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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Marie-Laure FRANCO-MONTOYA Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : Rôle des métalloprotéases dans la sévérité des agressions pulmonaires au cours de la croissance pulmonaire postnatale Soutenu le 12 Décembre 2003 devant le jury constitué de : Madame M-M GIRAUD-GUILLE (Présidente du jury) Madame S. DEMIGNOT Monsieur C. DELACOURT Monsieur E. FRISDAL Laboratoire EPHE de PHARMACOLOGIE CELLULAIRE Directeur : Pr Jean CHAMBAZ 15 rue de l'Ecole de Médecine – Paris 75006 Responsable EPHE : Sylvie Demignot () Laboratoire de PHYSIOLOGIE et THERAPEUTIQUE RESPIRATOIRE INSERM U492 - faculté de médecine – 8 rue du Général Sarrail – Créteil 94000 Responsable stage : Pr Christophe Delacourt () RESUME : EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : lundi 1 décembre 2003
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MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre  MEMOIRE Présenté par Marie-Laure FRANCO-MONTOYA
         Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   TITRE : Rôle des métalloprotéases dans la sévérité des agressions pulmonaires au cours de la croissance pulmonaire postnatale   Soutenu le 12 Décembre 2003 devant le jury constitué de :  Madame M-M GIRAUD-GUILLE (Présidente du jury)          Madame S. DEMIGNOT      Monsieur C. DELACOURT              Monsieur E. FRISDAL   Laboratoire EPHE de PHARMACOLOGIE CELLULAIRE Directeur : Pr Jean CHAMBAZ 15 rue de l’Ecole de Médecine – Paris 75006 Responsable EPHE : Sylvie Demignot (Sylvie.Demignot-u505@bhdc.jussieu.fr)  Laboratoire de PHYSIOLOGIE et THERAPEUTIQUE RESPIRATOIRE INSERM U492 - faculté de médecine – 8 rue du Général Sarrail – Créteil 94000 Responsable stage : Pr Christophe Delacourt (Christophe.Delacourt@chicreteil.fr) RESUME :  
A la naissance, le développement pulmonaire n’est pas terminé et il se poursuit activement avec la formation des alvéoles définitifs. Ce processus implique notamment un remaniement intense de la matrice extracellulaire. Cette période de multiplication alvéolaire est une période à risque pour la survenue de séquelles après agression, tout particulièrement chez le prématuré. En pathologie humaine, la dysplasie broncho-pulmonaire est l’exemple typique de cette fragilité du poumon immature face aux agressions. La réorganisation de la matrice extracellulaire pulmonaire durant cette période fait intervenir des métalloprotéases (MMP) dont l’action est modulée par des inhibiteurs spécifiques. Le rôle de ces métalloprotéases ainsi que leur responsabilité dans la survenue de troubles au cours du développement pulmonaire reste mal définis. Pour mieux comprendre les mécanismes en jeu, nous avons évalué et comparé le développement pulmonaire et les activités des MMP, particulièrement de la gélatinase B, chez des rats nouveau-nés de 6 jours et des rats adultes soumis à une agression pulmonaire induite par une endotoxine bactérienne : le lipopolysaccharide (LPS) d’E. coli. Après l’agression, le recrutement de cellules inflammatoires (macrophages et polynucléaires neutrophiles, producteurs de gélatinase B ou MMP9) est observé aussi bien chez les adultes que chez les nouveau-nés, ainsi qu’une augmentation de l’activité de la gélatinase B ; cependant, chez ces derniers, la réaction inflammatoire demeure moins importante. Ces réponses à l’agression s’accompagnent chez le nouveau-né de troubles du développement pulmonaire à savoir : une diminution du volume respiratoire, de la surface alvéolaire et du volume total d’air alvéolaire.  Afin de déterminer s’il existe une relation entre l’augmentation de gélatinase B et croissance alvéolaire anormale, nous avons utilisé un inhibiteur non spécifique des métalloprotéases, la doxycycline, dans l’optique de diminuer la production de gélatinase B et d’évaluer son importance pour les troubles du développement pulmonaire. L’hypothèse de son implication n’a pas été vérifiée puisque malgré l’inhibition partielle de la gélatinase B, les troubles de la croissance pulmonaire précédemment observés persistaient. Cependant, d’autres voies restent à explorer afin de préciser le mécanisme d’action exact du LPS et le rôle de l’augmentation des activités gélatinolytiques dans les troubles du développement pulmonaire postnatal, par exemple par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des gélatinases ou encore la surexpression de gélatinases par exemple par transfert de gène à l’aide d’un vecteur adénoviral.
