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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE, DE LA RECHERCHE ET DE LA TECHNOLOGIE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Géraldine DESCAMPS Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ANALYSE DU REMANIEMENT DU GENE DES CHAINES LOURDES DES IMMUNOGLOBULINES DANS LE MYELOME MULTIPLE PAR HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE SUR FIBRES D'ADN Soutenu le 19 décembre 2001, devant le jury suivant : Pr. J.C. GLUCKMAN - Président Pr. S. RICHARD - Rapporteur Pr. R. BATAILLE - Examinateur Pr. H. AVET-LOISEAU - Examinateur Laboratoire de : Génétique Oncologique Directeur : Pr S. RICHARD E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) e-mail : Faculté de Médecine Paris-Sud 63, av Gabriel Péri 94276 LE KREMLIN BICETRE Laboratoire de : Hématologie C.H.U. de Nantes Directeur : Pr R. BATAILLE Institut de Biologie e-mail : 9, quai Moncousu EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : samedi 1 décembre 2001
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MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE, DE LA RECHERCHE ET DE LA TECHNOLOGIE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Géraldine DESCAMPS Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
 ANALYSE DU REMANIEMENT DU GENE DES CHAINES LOURDES DES IMMUNOGLOBULINES DANS LE MYELOME MULTIPLE PAR HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE SUR FIBRES D’ADN  Soutenu le 19 décembre 2001, devant le jury suivant : Pr. J.C. GLUCKMAN - Président Pr. S. RICHARD - Rapporteur Pr. R. BATAILLE - Examinateur Pr. H. AVET-LOISEAU - Examinateur  Laboratoire de : Génétique Oncologique Directeur : Pr S. RICHARD E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) e-mail : stephane.richard@kb.u-psud.fr Faculté de Médecine Paris-Sud 63, av Gabriel Péri 94276 LE KREMLIN BICETRE Laboratoire de : Hématologie C.H.U. de Nantes Directeur : Pr R. BATAILLE Institut de Biologie e-mail : frb@inserm.nantes.fr 9, quai Moncousu
44093 NANTES Cedex 01 ANALYSE DU REMANIEMENT DU GENE DES CHAINES LOURDES DES IMMUNOGLOBULINES DANS LE MYELOME MULTIPLE PAR HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE SUR FIBRES D’ADN. Géraldine DESCAMPS Mémoire soutenu le 19 décembre 2001  RESUME
 Le myélome multiple est une lymphopathie B dans laquelle des plasmocytes s’accumulent au niveau de la moelle osseuse, produisant une immunoglobuline monoclonale, le plus souvent de type G ou A. En France, le myélome multiple est à l’origine de 1 % des décès par cancer et est responsable de la mort d’approximativement 2000 personnes par an. Les anomalies cytogénétiques dans le myélome multiple sont nombreuses et parfois complexes. La région codant pour le gène des chaînes lourdes des immunoglobulines en 14q32 est impliquée dans la plupart des lignées et patients étudiés. Les réarragements impliquant ce locus sont fréquents, et leur rôle dans la physiopathologie de la maladie reste inconnu. Certaines anomalies ne sont pas visibles par les techniques de cytogénétique conventionnelle. En utilisant des techniques plus récentes comme l’hybridation in situ en fluorescence sur noyaux interphasiques, nous avons montré que des remaniements du gène des chaînes lourdes des immunoglobulines étaient retrouvés chez 74 % des patients. Deux partenaires sont plus particulièrement impliqués : la région 11q13 chez 16 % des patients (impliquant le gène de la cycline D1) et la région 4p16 (impliquant le gène FGFR3).L’obtention de métaphases étant difficile chez les patients, et afin de préciser au mieux ces réarrangements, nous avons étudié cette région sur des lignées et chez des patients par la technique d’hybridation in situ en fluorescence sur fibres d’ADN. Cette