MINISTERE DE L'ÉDUCATION NATIONALE

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  • mémoire


MINISTERE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par GAËLLE LE DEZ pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études. RECHERCHE DE GÈNES EXPRIMÉS DE FAÇON DIFFÉRENTIELLE APRÈS TRAITEMENT PAR DE NOUVELLES MOLÉCULES ET IMPLIQUÉS DANS L'ARRÊT DE LA PROLIFÉRATION DES CELLULES CRISTALLINIENNES SRA 01/04. Soutenu le 05/07/2002 à 15 h devant le jury suivant : Monsieur Jean- Luc Vayssière - Président. Madame Sylvie Demignot - Rapporteur. Madame Patricia LASSIAZ - Examinateur. Monsieur Jean Claude JANNY - Examinateur. Laboratoire EPHE : Dr Sylvie DEMIGNOT INSERM U 505 Laboratoire de pharmacologie cellulaire et moléculaire Centre de recherches biomédicales des cordeliers 15 rue de l'école de médecine 75006 Paris e-mail Laboratoire d'accueil : Dr ROUSSAKIS Faculté des Sciences et Techniques ISOMER Laboratoire de Pharmacologie Marine. 2, rue de la Houssinière 44 000 Nantes e. mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • traitement

  • dependent kinase

  • arn acide ribonucléique

  • placenta humain

  • prolifération des cellules épithéliales

  • polymerase chain

  • cycle cellulaire

  • pco opacification de la capsule postérieure


Publié le : mercredi 30 mai 2012
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MINISTERE DE L’ÉDUCATION NATIONALE

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

MÉMOIRE
Présenté par
GAËLLE LE DEZ
pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études.

RECHERCHE DE GÈNES EXPRIMÉS DE FAÇON
DIFFÉRENTIELLE APRÈS TRAITEMENT PAR DE
NOUVELLES MOLÉCULES ET IMPLIQUÉS DANS
L’ARRÊT DE LA PROLIFÉRATION DES CELLULES
CRISTALLINIENNES SRA 01/04.


Soutenu le 05/07/2002 à 15 h devant le jury suivant :

Monsieur Jean- Luc Vayssière - Président. Madame Sylvie Demignot - Rapporteur. Patricia LASSIAZ - Examinateur. Monsieur Jean Claude JANNY -

Laboratoire EPHE :
Dr Sylvie DEMIGNOT
INSERM U 505
Laboratoire de pharmacologie cellulaire et moléculaire
Centre de recherches biomédicales des cordeliers
15 rue de l'école de médecine
75006 Paris
e-mail Sylvie.Demignot-u505@bhdc.jussieu.fr
Laboratoire d’accueil :
Dr ROUSSAKIS
Faculté des Sciences et Techniques
ISOMER
Laboratoire de Pharmacologie Marine.
2, rue de la Houssinière
44 000 Nantes
e. mail : christos.roussakis@isomer.univ-nantes.fr
EPHE Banque de Monographies SVT 1

ÉCOLE PRATIQUE DE HAUTES ÉTUDES - Sciences de la Vie et de la Terre
Département Biologie Cellulaire et Moléculaire - Laboratoire de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire.
RECHERCHE DE GÈNES EXPRIMÉS DE FAÇON DIFFÉRENTIELLE APRÈS
TRAITEMENT PAR DE NOUVELLES MOLÉCULES ET IMPLIQUÉS DANS
L’ARRÊT DE LA PROLIFÉRATION DES CELLULES CRISTALLINIENNES SRA
01/04.