 
   
 TABLE DES MATIERES
I ère PARTIE : Introduction
  1- Rappels bibliographiques : -       1-1 Croissance pulmonaire postnatale…………………………………….……6 -       1-2 Développement pulmonaire postnatal et renouvellement de la matrice extra-cellulaire……………………………………………………………………9 -       1-3 Troubles du développement pulmonaire postnatal induits par une agression pulmonaire……………………………………………………………11 -   1-4 Métalloprotéases, lésions de la matrice extra-cellulaire et troubles du      développement pulmonaire……………………………………………...……...12
PARTIE : Matériel et Méthodes II ième
 2- Objectifs de l’étude :  - 2-1 Hypothèse de travail…………………………………………………….…20  2-2 Plan de l’étude………………………………………………………….…..20 -    1- Description du modèle d’agression : -   1-1 Animaux……………………………………………………………………22     -       1-2 Protocole d’instillation intra-trachéal……………………………………22 -       1-3 Lavage broncho-alvéolaire………………………………………………..23 -       1-4 Traitement préventif à la doxycycline……………………………………23   2- Mise en évidence de l’inflammation :        2-1 Cytologie du lavage broncho-alvéolaire…………………………………..24 --    2-2 Dosage des protéines totales……………………………………………….24      3- Méthodes d’étude des gélatinases -       3-1 Analyse de l’activité gélatinolytique totale par zymographie..……...…..25 -       3-2 Analyse de l’activité libre par dégradation d’un substrat tritié …..……27 -       3-3 Localisation tissulaire des gélatinases par zymographie in situ ………...27  4- Mise en évidence de troubles du développement :étude morphométrique -       4-1 Préparation des coupes histologiques de poumons de rat……………….28 -   4-2 Histologie standard ……………………………………………...…...……28     -       4-3 Evaluation morphométrique des structures pulmonaires…...….………29  
5- Analyse statistique………………………………………………………………………33   
III ème PARTIE : Résultats  
IV ème PARTIE : Discussion
  1- Réponse inflammatoire aiguë : étude dose-réponse……………………….…………34 2- Réponse inflammatoire tardive……………………………………………..…………38 3- Variations des activités gélatinolytiques………………………………………………40 4- Changements induits dans le développement pulmonaire………………………...…45 5- Effets de la doxycycline…………………………………………………………………49    1- Réponse inflammatoire……………………………………………………………….…50 2- Activités gélatinases………………………………………………………………….…..53 3- Troubles de la croissance pulmonaire…………………………………………………..54    LISTE DES ABREVIATIONS……………………………………………………….……4  BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………..57  ANNEXES  
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
1- Mesure de l’activité gélatinolytique totale par zymographie………………66 2- Dosage de l’activité gélatinolytique libre………………………………...…..69 3-    Protocole de zymographie in situ………………………………………..…...71 4     Article : -“LPS-induced lung injury in neonatal rats : changes in gélatinase activities and consequences on lung growth.”………………………………………….73 LISTE DES ABREVIATIONS
 -       DBP : Dysplasie Broncho-Pulmonaire
-       DOX : Doxycycline -       IT : Injection Intra Trachéale -       LBA : Lavage Broncho-Alvéolaire -       LPS : LipoPolySaccharide -       MMP : « Matrix MetalloProteinases », métalloprotéases de la matrice extra-cellulaire -       PFA : ParaFormAldehyde -       SDS : Sodium Dodecyl Sulfate -       TIMP : « Tissue Inhibitor of Metalloproteinases », inhibiteur tissulaire des métalloprotéase
I ère PARTIE : INTRODUCTION
1-    RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES :
    1-1 Croissance pulmonaire postnatale :   Le poumon peut être divisé schématiquement en deux parties : les voies aériennes dites de conduction (bronches et bronchioles) des gaz inhalés et expirés et le parenchyme pulmonaire responsable des échanges gazeux. A la naissance le développement pulmonaire n’est pas terminé. Non seulement l’organe va être l’objet d’une croissance plus que proportionnée par rapport au reste de l’organisme, mais il va subir d’importantes modifications structurales. En effet, si le poumon est évidemment capable d’effectuer dès la naissance les échanges gazeux entre l’air et le sang, il est principalement constitué de sacs alvéolaires non subdivisés et ne comporte qu’un très petit nombre d’alvéoles définitifs. La formation des alvéoles par septation secondaire des sacs alvéolaires est dans l’espèce humaine un processus essentiellement post-natal qui s’étend sur les deux premières années. Le maximum de la formation alvéolaire s’effectue toutefois précocement après la naissance, et la fin de la période alvéolaire pourrait se situer entre 12 et 24 mois après la naissance [1-3] , donc bien avant l’âge de huit ans proposé initialement [4] .  