2, Interféron (IFN)-g, Tumor Necrosis Factor (TNF)- a/b. - les cytokines anti-inflammatoires sécrétées par les cellules de type Th2 : IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, Transforming Growth Factor (TGF)-b, IFN-b. II. 1. 4 Rôle des Cytokines (pour revue voir Abbas et al., 1996)

Les cytokines sont fortement impliquées dans la communication, l'activation et la différenciation des cellules immunes. L'IL-2, notamment, est indispensable à la multiplication clonale des cellules immunitaires après leur stimulation par un antigène. En effet, sécrétée en réaction à une reconnaissance antigénique, elle se lie, de façon autocrine, sur son récepteur dont l’expression est également augmentée, et entraîne la cellule dans une boucle de multiplication clonale. Par ailleurs, les cytokines sont fortement impliquées dans la différenciation des lymphocytes T auxiliaires (Th1 ou Th2). En effet, provenant d’un seul lymphocyte T naïf, la différenciation des LT auxiliaires est influencée par l’environnement et la manière dont ce précurseur a été stimulé. Ainsi, le lymphocyte T naïf est mature lorsqu’il produit de l’IL-2 suite à un premier contact avec un antigène. Sous l’influence de l’IL-12 ou de l’IFN-g, permettant l’activation du facteur de transcription Stat 4, le LT naïf activé va se différencier vers un profil Th1. De même, grâce à l’IL-4 qui active Stat 6, il tendra vers le sous-type Th2. Selon les cytokines qu'ils produisent, les LT auxiliaires (Th1 ou Th2) enclenchent une réponse immunitaire différente. Les cytokines de type Th1 induisent une immunité cellulaire et les cytokines de type Th2 entraînent une immunité humorale. En effet, les cytokines Th1 induisent l’expression de molécules d’adhérence et de certaines métalloprotéinases (MMPs) facilitant ainsi le recrutement d’autres cellules immunes sur le site inflammatoire. Par ailleurs, elles activent les macrophages et stimulent la production d’IgG afin de faciliter l’opsonisation et la phagocytose des particules étrangères. Les lymphocytes T de type Th1 sécrétant ces cytokines acquièrent une capacité cytolytique et favorisent la différenciation de lymphocytes T CD8+ en cellules cytotoxiques actives. C’est pourquoi, les cytokines pro-inflammatoires ou de type Th1, souvent associées aux lésions tissulaires et à l’inflammation, favorisent la mise en place d’un processus d’inflammation chronique médié par une réaction d’hypersensibilité retardée. Parallèlement, les cytokines de type Th2 sont nécessaires à la maturation des lymphocytes B en plasmocytes (Olsson, 1994), aux réactions IgE dépendantes médiées par les mastocytes et à l’activation des éosinophiles. Ainsi, ces cytokines sont préférentiellement impliquées dans les réponses d’hypersensibilité immédiate (réaction atopique). Par ailleurs, elles permettent une diminution du processus inflammatoire par un effet antagoniste des cytokines pro-inflammatoires. Il est donc possible que la fonction physiologique première des cytokines de type Th2 n’implique pas la notion d’effecteur mais de régulateur de la réponse immune de type Th1. II. 1. 5 Cytokines et SNC (pour revue voir Szelenyi, 2001) La présence de cytokines fonctionnelles et de leurs récepteurs dans le SNC a été mise en évidence pour la première fois par Breder et Plata-Salamon qui ont démontré dans le cerveau l’activité biologique et l’immunoréactivité des cytokines pro-inflammatoires IL-1b et TNF-a (Breder et al., 1988; Plata-Salaman et al., 1988). Par la suite, des travaux ont montré que les cellules nerveuses (neurone, astrocyte, oligodendrocyte et microglie) étaient capables d'exprimer les messagers, les protéines, ou les récepteurs des cytokines à l'état basal. Les cytokines sont impliquées dans le système immunitaire mais également dans divers processus physiologiques ou pathologiques dans les systèmes nerveux central et périphérique. Elles peuvent activer des cellules résidentes du SNC (astrocyte et microglie) qui pourront sécréter à leur tour des cytokines (Burger and Dayer, 1995). Parallèlement, elles modulent la différenciation et la