technique a été récemment décrite sous différentes formes, et repose sur le déroulement des fibres d’ADN, généralement après un traitement protéolytique modéré. Ensuite, les fibres d’ADN sont étirées mécaniquement puis hybridées avec des sondes spécifiques des régions D H , J H  et C H marquées à la biotine ou à la digoxigénine, révélées par des fluorochromes différents. Le signal obtenu est sous forme de " code-barre " génétique. La très grande majorité des translocations implique les zones switch situées en amont de chaque gène de la région constante. Ainsi, une translocation est visualisée par l’interruption de ce " code-barre ". Nos résultats confirment la localisation des points de cassure en majorité au niveau des zones switch, mais également en amont de Yg et au niveau des régions VDJ. Ils démontrent aussi la dispersion des points de cassure au niveau des gènes partenaires.  MOTS CLES : fiber-FISH, myélome multiple, chaînes lourdes d’immunoglobulines, cytogénétique
SOMMAIRE
          
 INTRODUCTION  1 Le myélome multiple 1.1 Définition 1.2 Épidémiologie 1.3 Oncogenèse 1.4 Études cytogénétiques  2 Le gène des chaînes lourdes des immunoglobulines 2.1 Différenciation indépendante de l’antigène  2.2 Différenciation dépendante de l’antigène    3 Les gènes partenaires du gène IgH  3.1 CCND1  3.2 FGFR3  3.3 c-maf  3.4 c-myc    4 L’Hybridation In Situ en Fluorescence  4.1 FISH sur noyaux interphasiques et métaphases  4.2 FISH sur fibres d'ADN    5 But du travail       
ABRÈVIATIONS
ADN : Acide désoxyribonucléique. ARN : Acide ribonucléique. BSA : Bovine Serum Albumin. CCND1 : Cycline D1. DAPI : 4’-6-diamidino-2-phénylindole. EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique. FGFR3 : Fibroblast Growth Factor Rece 3.
FISH : Hybridation in situ en fluorescence. FITC : Isothiocyanate de fluorescéine. Ig : Immunoglobuline. IgH : Chaîne lourde des immunoglobulines. IL-6 : Interleukine 6. kb : Kilobase(s). MM : Myélome Multiple. MTC : Major Translocation Cluster. PAC : P1 Artificial Chromosome. PBS : Phosphate Buffered Saline. PCL : Leucémie plasmocytaire. SB : Southern Blot. SSC : Sodium Saline Citrate. YAC : Yeast Artificial Chromosome.     
1 Le Myélome Multiple
1.1 Définition
Le myélome multiple (MM) se définit comme une expansion plasmocytaire maligne, atteignant principalement la moelle osseuse, et par la production d’une immunoglobuline (Ig) monoclonale, le plus souvent G ou A (IgG ou IgA). La prolifération plasmocytaire s’accompagne d’une destruction osseuse, d’un déficit de la lymphopoièse B polyclonale normale, et parfois d’une insuffisance médullaire. La sécrétion d’une Ig monoclonale peut être responsable de manifestations rénales, neurologiques ou d’amylose. Le pronostic de la maladie est corrélé à la masse tumorale présente dans la moelle osseuse (Dreyfus B. et al., 1991 ; Bataille R. et Harousseau J.L., 1997 ; Hallek M. et al., 1998).  1.2 Épidémiologie L’incidence du MM aux É tats-Unis en 1989 était de 3,9 cas / 100 000 habitants. Le nombre de nouveaux cas détectés par an est en augmentation constante. Cette pathologie est deux fois plus commune chez les afro-américains que chez les caucasiens (Brunning R.D. et McKenna R.W., 1994). Le MM représente 1 % des tumeurs malignes et 10 % des hémopathies. Les hommes sont plus souvent affectés que les femmes avec un taux d’environ 3 pour 2. Le MM est rarement diagnostiqué chez des individus de moins de 35 ans. L’incidence augmente avec l’âge, avec une médiane à 70 ans. La médiane de survie du MM reste de l’ordre de 40 mois mais l’évolution peut être extrêmement variable. En France, le MM est à l’origine de 1 % des décès par cancer et est responsable de la mort d’approximativement 2000 personnes par an (Facon T., 1997).