De plus, les cloisons (ou septa) inter-alvéolaires subissent de profonds remaniements vasculaires combinant une extension du lit vasculaire et une fusion du système capillaire initialement double en un système simple occupant le centre du septum et faisant face simultanément à deux lumières alvéolaires.  Ces processus ont été particulièrement bien étudiés chez le rat [5, 6] qui représente de ce point de vue un bon modèle pour l’espèce humaine, car la formation des alvéoles y est entièrement postnatale. Ils se déroulent au cours des trois premières semaines de vie, et se caractérisent comme chez l’homme par une multiplication du nombre des alvéoles, un amincissement des septa interalvéolaires et une maturation de la microvascularisation. Ces trois semaines peuvent être séparées, sur des critères morphométriques et morphologiques, en trois phases :
 1 : de J1 à J4 : expansion des espaces aériens avec peu de modifications morpholologiques. 2 : de J4 à J13 : prolifération tissulaire avec formation des septa secondaires. 3 : de J13 à J21 : croissance équilibrée avec amincissement des septa interalvéolaires. A 21 jours, la formation alvéolaire est terminée.  1-2-1 La matrice extracellulaire (MEC) :              La matrice extracellulaire joue un rôle essentiel comme support du parenchyme pulmonaire, mais elle possède également un rôle dynamique en régulant la différenciation, l’organisation et les fonctions de nombreux types cellulaires. Elle constitue un réservoir de facteurs de croissance qui se trouvent piégés dans le réseau de macromolécules et peuvent être libérées dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. Le nom de matrice extracellulaire est un terme général qui comprend les composés de la lame basale et ceux du tissu conjonctif interstitiel .   La lame basale est formée par un assemblage de protéines matricielles telles que la laminine, le collagène de type IV (composant majeur des lames basales), les protéoglycanes à héparane sulfate et l’entactine qui sont déposées par les cellules épithéliales et certaines cellules mésenchymateuses [7] . La lame basale soutient l’épithélium de surface en jouant un rôle d’ancrage et de support mécanique aux cellules épithéliales, nécessaire au maintien d’une structure cohésive. Par ailleurs l’étroite interaction des composants de la lame basale avec les cellules par l’intermédiaire des intégrines permet l’échange de signaux intervenant dans l’adhérence, la migration, la prolifération et la différenciation cellulaires au cours des processus de cicatrisation et de morphogénèse.  Les composants macromoléculaires du tissu conjonctif interstitiel sont représentés par quatre types de macromolécules : les collagènes (60 à 70 % de la totalité du tissu conjonctif), les fibres élastiques (association de microfibrilles et d’élastine tissulaire), les glycoprotéines (dont laminine et fibronectine) et les protéoglycanes. Dans le tissu conjonctif interstitiel se retrouvent les glandes de la sous-muqueuse, les vaisseaux sanguins, les vaisseaux lymphathiques, les terminaisons nerveuses, les fibroblastes, les cellules inflammatoires…Cette matrice est synthétisée essentiellement par les fibroblastes. Les cellules épithéliales sont également capables de synthétiser certains constituants de la matrice extracellulaire.  Les contrôles réciproques entre matrice extracellulaire et cellules pulmonaires représentent des facteurs essentiels de la régulation des processus de développement pulmonaire [8] . Au cours du développement pulmonaire postnatal, la synthèse et le renouvellement de la matrice extracellulaire sont considérablement augmentés. Il est montré que jusqu’à 40% du collagène nouvellement formé chez le rat nouveau-né est retrouvé sous forme dégradée 6 heures plus tard [9] . Ce renouvellement rapide semble particulièrement important pour le collagène IV, constituant majeur des membranes basales.  