Gaëlle Le Dez
RÉSUMÉ
Le cristallin, lentille naturelle de l’œil, est normalement transparent. Mais, le plus souvent avec l’âge,
il s’opacifie entraînant une diminution de l’acuité visuelle. C’est la cataracte. Le seul traitement
véritablement efficace passe par la chirurgie avec aspiration du contenu du sac cristallinien. Après
cette intervention, dans près de 50% des cas, une nouvelle opacification est observée, elle intéresse la
capsule postérieure, c’est la cataracte secondaire. Celle-ci est due à la prolifération de cellules
épithéliales restées après chirurgie. Le traitement actuel de référence pour la cataracte secondaire est
la dislocation des tissus au laser. Malheureusement, cette seconde intervention entraîne de
nombreuses complications et n’interrompt pas la prolifération des cellules épithéliales cristalliniennes.
Actuellement, seuls certains anticancéreux sont capables d’arrêter cette prolifération cellulaire comme
la daunomycine, la mitomycine C. Mais, ces molécules présentent une forte toxicité et entraînent de
nombreux effets secondaires. Pour développer de nouvelles thérapeutiques plus spécifiques des
cellules cristalliniennes, notre laboratoire s’intéresse à l’activité de nouvelles substances non
cytotoxiques. Nous avons recherché l'effet d’une molécule sur la prolifération de cellules épithéliales
de cristallin humain (Lignée SRA 01/04). Après criblage, nous avons établi son profil d'action
cellulaire qui est exprimé par la CI50, des tests cinétiques et par la cytométrie en flux. Cette molécule
s’est avérée très intéressante car elle a un effet de type cytostatique et induit un blocage des cellules
en phase G1 du cycle cellulaire. Ce travail a aussi permis d’évaluer les conséquences moléculaires de
l’activité de cette molécule. Pour l’analyse des variations génétiques, nous avons utilisé le
« differential display » pour caractériser de nouvelles cibles moléculaires différentiellement exprimées
lors du traitement. Plusieurs messagers ont été sélectionnés. Après séquençage et comparaison aux
banques de données, l’un des fragments s’est révélé être un clone ARNm IMAGE (isolé lors du
découpage du génome humain) de fonction inconnue et l’autre présente des homologies avec deux
protéines ribosomiques S21 et L12. La fonction de ces deux protéines reste encore mal connue, elles
seraient impliquées dans la progression du cycle cellulaire.
Ces nouvelles cibles moléculaires permettent d’envisager des traitements plus spécifiques de la cellule
cristallinienne et le développement d’une thérapie génique.

MOTS CLES : Cristallin, cataracte, capsule postérieure, cycle cellulaire, différenciation terminale
(DT), « differential display ».