survie des cellules nerveuses. Cependant, les interactions entre système immunitaire et système nerveux peuvent être bidirectionnelles. En effet, la balance cytokinique (Th1 versus Th2) peut être à son tour modulée par l’action de neurotransmetteurs ou neuropeptides, produits par les neurones (pour revue voir (Szelenyi, 2001)). Ainsi, ces systèmes sont étroitement liés (del Rey et al., 1981; Elenkov et al., 2000). Physiologiquement, l’expression des différentes cytokines dans le SNC est strictement régulée. Mais dans des conditions pathologiques, leur expression peut être temporellement et spatialement modifiée comme après une ischémie où l'on observe une augmentation de TGF-b1 dans les neurones de l’hippocampe (Zhu et al., 2000). II. 2 Les métalloprotéinases matricielles: molécules effectrices des cytokines au sein du processus inflammatoire Une des cibles moléculaires des cytokines est constituée par la famille des métalloprotéinases dont elles régulent, pour certaines d'entre elles, l’expression et la maturation. Les métalloprotéinases, de la famille des matrixines, comprennent les métalloprotéinases matricielles (MMPs) et les adamalysines (ADAM). Ce sont des endopeptidases zinc dépendantes dont les substrats sont principalement des composants de la matrice extracellulaires (MEC) (Woessner, 1994). Elles participent donc aux mouvements cellulaires (migration, plasticité des prolongements cytoplasmiques), à la survie/prolifération et à la morphologies des cellules (Vu and Werb, 2000). Elles sont également impliquées dans la maturation de certaines cytokines et de nombreux récepteurs membranaires par clivage protéolytique (Vu and Werb, 2000). Elles pourraient donc jouer un rôle dans la régulation de la signalisation cellulaire, notamment via les cytokines.

II. 2. 1 Structure des MMPs Au nombre de 28, les MMPs sont classées en 5 groupes selon leur structure et leur propriété enzymatique. On distingue ainsi les collagénases qui clivent préférentiellement les molécules à triple hélice de collagènes, les gélatinases qui dégradent la gélatine, les stromélysines, les MMPs liées à la membrane (MT-MMPs) et les autres MMPs. Les MMPs présentent des domaines de séquences communs : - un peptide signal qui permet de cibler la sécrétion, - un propeptide (environ 80 aa) dont le clivage est nécessaire pour l’activation,

un domaine catalytique (environ 170 aa) contenant un motif hautement conservé (HexGHxxGxxHS/T) qui permet la liaison à un -atome de zinc via les 3 histidines, - un domaine carboxylique (environ 120 aa) ayant une forte homologie avec des motifs hémopexine et vitronectine. Ce domaine, absent chez MMP-7 et MMP-26, confère une spécificité de substrat. Par ailleurs, certaines MMPs présentent des sites additionnels : les gélatinases possèdent au niveau de leur site catalytique trois motifs “fibronectine permettant la liaison de la gélatine. Les MT-MMPs, métalloprotéinases membranaires, ont un domaine de liaison à la membrane inséré dans la région C terminale qui leur confère une fonction de récepteur pour d’autres MMPs (Ex : MT1-MMP et ProMMP-2 via TIMP-2). Au niveau de la séquence génomique, cette structure en domaine est déjà observable. Ainsi, les exons 1 à 5 codent pour le propeptide et le domaine catalytique, les exons 6 à 10 pour le domaine carboxylique. On retrouve également les exons additionnels pour les MMP-2 et -9 et les MT-MMPs (Kleiner and Stetler-Stevenson, 1993). II. Régulation de l’expression et de l’activité des MMPs 2. 2 Le contrôle de l’expression et de l’activité enzymatique des MMPs s’établit à 3 niveaux : II. 2. 2. 