L’accumulation et l’organisation de la MEC sont déterminées non seulement par la synthèse et le dépôt de ses molécules, mais aussi par l’expression d’activités dégradant ses composés en exerçant un contrôle sur la proportion des constituants matriciels mais également sur leur assemblage; ainsi les molécules constitutives de la MEC sont sensibles à un certain nombre d’enzymes comme par exemple des collagénases spécifiques, membres de la famille des métalloprotéases matricielles, responsables en majeure partie de la dégradation des collagénes.  1-2-2 Interactions développement pulmonaire postnatal et MEC :   Après la naissance, la période de développement pulmonaire est caractérisée par une modification rapide de la matrice extra-cellulaire pulmonaire. Celle-ci est en particulier le siège d’une déposition d’élastine qui est un élément essentiel de l’alvéolisation. Les remaniements de la matrice sont en outre nécessaires aux phénomènes de migration cellulaire et de bourgeonnement. Ils jouent enfin un rôle essentiel dans les processus de réparation après lésion. Un métabolisme adapté et une organisation harmonieuse de la matrice au cours de cette période apparaissent donc indispensables à un développement pulmonaire normal [9, 10] . L’activité protéolytique de dégradation de la MEC résulte d’un équilibre entre les concentrations locales d’enzymes activées et de leur inhibiteurs endogènes. Une étude sur les métalloprotéases de la MEC a démontré le rôle important de ces enzymes et de leur inhibiteurs dans les processus de développement normal et pathologique de la MEC [11] .   Le poumon traverse ainsi dans les mois qui suivent la naissance, une période critique où toute agression risque d’interférer avec ce renouvellement harmonieux de la matrice extracellulaire et d’aboutir à des troubles du développement. Du fait de son immaturité et de sa plus grande fragilité, le poumon du prématuré est de ce point de vue particulièrement vulnérable.   1-3 Troubles du développement post-natal induits par une agression pulmonaire :   Les nouveau-nés prématurés développent très souvent une détresse respiratoire aiguë consécutive à un déficit en surfactant pulmonaire, substance lubrifiante et tensioactive qui empêche les alvéoles pulmonaires de s’effondrer sur elles-mêmes et facilite ainsi la respiration. Le surfactant, constitué d’une association de molécules (lécithine, phosphatidylglycérol, protéines « SP »…), est synthétisé par des cellules épithéliales alvéolaires, les pneumocytes de type II ; sa synthèse et sa secretion sont régulées par des molécules telles que des hormones de la glande surrénale (les glucocorticoïdes) ou encore les facteurs de croissance produits dans le poumon. Depuis des décennies, on traite cette affection par ventilation mécanique et augmentation de la fraction inspirée d’oxygène. Depuis une dizaine d’années s’est ajouté un traitement substitutif par surfactant exogène qui a considérablement amélioré le pronostic et réduit les complications. Les grands prématurés (moins de 30 semaines de grossesse) restent néanmoins exposés à une complication chronique
appelée « dysplasie broncho-pulmonaire » (DBP) ou maladie pulmonaire chronique du prématuré [12] . Celle-ci se traduit par une altération de la croissance pulmonaire et de l’alvéolisation avec des phénomènes d’inflammation et de fibrose [13] . Ainsi l’analyse morphométrique des poumons de nourrissons décédés de DBP montre des anomalies importantes du développement pulmonaire [14] : le nombre total d’alvéoles est de 5 à 10 fois inférieur à celui observé dans des poumons contrôles (décédés d’une pathologie non pulmonaire) et augmente peu avec l’âge, le diamètre alvéolaire est augmenté et la surface des voies aériennes est diminuée. La DBP peut nécessiter des semaines, voire des mois de ventilation assistée et aboutir à une réduction irréversible du capital pulmonaire. Son apparition semble résulter de diverses agressions (extension excessive du tissu, hyperoxie, infections associées…) sur un organe particulièrement fragile.  