EPHE Banque de Monographies SVT 2Table des matières.
Abréviations

1. Le cristallin
1.1. Localisation et fonction
1.1.1. L’œil 1.1.2. Le cristallin
1.2. Structure du cristallin
1.2.1. La capsule 1.2.2. L’épithélium
1.2.3. Le cortex 1.2.4. Le « noyau » cristallinien
1.3. Les fibres cristalliniennes
1.3.1. Structure 1.3.2. « Nutrition »
1.3.3. Transparence
2. La cataracte
2.1. Définition
2.1.1. Histologie 2.1.2. Anatomie
2.1.3. Étiologie
2.2. Traitement chirurgical
3. La cataracte secondaire
3.1. Définition
3.1.1. Histologie
3.1.1.1. Type fibreux 3.1.1.2. Type perle
3.1.2. Étiologie
3.1.2.1. Mécanismes de l’opacification 3.1.2.2. Facteurs influençant la PCO
3.2. Traitement de l’opacification
3.3.Prévention de la PCO
3.3.1. Techniques chirurgicales 3.3.2. Implants intraoculaires (IOL)
3.3.3. Moyens pharmacologiques
3.3.3.1. Antimétabolites 3.3.3.2. Immunotoxines 3.3.3.3. Thérapie génique
4. Prolifération, différenciation et mort cellulaire.
EPHE Banque de Monographies SVT 3 4.1. Le cycle cellulaire.
4.1.1. Déroulement. 4.1.2. Les « acteurs » du cycle cellulaire.
4.2. La différenciation
4.2.1. Définition : circonstance de la différenciation cellulaire. 4.2.2. L’état de différenciation terminale
4.2.3. Les « acteurs » de la différenciation.
4.3. La mort cellulaire programmée.
4.3.1. Comparaison apoptose/nécrose.
4.3.1.1. Aspect de la chromatine
4.3.1.2. Morphologie de l’apoptose
4.3.1.3. Morphologie de la nécrose
4.3.2. Les étapes de l’apoptose.
4.3.2.1. La phase d'initiation ou le signal de mort.
4.3.2.2. La phase de décision.
4.3.2.3. La phase de dégradation.
4.3.3. Régulation de l’apoptose.
5. Facteurs génétiques de la cataracte
5.1. Anomalies chromosomiques
5.2. Cristallines
5.3. Facteurs de transcription
5.4. Facteurs de croissance
5.5. Protéines.
5.5.1. Protéines de membrane.
5.5.2. Les protéines du cytosquelette.
5.5.3. Cellular retinoic acid-binding protein I (CRABPI).
Abréviations.
ADN Acide désoxyribonucléique.
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire.
AHo acrylique hydrophobe.
ARN Acide ribonucléique.
ARNm ARN messagers
ATP Adénosine TriPhosphate
Bcl-2 « B cell Lymphoma 2 »
BrEt Bromure d’éthidium.
CDK Cyclin Kinase Dependent
EPHE Banque de Monographies SVT 4CI50 Concentration inhibitrice 50%.
CKI Cyclin Dependent Kinase Inhibitor
CO Dioxyde de carbone2
CRABPI « Cellular Retinoic Acid-Binding Protein I »
DD Differential Display
ddNTP Didéoxynucléotide triphosphate.
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium.
DNAse Déoxyribonucléase
dNTP Désoxy nucléotide triphosphate.
DO Densité Optique.
DTT Dithiothréitol.
EDTA Ethylenediaminetetra-acetic acid.
FGF Fibroblast Growth Factor
IOL Implant intraoculaire.
IPTG Isopropyl-1-thio-b-D-galactoside.
J / J Aucun jour de traitement / 72 heures de traitement.0 72
LB Luria Bertoni.
LEC cellules épithéliales cristalliniennes.
M Molaire.
mCi Milli Curie.
MgCl Chlorure de magnésium.2
MIP « Major Intrinsic Protein »
MMLV RT Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase.
MTT 3-4,5 diméthylthiazol-2-yl-2,5 diphénytétrazolium bromide.
Oligo dG Oligonucléotide désoxyguanidine.
PCO Opacification de la capsule postérieure.
PCR Polymerase chain reaction.
PMMA Polymethylméthacrylate.
PolyT Poly thymine
QSP Quantité suffisante pour.
RACE PCR Rapid amplification cDNA ends Polymerase chain reaction.
Rnase in Inhibiteur de Rnases (extraits de placenta humain ou porcin).
RT PCR Reverse transcription polymerase chain reaction.
STAT « Signal Transduceurs and Activators of Transcription »
SVF Sérum de veau fœtal.
Taq Polymerase ADN polymérase thermostable (Thermophilus aquaticus).
TBE Tris / Borate / EDTA.
TdT Terminal transferase.
TE Tris / EDTA.
TGF b Transforming Growth Factor beta
EPHE Banque de Monographies SVT 5TNF « Tumor Necrosis Factor »
U Unité.
UI Unité internationale.
V Volume.
W Watts.
X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside.





1. Caractéristiques du cristallin.

1.1. Localisation et fonction.

1.1.1. L’œil.

De forme approximativement sphérique, l’œil est l'organe de base de la vision. Il comporte un
ensemble d'éléments destinés à recevoir le rayonnement lumineux, former l'image des objets perçus et
traiter les informations recueillies.
L'enveloppe fibreuse de l’œil est composée de la cornée en avant et de la sclérotique en arrière. La
sclérotique, de couleur blanche, est visible à travers une fine membrane transparente, la conjonctive.
À l'intérieur de la sclérotique se trouvent deux membranes : l'uvée et la rétine.
L'uvée comprend trois parties : la choroïde, le corps ciliaire et l'iris. La choroïde (la « chambre noire
de l'œil » est une membrane très vascularisée responsable de la nutrition des cellules de la rétine. Le
corps ciliaire sécrète l'humeur aqueuse grâce aux procès ciliaires (petites glandes) et assure le tonus
du globe oculaire. L'iris est un disque percé d'un orifice, la pupille. Il se comporte comme un
diaphragme en réagissant à l'intensité lumineuse qui pénètre dans l'œil par la pupille.
La rétine, membrane interne de l’œil, est formée de cellules photo réceptrices, les cônes et les
bâtonnets qui respectivement captent les couleurs et le noir&blanc. Les informations enregistrées par
ces cellules sont transmises au cerveau par l'intermédiaire du nerf optique. Les éléments permettant la
focalisation de l’image sur la rétine sont la cornée et le cristallin. Ce dernier est situé juste derrière
l’iris (Kahle et al., 1984).