1 Régulation de la transcription des gènes La plupart des MMPs ne sont pas exprimées constitutivement dans le tissu en conditions physiologiques ou bien le sont à des taux indétectables par les méthodes de détection actuelles. L’induction et la suppression de leur transcription nécessitent, respectivement, la présence d’effecteurs (cytokines pro-inflammatoires, facteurs de croissance, interactions cellules-matrice et cellule cellule, ou transformation cellulaire oncogénique) et de suppresseurs (TGF-b, acide rétinoïque, glucocorticoïdes) (Nagase, 1996). Le contrôle de cette expression s’effectue via la région promotrice du gène située en aval de la région codante. Elle peut présenter des sites spécifiques comme AP-1 (Activation protein-1), PEA-3 (Polyoma Enhancer A binding protein 3) ou NFkB (Nuclear Factor-kappaB) qui permettent la fixation de facteur de transcription. Puisque son promoteur génique ne possède ni site AP-1 ni boîte TATA, seule MMP-2 aurait une expression constitutive. I Régulation de l’activation enzymatique I. 2. 2. 2 Hormis quelques membres (stromélysine-3 (MMP-11) et MT1-MMP) activés dans l’appareil de Golgi par des furines, de nombreuses MMPs sont sécrétées sous forme de zymogènes inactifs (proenzyme). Une liaison entre un résidu cystéine contenu dans la séquence du propeptide (PRCGxPDV) et l’atome de zinc associé au site catalytique (Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990; Becker et al., 1995) permet le maintien de la latence de la proMMP par un masquage du site enzymatique. Le mécanisme d’activation requiert donc la destruction de cette interaction. Le clivage du propeptide est souvent réalisé dans un second temps par les MMPs elles-mêmes ou d’autres protéases comme le système plasmine plasminogène. In vivoproMMPs sont activées par des protéinases tissulaire ou plasmatique., les In vitro, l’activation des MMPs peut être reproduite par des protéinases (trypsine, plasmine) ou des agents non protéolytiques réagissant avec la liaison S-H comme des composés mercuriels (p aminophenylmercuric acetate ou APMA), des réactions oxygénées ou des dénaturants (SDS). II. 2. 2 3 par des inhibiteurs endogènes : les TIMPsRégulation de l’activité enzymatique . L’activité des MMPs est inhibée de façon non spécifique,in vitro, par des agents chélateurs (EDTA) ou des synthétiques inhibiteurs (hydroxamates, batimasta) etin vivo macroglobuline.par l’a2 In vivo, les principaux inhibiteurs spécifiques endogènes des MMPs sont les TIMPs,Tissue Inhibitor of metalloproteinases. A ce jour, 4 membres ont été identifiés, TIMP-1 à TIMP-4. L’expression de TIMP-1 et TIMP-3 peut être induite par des facteurs comme les cytokines alors que TIMP-2 est constitutivement exprimé (Leco et al., 1994; Wick et al., 1994; Sun et al., 1995). Par ailleurs, TIMP-1, -2 et -4 sont des protéines solubles sécrétées, contrairement à TIMP-3 qui est insoluble et associé à la matrice extracellulaire (Leco et al., 1994). Ces 4 membres présentent des homologies de structure et en particulier 12 résidus cystéine conservés qui permettent la formation de deux domaines contenant chacun trois boucles internes (Williamson et al., 1990). Deux liaisons entre TIMP et MMP sont possibles : la première, au niveau du site catalytique des MMPs, permet d’inhiber leur activité (Willenbrock and Murphy, 1994) ; la seconde s’établit via le domaine C terminal des proMMPs et participe à la régulation de leur activation (Murphy et al., 1992; Sato et al., 1994; Strongin et al., 1995). Ainsi, Sato et col. (Sato et al., 1994) démontre que l’activation de proMMP 2 est effectuée via MT1 MMP et la formation du complexe TIMP-2/MT1-MMP. En effet, TIMP-2 se complexe avec MT1-MMP en l’inhibant et se lie également via son domaine C terminal au domaine hémopexine de proMMP 2. Cette dernière peut alors être activée par une seconde molécule de MT1-MMP. Ainsi, en raison de leur capacité à inhiber les MMPs, les TIMPs participent à l’inhibition de l’invasion cellulaire, de la tumorigenèse, de la formation de métastases, de l’angiogenèse (Bafetti et al., 1998) et de la plasticité synaptique (Rivera et al., 1997). Parallèlement, les TIMPs présentent des activités biologiques indépendantes de l’activité d’inhibition des MMPs (Hayakawa et al., 1994; Chesler et al., 1995). Des études récentes ont montré que TIMP-3 est inducteur de l’apoptose de cellules de mélanome humain ou de carcinome de colon (Smith et al., 1997; Ahonen et al., 1998). TIMP-1 et TIMP-2 présentent des propriétés de facteur de croissance pour de nombreux types cellulaires.