Bien qu’il existe peu de modèles animaux reproduisant tous les aspects de la DBP, de nombreux modèles animaux expérimentaux d’agression pulmonaire ( en majorité chez le rat) qui miment certains aspects ont été développés, tels qu’une infection virale [15, 16] , une exposition prolongée à l’hypoxie ou à l’hyperoxie [17] , ainsi qu’une dénutrition. Ils ont permis de démontrer et d’étudier les mécanismes de cette susceptibilité particulière du poumon en croissance. Les lésions sont en particulier dominées par un épaississement des parois interalvéolaires et une diminution importante du nombre de septa secondaires. Le rôle de divers médiateurs, notamment ceux de l’inflammation, a été étudié, mais reste imparfaitement compris. Des protéases sont surtout impliquées dans la phase d’initiation de la réaction inflammatoire (phase vasculaire). Elles interagissent dans les systèmes de la coagulation, le système contact, la fibrinolyse, l’activation du complément. Des sérines protéases et surtout des métalloprotéases, stimulées par les cytokines inflammatoires, agissent aux étapes ultérieures. En participant à la protéolyse matricielle, elles favorisent les migrations des cellules au sein de la matrice extracellulaire. Aussi notre laboratoire s’est intéressé au rôle des enzymes qui remanient la matrice extra-cellulaire.  1-4 Métalloprotéases, lésions de la matrice extra-cellulaire et troubles du développement pulmonaire :  1-4-1      Structure des métalloprotéases de la matrice extracellulaire :  Plusieurs familles d’enzymes protéolytiques interviennent dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques (embryogenèse, cicatrisation cutanée, progression tumorale) : elles sont capables de remodeler la matrice extracellulaire et de modifier les interactions entre cellules et matrice [18] .  Les protéases humaines sont regroupées en quatre familles selon la nature du résidu acide aminé du site actif de l’enzyme : les cystéine-protéases, les aspartate-protéases, les sérines-protéases et les métalloprotéases dont le site actif renferme un ion métallique Zn 2+ ou plus rarement Cu 2+ .
Parmi ces protéases, les métalloprotéases et plus particulièrement celles de la matrice extracellulaire (MMP pour matrix metalloproteinases ) [19]  sont classées en plusieurs sous-familles selon leur structure primaire et leur spécificité. Il est apparu que ces MMP sont les acteurs majeurs de la dégradation de la MEC [20] . Elles se caractérisent comme une famille d’endopeptidases calcium-zinc dépendantes, capables de dégrader les différents composants de la matrice extracellulaire c’est-à-dire de l’interstitium et des membranes basales. Elles sont synthétisées et secrétées par de nombreux types cellulaires et jouent un rôle important dans tous les processus de remaniement tissulaire, normaux ou pathologiques. Les MMP sont dans la grande majorité secretées sous forme latente et sont ensuite activées dans l’environnement péricellulaire ou extracellulaire. Une régulation adaptée de leur activité au niveau du poumon semble donc capitale au cours du développement postnatal, afin de préserver le renouvellement harmonieux et intense de la matrice durant cette période.
Les métalloprotéinases de la matrice extracellulaire (MPM) présentent les caractéristiques communes suivantes :
-       Une structure homologue indiquant qu’elles sont issues d’un gène ancestral commun.
-       La présence d’un ion zinc impliqué dans le mécanisme catalytique de l’enzyme.
       Une synthèse et une sécrétion sous forme inactive (pro-enzyme ou zymogène). -
-       Une activation extracellulaire pour exercer leur action de dégradation.
       Une capacité à dégrader les composants de la matrice extracellulaire in vivo ; l’activité des -MMP est maximale à pH neutre (protéinases neutres) et nécessite obligatoirement la présence de Ca 2+ .