1.1.2. Le cristallin.

Le cristallin est une lentille biconvexe asymétrique : sa face postérieure est plus bombée que la face
EPHE Banque de Monographies SVT 6antérieure (Tuil et al. 1995 ; Saraux, 1995).
Il n’est pas vascularisé, les nutriments proviennent de l’humeur aqueuse et du corps vitré. L’une des
principales caractéristiques du cristallin est la transparence. Sans cette transparence, il ne pourrait
exercer les fonctions suivantes indispensables.
Grâce à son élasticité, sa courbure varie avec la vision de près ou de loin : c’est l’accommodation. Il
est maintenu par un ligament suspenseur, la zonule. Celle-ci est constituée par de nombreuses fibrilles
transparentes tendues du corps ciliaire à l’équateur du cristallin. Au repos, la zonule est contractée, le
cristallin est alors réglé pour la vision de loin. Pour la vision proche, le muscle ciliaire se contracte, la
zonule se détend et la convexité du cristallin augmente.
Enfin, il filtre les ultra violets (UV) afin de protéger les tissus fragiles comme la rétine. Mais, une trop
forte absorption d’UV peut également l’endommager.
1.2. Structure du cristallin.

Le cristallin est composé de quatre sections majeures : la capsule, l’épithélium, le cortex et le noyau.
Il mesure 10 mm de diamètre et son épaisseur est en moyenne de 4,5 mm. Sa face postérieure est de
convexité plus accentuée que sa face antérieure. Ces deux faces sont séparées par l’équateur où la
zonule s’insère.

1.2.1. La capsule.

Le cristallin est enveloppé d’une capsule dont l’épaisseur varie entre 10 et 20 µm. La capsule
antérieure est plus épaisse que la capsule postérieure. Ceci est dû à la présence de l’épithélium. Cette
capsule est une membrane élastique qui supporte et garantie l’intégrité structurelle du cristallin. Elle
est de structure laminaire. Chaque lamina est une « feuille » de minuscules filaments parallèles de
collagène. Le cristallin grossit tout au long de la vie, le volume de la capsule augmente en déposant
de nouvelles lamelles.

1.2.2. L’épithélium.

Sur la face interne de la capsule antérieure, on observe une monocouche cellulaire. Cette monocouche
est formée de grosses cellules cuboïdes. Il s’agit de l’épithélium cristallinien. Ces cellules ont de
nombreux rôles : production de protéines (cristallines, protéines de membrane), transport actif d’ions
et d’eau, sécrétion de précurseurs capsulaires. Il constitue la part la plus métaboliquement active du
cristallin. L’épithélium est composé d’un seul type cellulaire qui existe sous deux formes (Apple et
al., 1992 ; Dahn et al., 1999) :
Dans la zone antéro-centrale, on trouve une monocouche de cellules épithéliales non
spécialisées : les cellules épithéliales antérieures. Ces cellules n’ont aucune activité mitotique.
Dans la zone de l’arc équatorial, les cellules épithéliales ont une activité mitotique intense et
sont riches en protéines (les cristallines). Ce sont les cellules épithéliales équatoriales. Après division
et différenciation, elles forment les fibres cristalliniennes.
EPHE Banque de Monographies SVT 7Aucune cellule épithéliale n’est présente sur la capsule postérieure du cristallin sauf de façon
pathologique.