Les causes du MM restent obscures, cependant, plusieurs observations présentent un intérêt. Il existe un lien étroit entre la découverte d’une gammapathie monoclonale d’origine indéterminée (ou MGUS) et la survenue d’un MM. Ces MGUS sont caractérisées par la présence d’une Ig monoclonale généralement G ou A sans aucun autre signe de MM, et en particulier, en l’absence de lésions osseuses. Ce type de gammapathie est commun. Rare avant 50 ans, l'incidence est de 1 % entre 50 et 60 ans, pour atteindre 5 % après 80 ans. Un suivi à long terme (de 30 ans et plus) de ces patients a montré un taux de transformation en MM de 1 % par an. On peut donc penser que le MM est la conséquence de deux évènements oncogéniques successifs : le premier précoce, entraîne la survenue d’une gammapathie monoclonale, et le second, plus tardif, conduit au MM, certains patients courtcircuitant la première étape et présentant d’emblée un MM (Bataille R. et Harousseau J.L., 1997 ; Avet-Loiseau H. et al., 2000). Des facteurs liés à l’environnement ont été incriminés tels l’irradiation atomique ou l’exposition professionnelle à certains carcinogènes chimiques (Dreyfus B. et al., 1991).
 1.3 Oncogenèse Les plasmocytes prolifèrent lentement dans la moelle osseuse. Ils sont dépendants de facteurs de croissance dont l’interleukine 6 (IL-6), fournis par le micro-environnement tumoral. Il existe trois phases évolutives dans le MM. Elles sont associées à des évènements oncogéniques différents : la phase initiale correspondrait, entre autres, à la translocation du gène IgH, puis la phase chronique où des mutations de l’oncogène ras (N-ras et K-ras) interviennent, et enfin, la phase extra-médullaire, ou accélérée, où l’oncogène p53 subit des mutations. La dérégulation de c-myc serait impliquée dans l’immortalisation du clone tumoral. Les mutations de N-ras et K-ras, rencontrées dans 9 à 30 % des MM, provoquent leur indépendance vis à vis des facteurs de croissance dont l’IL-6 et les phénomènes d’apoptose sont supprimés. Les mutations du gène p53 bloquent l’apoptose des plasmocytes et bloquent leur différenciation au stade terminal (Bataille R. et Harousseau J.L., 1997 ; Hallek M. et al., 1998).  1.4 Études cytogénétiques Les études cytogénétiques de nombreux patients atteints de MM ont permis de définir de nombreuses anomalies chromosomiques : gains ou pertes de matériel chromosomique, translocations, insertions ou délétions. Plus de 90 % des patients présentent une aneuploïdie (Zandecki M. et al., 1996 ; Smadja N.V. et al., 1998). La cytogénétique conventionnelle ne détecte que 30 à 50 % des anomalies chromosomiques (Hallek M. et al., 1998 ; Ronchetti D. et al., 1999), du fait du faible indice de prolifération des plasmocytes lorsqu’ils sont mis en culture, et de la médiocre qualité des quelques mitoses obtenues. Une des anomalies de structure les plus fréquemment rencontrées (20 à 40 % des cas) concerne la région 14q32 où est situé le gène codant pour les chaînes lourdes des Ig. Ce marqueur, noté 14q+, est la conséquence de translocations impliquant le locus IgH. Plus de vingt régions chromosomiques