-       Leur inhibition par une famille d’inhibiteurs spécifiques : les inhibiteurs tissulaires des MMP (TIMP pour tissue inhibitors of metalloproteinases ).
Le nombre total des métalloprotéases de la matrice extracellulaire identifiées à ce jour s’élève à 23 [21] .
La protéine de chaque MMP (exceptée la MMP-23) comporte plusieurs domaines. Le premier domaine en N-terminal est un propeptide  (séquence d’environ 80 acides aminés) qui maintient l’enzyme sous forme inactive lors de sa synthèse dans le milieu extracellulaire (zymogène). Le propeptide est secondairement clivé in vivo, libérant le domaine catalytique pour permettre son interaction avec le substrat.
Faisant suite au propeptide le domaine catalytique  (environ 170 acides aminés) contient le site actif de l’enzyme auquel est fixé un ion zinc qui se dissocie lors de l’activation de la protéine. Le domaine catalytique est impliqué dans la spécificité de substrat des MMP.
Le troisième domaine retrouvé à la partie C-terminale  de toutes les MMP (sauf la
matrilysine) hemopexin-like  ou vibronectin-like est composé d’environ 210 acides aminés et possède d’importantes homologies structurales avec la famille des hémopexines et avec la vibronectine. Il a pu être démontré que ce domaine médiait la liaison des gélatinases A et B avec TIMP-1 et TIMP-2, mais aussi la liaison de la progélatinase A avec TIMP-2 et de la progélatinase B avec TIMP-1. Ce domaine hemopexin-like est également important pour la  spécificité de reconnaissance du substrat : les collagénases délétées de leur domaine C-terminal conservent leur capacité à dégrader des substrats non spécifiques (caséine par exemple), mais perdent leur capacité à dégrader le collagène [22] .
D’autres domaines peuvent exister selon les MMP comme le domaine trans-membranaire qui caractérise les métalloprotéinases membranaires (MT-MMP).
1-4-2 Gélatinases A et B et leurs inhibiteurs spécifiques:
Parmi les collagénases, deux gélatinases ont un spectre d’activité similaire et sont caractérisées par leur capacité à dégrader le collagène fibrillaire dénaturé (gélatine) ; il s’agit de la gélatinase A (MMP-2, 72 kDa) et de la gélatinase B (MMP-9, 92 kDa). Toutes deux clivent par ailleurs les collagènes natifs de type IV, V,VII et X ainsi que la fibronectine, l’élastine insoluble et les protéoglycanes. La capacité élastolytique de la gélatinase B est environ 30% de celle de l’élastase du polynucléaire neutrophile [23] .
Les gélatinases A et B possèdent au sein de leur domaine catalytique un domaine fibronectin-like , constitué par trois répétitions d’une séquence identique à celle du domaine de type II de la fibronectine. La fonction de ce domaine permet la liaison des gélatinases à la gélatine [24] ainsi qu’à élastine [25]  . La gélatinase B possède également un domaine collagen-like  à la partie C-terminale dont la fonction n’est pas connue à ce jour.
 La MMP-2 a été décrite en premier par L.A. Liotta et coll. en 1979 [26]  qui ont mis en évidence cette enzyme secrétée par un tumeur murine. Elle est synthétisée de façon constitutive par un grand nombre de cellules différentes dont les fibroblastes et dans une moindre mesure par les ostéoblastes. Son processus d’activation diffère de celui des autres MMP car il fait intervenir une autre MMP trans-membranaire, la MT1-MMP ainsi que l’inhibiteur de la MMP9 : le TIMP-2. Le domaine C-terminal du TIMP-2 se liant au domaine catalytique de la MT-MMP formerait un complexe qui agirait comme un récepteur pour la proMMP-2 par fixation à son domaine C-terminal. Ceci laisse supposer que le TIMP-2 joue un double rôle : d’une part il agit comme un inhibiteur spécifique des MMP, d’autre part il est impliqué dans le mécanisme d’activation de la MMP-2 [27] . La MMP-2 est capable d’activer la MMP-9 et la MMP-13 [28] . Elle joue un rôle dans l’invasion tumorale, la prolifération, la différenciation, l’adhérence et la migration .