1.2.3. Le cortex.

Le cortex est la région dans laquelle les fibres cristalliniennes produites par l’épithélium vont
évoluées. Cette zone est métaboliquement peu active. Les fibres corticales sont très minces,
grossièrement hexagonales en coupe et très longues. Elles sont légèrement fusiformes et deviennent
plus longues et plus denses en s’éloignant de l’équateur. Dans les zones profondes du cortex, les
fibres sont en phase terminale de différenciation. Les membranes extracellulaires de ces fibres sont
tellement entrecroisées et les fibres si fines que l’on ne distingue plus leur nature hexagonale. La
transition entre le cortex et le « noyau » cristallinien est graduelle et difficile à observer.

1.2.4. Le « noyau » cristallinien.

Le « noyau » cristallinien contient les fibres cristalliniennes embryologiques entourées par les fibres
fœtales, puis par les fibres formées pendant l’enfance et de l’âge adulte. En effet, les anciennes fibres
sont poussées vers le noyau par les fibres nouvellement formées. Dans cette zone, les fibres sont
complètement imbriquées les unes dans les autres et n’ont plus d’organites. Leur cytoplasme ne
contient que des protéines appelées cristallines. Les fibres du « noyau » ne sont pas renouvelées et
comptent parmi les plus vieilles de l’organisme.


1.3. Les fibres cristalliniennes.

1.3.1. Structure.

Les fibres cristalliniennes sont formées à partir de la division des cellules épithéliales équatoriales.
Ces fibres sont agencées de façon très particulière.
Comme un oignon, le cristallin est composé de couches concentriques de fibres (jusqu’à 1000 par
cristallin) formant un réseau d'un pôle à l'autre du cristallin.
En section transversale, les fibres apparaissent hexagonales comme des nids d'abeilles légèrement
aplaties et/ou étirées. Les cotés larges d’une fibre sont orientés parallèlement à la surface du cristallin
afin de permettre une bonne pénétration de la lumière. Les cellules nouvellement formées se
déplacent vers l’équateur opposé. Pendant ce déplacement, les cellules vont s’allonger et se
différencier en fibres cristalliniennes.
La maturation des fibres provoque la diminution, puis la disparition des organites cytoplasmiques
(mitochondries, réticulums endoplasmiques, appareil de Golgi…). Le noyau cellulaire subit également
de nombreux changements. La structure de la chromatine s’altère progressivement, la membrane
EPHE Banque de Monographies SVT 8nucléaire perd son intégrité (Bassnett et al., 1997 ; Stafford, 2001). Ce processus de différenciation
est apparenté à l’apoptose.
Il existe toutefois quelques différences entre l’apoptose « classique » et la différenciation des cellules
fibres cristalliniennes. En effet, le noyau est dégradé plusieurs jours après la disparition des organites
au cours de la différenciation des cellules fibres cristalliniennes au lieu de quelques heures pour
l’apoptose « classique ». De plus, les mitochondries disparaissent très rapidement après le début de la
différenciation contrairement à l’apoptose (Wride, 2000).
Cependant, cette dégradation nucléaire ne conduit pas à la phagocytose des fibres par les
macrophages (Bassnett et al., 1997). Une importante synthèse concomitante de membrane plasmique
et de protéines cristalliniennes est également observée (Kuszak, 1995).
Après migration cellulaire, le cytoplasme est complètement homogène. Les organites ont entièrement
disparu. Les nombreux filaments d’actine, constituant du cytosquelette, très présent dans les fibres
corticales, ont également été dégradés. Les fibres constituant le « noyau » cristallinien ne contiennent
aucun microtubule, ni organite.
L’activité métabolique des fibres cristalliniennes est considérablement réduite. Malgré l’absence
d’organites, elles survivent et fonctionnent tout au long de la vie.