partenaires lui sont à ce jour associés. Cependant, dans la plupart des cas, le partenaire n’est pas identifié (Hallek M. et al., 1998).  Des études plus récentes utilisant l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) ont montré un réarrangement en 14q32 dans 74 % des patients atteints de MM et dans 90 % des lignées cellulaires dérivées de MM (Bergsagel P.L. et al., 1996 ; Nishida K. et al., 1997 ; Kuipers J. et al., 1999). Ces études ont aussi permis la détection de nouveaux loci partenaires (Nishida K. et al., 1997 ; Chesi M. et al., 1998b ; Avet-Loiseau H. et al., 1999 ; Janssen J.W.G. et al., 2000). Les gènes partenaires les plus fréquemment rencontrés sont : CCND1 en 11q13 dans 16 % des cas (Avet-Loiseau H.), FGFR3 en 4p16 dans environ 10 % des cas (Avet-Loiseau H.), puis, en plus faible pourcentage : c-maf en 16q23 (Chesi M. et al., 1998a), c-myc en 8q24 (Shou Y. et al., 2000), et d’autres gènes de façon plus isolée : 1p13, 1q21, 3p11, 6p21, 6p25, 7q11, 7q32, 9p13, 11q23, 12p11, 11p13, 12q24, 13q22, 16q24, 18q21, 21q22, 22q11, Xq28 (Bergsagel P.L. et al., 1996 ; Avet-Loiseau H. et al., 1997 ; Nishida K. et al., 1997 ; Avet-Loiseau H. et al., 1999).  
2 Le gène des chaînes lourdes des immunoglobulines
L’ensemble des gènes présidant à la synthèse des chaînes lourdes des Ig sont, chez l’homme, sur le chromosome 14 (en 14q32). La synthèse d’une chaîne lourde nécessite l’intervention de quatre gènes, un gène V H  ou gène variable, un gène D H ou gène de diversité, un gène J H ou gène de jonction et un gène C H ou gène de la partie constante. Ces fractions sont organisées dans cet ordre sur le chromosome 14, du télomère vers le centromère. L’homme possède environ 100 gènes V H . Chacun est précédé par une courte séquence, la séquence leader (L), séparée du gène V H  par un court intron qui est excisé lors de la maturation de l’ARN messager. Il existe 27 gènes D H et 6 gènes J H . Enfin, les gènes C H  codant chacun des isotypes sont regroupés sur environ 200 kb. Ils s’organisent dans l’ordre suivant, du télomère au centromère : Cµ-d, Cg3, Cg1, Ye, Ca1, Yg, Cg2, Cg4, Ce et Ca2 (Kaplan J.C. et Delpech M., 1993 ; Solal-Céligny P. et al., 1997). Chaque gène de la partie constante, sauf Cd et les pseudogènes Ye et Yg, est précédé d’une séquence S (pour switch) constituée de quelques dizaines de paires de bases située un à deux kb en 5'.  2.1 Différenciation indépendante de l’antigène
Les lymphocytes B naissent et se différencient dans la moelle osseuse à partir des cellules souches hématopoïétiques totipotentes et capables de s’autorenouveler. Le précurseur le plus immature engagé dans la différenciation B, appelé cellule pro-B, a réarrangé partiellement les gènes D-J. Cette première recombinaison se fait entre l’un des gènes D H et l’un des gènes J H . Une seconde recombinaison met bout à bout l'un des gènes V H  et le complexe D-J résultant de la première recombinaison. La cellule est alors au stade pré-B.