La MMP-9  a été découverte en 1974 dans les neutrophiles [29]  ; elle a une spécificité de substrats très semblables à ceux de la MMP-2. La synthèse de la MMP-9 est inductible au sein de la lignée monocyte-macrophage, des éosinophiles, des kératinocytes et des cellules mésothéliales. Le contrôle de la synthèse des gélatinases est spécifique du type cellulaire : si la production des MMP-2 et 9 par
le macrophage alvéolaire n’est influencée ni par IL-1 b ni par TNF-a, ces mêmes cytokines augmentent la synthèse de ces deux gélatinases par les fibroblastes. À l’inverse, la synthèse des MMP-2 et 9 par le macrophage alvéolaire est stimulée par LPS, INF-g et IL-4, mais ces derniers sont sans effet sur la production des gélatinases par les fibroblastes. Le mécanisme exact de cette spécificité reste inconnu [30] . En dehors des nombreux composés de la MEC qu’elle dégrade, la MMP-9 régule aussi l’activité de cytokines et d’hormones puisqu’elle clive l’IL-1b et la substance P [31] , [32] . La MMP-9 joue un rôle important dans divers processus comme l’inflammation, la réparation, l’arthrite et l’invasion tumorale.
L’activité des MMP est controlée par quatre inhibiteurs spécifiques constituant la famille multigénique des TIMP ( tissue inhibitor of metalloproteinases ) [33] et à moindre degré par l’alpha-2 macroglobuline. Chaque molécule de TIMP se compose de deux domaines structuraux distincts : le domaine N-terminal qui confère l’activité inhibitrice et le domaine C-teminal qui se lie au domine C-terminal de certaines MMP. Les TIMP inhibent l’activité des MMP par formation d’un complexe non covalent ; cette liaison est très forte et se fait selon un rapport équimolaire. Seuls les TIMP-1 , 2 et 4 semblent jouer un rôle important auprès des MMP-2 et 9.
Le TIMP-1  (glycoprotéine de 28,5 kDa) se complexe à la quasi-totalité des MMP activées (collagénase interstitielle, gélatinase B, matrilysine, stromélysine) mais aussi à la progélatinase B. La fixation du TIMP-1 au domaine C-terminal de la progélatinase inhibe l’activation de cette dernière, mais n’empêche pas le complexe d’inhiber d’autres MMP. Le TIMP-1 est produit par de nombreux tissus embryonnaires, adultes ou tumoraux ; il a été retrouvé dans tous les liquides biologiques humains suggérant une fonction fondamentale et ubiquitaire.
Le TIMP-2 (protéine non glycosylée de 21 kDa) exerce une faible activité inhibitrice vis-à-vis de toutes les MMP, mais son rôle principal est d’interagir avec la forme active et la proforme de la gélatinase A en se fixant sur leur domaine C-terminal ; cette fixation retarderait l’activation de la progélatinase A. Le TIMP-2 est synthétisé de façon constitutive par les macrophages alvéolaires humains puis secrété sous forme libre dans le milieu. Cette synthèse est supprimée au niveau prétranscriptionnel par les principaux agents activateurs du macrophage (LPS, collagéne 1…), alors que ces mêmes facteurs augmentent au contraire la production de TIMP-1, de la collagénase interstitielle, de la gélatinase B et de la stromélysine par ces mêmes cellules. Le TIMP-2 est également synthétisé par les fibroblastes, mais excrété sous forme complexée avec la progélatinase A.
Le TIMP-3 (protéine non glycosylée de 24 kDa) demeure difficile à extraire des tissus mais il semblerait qu’il se fixe aux composants de la matrice extracellulaire [33] .
Le TIMP-4 (protéine de 22 kDa) peut se fixer sur le domaine C-terminal de la proMMP2 de manière similaire au TIMP 2 [34] . Mais le profil d’expression du TIMP-4 dans les tissus adultes humains montre un fort taux de transcrits dans le cœur et le cerveau et un niveau faible voire non détectable au niveau des autres organes.
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