1.3.2. « Nutrition »

Comme toutes les structures cellulaires de l’organisme, le cristallin a besoin d’énergie, de
métabolites, d’ions pour rester fonctionnel. La tâche n’est pas facilitée en raison de l’avascularisation
du cristallin. Ces manques sont palliés grâce à l’humeur aqueuse qui pourvoit à la majorité des
besoins du cristallin.
De plus, les membranes latérales des fibres sont caractérisées par la production de nombreuses
interdigitations (dispositif en contour sinueux type puzzle).
Ce processus commence durant les derniers stades de la différenciation. Ces interdigitations sont très
nombreuses et régulièrement agencées le long des fibres. Elles permettent une cohésion extrêmement
étroite entre les fibres ainsi qu’une excellente communication intercellulaire. Donc même sans
organites, les fibres présentes au niveau du « noyau » cristallinien, communiquent parfaitement entre
elles grâce à la présence de ces nombreuses jonctions.

1.3.3. Transparence.

La dernière mais la plus importante des caractéristiques du cristallin est sa transparence. Cette
transparence est due à plusieurs facteurs.
Tout d’abord, l’organisation des fibres cristalliniennes est très particulière. Ces fibres sont disposées
en couche. Chaque couche est approximativement perpendiculaire à la lumière entrant dans l’œil. De
plus, grâce à l’empilement très étroit des fibres, il n’y a que peu d’espaces intracellulaires qui
permettraient une dispersion des rayons lumineux.
Ensuite, le cytoplasme des fibres cristalliniennes ne contient que très peu d’organites capables
EPHE Banque de Monographies SVT 9d’absorber ou d’éparpiller la lumière. De plus, les fibres immatures, possédant encore des organites,
sont confinées dans les régions équatoriales du cristallin afin d’éviter toute dispersion. Il y a toutefois
quelques légères diffractions dues aux membranes plasmiques des cellules.
Enfin, après élimination des organites, le cytoplasme des fibres cristalliniennes n’est plus qu’une
solution homogène de protéines très solubles dans l’eau : les cristallines. Elles sont produites durant la
formation des fibres. Leur longévité et leur stabilité sont exceptionnelles. Elles ne sont ni remplacées,
ni détruites comme dans les autres cellules de l’organisme. Le pourcentage de solubilité de ces
protéines est très important pour la transparence. Plus ou moins d’eau dans le cristallin et le
cytoplasme devient opaque. Elles représentent approximativement 90% des protéines solubles du
cristallin et constituent 30 à 35% de la masse totale du cristallin (Graw, 1997). Les trois classes
majeures des cristallines – a, b et g cristallines – sont distinguées par leur taille, leur charge et leurs
propriétés immunologiques.
† LES A CRISTALLINES. La famille des a cristallines inclut les aA et les aB cristallines. Ce sont
des protéines structurelles mais également des protéines chaperonnes. Elles sont membres de la
famille des petites protéines de choc thermique, s’associent avec une variété de protéines du
cytosquelette (Carter et al., 1995). Elles ont également une activité autokinasique et sont impliquées
dans l’activation du gène de la g cristalline (Graw et al., 1997). Les a cristallines sont indispensables
au maintien de la transparence cristallinienne. En effet, l’aA cristalline maintient la solubilité de l’aB
cristalline in vivo (Brady et al., 1997).
† LES B ET G CRISTALLINES. Les polypeptides b et g cristallines sont les membres d’une même
superfamille. La g cristalline est exprimée très tôt au cours développement de l’œil. Elle joue un rôle
dans la différenciation le maintien de la transparence des fibres cristalliniennes (Papaconstantinou et
al., 1967). La gS cristalline prévient la séparation de phase du cytoplasme des cellules fibres du
cristallin. Cette séparation de phase est impliquée dans la formation de la cataracte (Lui et al., 1996).
Les µ et z cristallines sont présentes en très petites quantités dans le cristallin humain. Ces protéines
seraient des enzymes participant dans l’osmorégulation ou le métabolisme des acides aminés (He et
al., 2000).
Nous reparlerons de ces protéines et des gènes codant pour celles-ci dans un prochain paragraphe (cf.
§ 4.4.2.).

La transparence du cristallin vient de ces spécialisations structurelles et moléculaires.
† Organisation et la forme des cellules cristalliniennes.
† Absence d'organites
† Concentration très élevée des cristallines.
Si une seule de ces spécialisations est perdue, le cristallin devient opaque. Cette pathologie est
appelée cataracte.




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