Deux gènes sont impliqués dans la recombinaison : RAG-1 et RAG-2 (Recombination Activating Gene). Ils codent pour des endonucléases indispensables à la recombinaison des séquences complémentaires constituées d’un heptamère et d’un nonamère situées en 3’ des gènes V H , en 3’ et 5’ des gènes D H , et en 5’ des gènes J H (Lassoued K. et Benlagha K., 1995). L’ADN intermédiaire est excisé sous forme de boucle. La Tdt (Terminal deoxynucleotidyl transférase) permet l’insertion de nucléotides aux jonctions VD et DJ, et augmente la diversité de la recombinaison (Kaplan J.C. et Delpech M., 1993 ; Lassoued K. et Benlagha K., 1995 ; Solal-Céligny P. et al., 1997 ; Vanasse G.J. et al., 1999). Si la première recombinaison, tentée sur l’un des deux chromosomes pris au hasard, est réussie : le réarrangement est productif. Une chaîne fonctionnelle peut alors être synthétisée. Le second chromosome n’est pas recombiné et ne pourra pas s’exprimer. Ce phénomène est l’exclusion allélique. Au contraire, si le réarrangement est abortif, une nouvelle recombinaison est tentée sur le deuxième chromosome. Chaque cellule pré-B n’exprimera donc qu’une seule chaîne lourde dans son cytoplasme. Si le réarrangement VDJ n’est fonctionnel sur aucun des allèles, la cellule est éliminée par apoptose.  Au sein du lymphocyte pré-B, après la constitution d’un gène de chaîne lourde µ fonctionnel, la recombinaison au niveau des gènes des chaînes légères est effectuée : d’abord kappa, puis lambda en cas d’échec. L’ensemble des gènes codant pour les chaînes kappa sont situés sur le chromosome 2. La synthèse d’une chaîne légère kappa nécessite l’intervention de trois gènes : un gène V, un gène J et le gène C. Contrairement aux gènes codant pour les chaînes lourdes, il n’y a pas de gène D. La recombinaison se fait entre l’un des 300 gènes V pris au hasard et l’un des cinq gènes J pris lui aussi au hasard. Le complexe V-J ainsi formé est ensuite associé à l’unique gène C qui ne contient pas d’intron. Les mécanismes de recombinaison sont les mêmes que ceux des chaînes lourdes. L’ensemble des gènes codant pour les chaînes légères lambda sont situés sur le chromosome 22. Les mécanismes de synthèse et de diversité des chaînes lambda sont identiques à ceux décrits pour les chaînes kappa. Seuls l’organisation et le nombre de gènes sont différents. Il existe au moins six gènes C différents, chacun étant précédé d’un seul gène J qui lui est propre (Kaplan J.C. et Delpech M., 1993).  2.2 Différenciation dépendante de l’antigène
Dans le centre germinatif, sous l’action de diverses cytokines et en étroite collaboration avec les cellules T et les cellules dendritiques, la cellule B va poursuivre sa différenciation, tout d’abord en centroblaste, puis en centrocyte. Cette maturation cellulaire s’accompagne de modifications du gène IgH, qui subit alors le processus de mutation somatique. Ce processus est spécifique des cellules B et ne concerne que les cellules B ayant préalablement réarrangé fonctionnellement leurs segments V, D et J. Ces mutations apparaissent au sein des régions variables, à un taux d’environ 1/1000 paires de bases par génération. Il en résulte une augmentation supplémentaire de l’affinité du récepteur pour l’antigène (Bakkus M.H.C. et al., 1992 ; Vanasse G.J. et al., 1999 ; Avet-Loiseau H. et al., 2000). Les mutations somatiques au niveau du gène des Ig sont localisées dans une région d’approximativement 1,5 kb en 3' du promoteur. Les mécanismes de mutation concernent les extrémités libres de l’ADN et consistent en la substitution de nucléotides. Elles peuvent être silencieuses ou résulter d’un changement de l’acide aminé qui change l’affinité du site de liaison de
l’Ac pour l’Ag (Stewart A.K. et Schwartz R.S., 1994). De récentes études ont également démontré que des insertions ou des délétions pouvaient être fréquentes (Goossens T. et al., 1998 ; Wilson P.C. et al., 1998). Les cellules, maintenant appelées centrocytes, sont sélectionnées positivement par l’antigène. Les centrocytes ayant un récepteur de moindre affinité ou non fonctionnel (du fait de mutations non fonctionnelles) meurent. C’est à ce stade que la commutation isotypique a lieu. La cellule, qui sécrétait une IgM, va alors sécréter une Ig d’une nouvelle classe : IgG, IgA ou plus rarement IgE. Cette commutation isotypique fait intervenir des processus délétionnels au niveau des régions répétées appelées zones " switch "  . Ces régions sont situées en amont (côté 5’) de chacune des régions constantes à l’exception de la région Cd et des pseudogènes. Cette recombinaison somatique se produit entre la séquence S du gène µ et l’une des séquence S des gènes codant pour la partie constante des autres isotypes (g, a ou e). L’ADN entre ces deux séquences est alors délété sous forme de boucle d’excision (Liu Y.J. et al., 1996). Cette nouvelle recombinaison est le switch. Grâce à cette recombinaison, la partie constante se trouve associée au complexe VDJ précédemment formé. Ces deux évènements, les mutations somatiques et la commutation isotypique, sont probablement à la base des translocations. Le switch ne modifie pas la spécificité du lymphocyte puisque seule la région constante de l’Ig est substituée. Deux types de cellules sont alors générés : des cellules mémoires (qui garderont le souvenir du contact avec l’antigène) et des plasmocytes (cellules sécrétrices d’une grande quantité d’anticorps spécifiques de l’antigène).  
3 Les gènes partenaires du gène IgH
Dans le MM, les anomalies cytogénétiques sont nombreuses et parfois complexes. La région 14q32 est impliquée dans la plupart des lignées et patients déjà étudiés. Certaines anomalies ne sont pas visibles avec les techniques de cytogénétique conventionnelle. Grâce à des techniques plus résolutives comme la FISH et le Southern Blot (SB), de nouveaux réarrangements avec de nouveaux partenaires ont pu être mis en évidence.  3.1 CCND1
Le gène de la cycline D1 (CCND1), localisé sur le chromosome 11 en 11q13, est un oncogène intervenant dans le cycle cellulaire au niveau de G1-S (Motkura T. et al., 1991 ; Sherr C.J., 1993). La translocation t(11;14) est retrouvée dans au moins 90 % des lymphomes du manteau et conduit à l’hyperexpression du gène CCND1. Les points de cassure en 11q13 sont situés pour la plupart au niveau de la région MTC (Major Translocation Cluster) et au niveau de J H  pour le chromosome 14 (Chesi M. et al., 1996). Dans le MM, cette translocation est retrouvée chez 16 % des patients et dans environ 25 % des lignées. La localisation des points de cassure en 11q13 est variable mais rarement
en MTC. Par contre, sur le chromosome 14, ce sont les zones switch qui sont le plus souvent impliquées (Ronchetti D. et al., 1999).  3.2 FGFR3 Le gène FGFR3 (Fibroblast Growth Factor Receptor 3), localisé sur le chromosome 4 en 4p16, est un oncogène membre de la famille des récepteurs de type tyrosine-kinase qui intervient dans la prolifération, la différenciation et la migration des fibroblastes. La translocation t(4;14) est rencontrée dans environ 25 % des lignées cellulaires de MM (Chesi M. et al., 1997 ; Avet-loiseau H. et al., 1999). Elle n’est pas retrouvée par cytogénétique conventionnelle car elle implique les régions télomériques des deux chromosomes : 4p16.3 et 14q32.3. Les points de cassure en 4p16 sont dispersés sur une région de 70 kb, à moins de 100 kb du gène FGFR3 (Richelda R. et al., 1997 ; Finelli P. et al., 1999). Un autre gène situé en 4p serait impliqué dans la translocation et serait lui aussi hyperexprimé : MMSET (Multiple Myeloma SET domain) (Chesi M. et al., 1998b). Ce facteur de transcription est exprimé dans les tissus embryonnaires à croissance rapide.  3.3 c-maf Le gène c-maf, localisé en 16q23, est un oncogène membre de la grande famille des facteurs de transcription basic zippers qui est impliquée dans de nombreux processus de base comme la prolifération et la différenciation cellulaires. La translocation t(14;16) est retrouvée dans 25 % des lignées cellulaires de MM (6 lignées sur 21). Les points de cassure en 16q23 sont dispersés sur une région d’environ 1350 kb, comprenant c-maf. Comme pour la translocation t(4;14), la translocation t(14;16) n’est pas détectée en cytogénétique conventionnelle car elle implique les régions télomériques des deux chromosomes : 14q32.3 et 16q23 (Chesi M. et al., 1998a). 3.4 c-myc Le gène c-myc (homologue cellulaire de v-myc), localisé en 8q24, joue un rôle important dans le contrôle de la prolifération, de la différenciation et de l’apoptose. Dans le MM, le locus de c-myc est rarement impliqué comme partenaire de translocation du locus IgH (dans moins de 5 % des cas) (Kuehl W.M. et al., 1997 ; Hallek M. et al., 1998). Si la translocation n’est pas fréquente, sur 20 lignées cellulaires de MM étudiées, 19 d’entre elles présentent des anomalies caryotypiques du locus de c-myc. Ces anomalies peuvent aussi bien être des translocations complexes, des duplications de c-myc, que des insertions qui juxtaposent c-myc au locus IgH (Shou Y. et al., 2000). Les anomalies caryotypiques du locus de c-myc ont aussi été retrouvées chez des patients atteints de MM (Nishida K. et al., 1997 ; Avet-Loiseau H. et al., 1999).
4 L’Hybridation In Situ en Fluorescence ou FISH
4.1 FISH sur noyaux interphasiques et métaphases
La technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) a l’avantage de détecter des réarrangements génétiques sur les métaphases et les noyaux interphasiques. La FISH interphasique est particulièrement intéressante pour les réarrangements génétiques dans les pathologies où il est difficile d’obtenir des métaphases comme dans le cas du myélome. Les sondes utilisées sont directement couplées à un fluorochrome et se localisent sur un chromosome ou sur une bande chromosomique. Par conséquent, seules des sondes distantes de 1 Mb (1000 kb) ou plus peuvent être séparées par cette technique.  4.2 FISH sur fibres d'ADN La technique de fiber-FISH permet de détecter des réarrangements à une résolution beaucoup plus fine que la FISH interphasique puisque le support d'hybridation est la fibre d'ADN. Le signal obtenu est linéaire, sous forme de " code-barre " de la région étudiée. Grâce un standard interne (Senger G. et al., 1994), il est possible de déterminer l’orientation de certains gènes (Rosenberg C. et al., 1995), la présence de délétions (Herrick J. et Bensimon A., 1999), les réplications de matériel chromosomique et de localiser les points de cassure lors de translocation ou d'insertion (Erdel M. et al., 1999 ; Herrick J. et al., 2000).   De nombreux protocoles ont été publiés. La différence réside dans l’obtention et la fixation des fibres d’ADN.
 
La technique du halo (Wiegant J. et al., 1992) est basée sur la décondensation de l’ADN. Elle génère de grandes boucles d’ADN autour du noyau (donnant un aspect de halo). Cette technique a l’avantage de n’utiliser que peu de cellules (25 000 par lame). La méthode DIRVISH (DIRect VISual Hybridization) décrite par Parra I. et Windle B. (1993) utilise un détergent pour lyser les cellules. Une goutte, contenant l’ADN, est placée sur le bord de la lame qui est ensuite inclinée pour permettre à la goutte de glisser. L’ADN est ainsi étiré mais de façon non uniforme. De plus, peu de signaux sont détectés. La lecture et l’interprétation sont donc rendues difficiles. Le "combing moléculaire" utilise des cellules emprisonnées dans des blocs d'agarose digérés par l'agarase. La solution d'ADN est placée dans un réservoir en Téflon ® . Des lamelles silanisées sont plongées dans la solution d'ADN pendant 5 minutes puis remontées à une vitesse constante de 300 mm/s. Les fibres, ancrées par une de leur extrémité à la lamelle, sont alors étirées. L’étirement obtenu est constant, de l’ordre de 2 kb/µm. La fixation de l’ADN sur les lamelles dépend de la qualité de préparation des surfaces et du pH de la solution contenant l’ADN (Bensimon A. et al., 1994 ; Allemand F. et al., 1997 ; Michalet X. et al., 1997; Herrick J. et Bensimon A., 1999). La méthode proposée par Heiskanen M. et al. (1994, 1995, 1996) permet d’hybrider des fibres d’ADN obtenues à partir de cellules incluses dans des blocs d’agarose. Après un traitement protéolytique des blocs, les fibres d’ADN sont étirées manuellement sur une lame poly-L-lysine.
5 But du travail
La fiber-FISH permet d'étudier des remaniements génétiques de façon beaucoup plus précise que la FISH interphasique ou métaphasique. Un véritable "code barre" du gène est établi. Une translocation, ou autres remaniements, sera visualisée par une interruption ou une modification de ce "code barre". Dans notre modèle, le myélome multiple, le gène IgH est réarrangé chez 70-75 % des patients. La très grande majorité des translocations implique les zones switch situées en amont de chaque gène de la région constante (excepté pour Cd et les pseudogènes Ye et Yg). Appliquée au myélome, cette technique devrait nous permettre de répondre à de nombreuses questions sur les réarrangements moléculaires du gène IgH dans les cellules plasmocytaires malignes La fiber-FISH va permettre d'analyser finement les sites de translocation. Quel allèle concernent-elles ? Les deux allèles peuvent-ils être réarrangés ? Si oui, le sont-ils de la même façon ? Toutes les translocations impliquent-elles une zone switch ? Y a-t-il une corrélation avec l'Ig produite ? Les points de cassure sur le chromosome partenaire sont-ils dispersés ou, au contraire, concentrés sur une région?
 
BIBLIOGRAPHIE
 
ALLEMAND J.F., BENSIMON D., JULLIEN L., BENSIMON A., CROQUETTE V. (1997) - pH-dependent specific binding and combing of DNA. Biophys. J ., 73 : 2064-2070. AVET-LOISEAU H., BRIGAUDEAU C., TALMANT P., LAÏ J.L., DAVIET A., PRALORAN V., RAAP M.J., HARROUSSEAU J.L., FACON T., BATAILLE R. (1997, abstr, suppl 1) - High incidence of Ig heavy chain gene rearrangements with various partner chromosomes in multiple myeloma, as shown by molecular cytogenetics. Blood , 90 : 89a. AVET-LOISEAU H., BRIGAUDEAU C., MORINEAU N., TALMANT P., LAÏ J.L., DAVIET A., LI J.Y., PRALORAN V., RAAP M.J., HARROUSSEAU J.L., FACON T., BATAILLE R. (1999) - High incidence of cryptic translocations involving the Ig heavy chain gene in multiple myeloma, as shown by fluorescence in situ hybridization. Genes Chromosomes Cancer , 24 (1) : 9-15. AVET-LOISEAU H., MINVIELLE S., BATAILLE R. (2000) – Translocations impliquant le gène codant pour les chaînes lourdes d’immunoglobulines dans le myélome multiple : un phénomène universel ? Hématologie , 6 (4) : 272-279. BAKKUS M.H.C., HEIRMAN C., VAN RIET I., VAN CAMP B., THIELEMANS K. (1992) – Evidence that multiple myeloma Ig heavy chain VDJ genes contain somatic mutations but show no intraclonal variation. Blood , 80 (9) : 2326-2335. BATAILLE R., HARROUSSEAU J.L. (1997) - Multiple myeloma. N. Engl. J. Med ., 336 (23) : 1657-
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