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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE Ecole Pratique des Hautes Etudes section des sciences de la vie et de la terre  MEMOIRE présenté par RAYNAUD Fabrice pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes  Caractérisation et régulation des interactions de la titine avec les protéines de la strie Z et de la bande I.  
Soutenu le 06/12/99 JURY : - Président : Dr Exbrayat J.M. - Rapporteur : Dr Benyamin Y. - Rapporteur : Dr Astier C. - Examinateur : Dr Chaussepied P.  Laboratoire de Motilité Cellulaire. Directeur: Y.BENYAMIN Université Montpellier II   A- INTRODUCTION p1
 
 SOMMAIRE
A.1- Le muscle squelettique p2 A.1.1- Les myofibrilles p2 A.1.2- Le réticulum sarcoplasmique et les tubules T p4 A.1.3- Les structures transverses p6 A.2- Le sarcomère p8 A.2.1- Le moteur de la contraction musculaire p8 A.2.1.1- La myosine p8 A.2.1.2- L’actine p12 A.2.2- Les protéines de régulation de la contraction musculaire p15 A.2.2.1- Les troponines A.2.2.2- La tropomyosine p16 A.2.3- Le troisième réseau parallèle p19 A.2.3.1- La nébuline p20 A.2.3.2- La titine p23 A.2.4- La strie Z p33 A.2.5- L’a-actinine p36 A.2.6- Des cellules myogéniques à la myofibrillogénèse p39
A. INTRODUCTION
 
 
A.1. Le muscle squelettique : Les muscles squelettiques ou striés, sont les muscles de la locomotion, de la statique et du mouvement. Leur fonction est commandée par le système nerveux volontaire, contrairement aux muscles lisses qui sont dirigés par le système nerveux végétatif. La fibre musculaire striée résulte de la fusion de myoblastes, qui sont des cellules précurseurs. Cette fusion va engendrer certaines des caractéristiques de la cellule musculaire : sa plurinucléation (jusqu’à plusieurs centaines de noyaux), et sa très grande taille (plusieurs dizaines de cm dans les muscles du dos et des membres inférieurs). Ces fibres possèdent une architecture très particulière et complexe. Dès le XVII e siècle, la microscopie optique a permis de révéler la nature striée de la fibre musculaire. Il existe une alternance de zones sombres anisotropes (bande A) et de zones claires isotropes (bande I). Chaque cellule musculaire est entourée d’un " manchon " constitué de réticulum sarcoplasmique et de tubules T. Tous deux jouent un rôle important dans la diffusion du signal calcique, faisant suite à l’influx nerveux. La fibre musculaire possède aussi une autre particularité qui est la richesse de son cytoplasme en granules de glycogène et en mitochondries. La totalité de cette fibre est protégée par une membrane cytoplasmique caractéristique appelée sarcolemme.
  
 A.1.1. Les myofibrilles : Elles représentent environ les 2/3 de la masse sèche de la cellule musculaire, et en constituent l’unité fonctionnelle. Ce sont de longs cylindres, pouvant atteindre plusieurs centimètres, de un à deux mm de diamètre. Elles présentent une structure périodique extrêmement régulière apparaissant sous la forme d’une alternance de bandes transversales sombres et claires. Les myofibrilles isolées sont capables de se contracter en présence de magnésium et d’ATP (adénosine triphosphate), et représentent donc les éléments contractiles des cellules musculaires. Chaque moyfibrille est constituée d’un empilement d’unités contractiles : les sarcomères. Ils comprennent au centre, la bande A (essentiellement composée de filaments épais), et sont délimités par deux stries Z partageant en deux la zone claire ou bande I, qui elle contient principalement des filaments fins. Les protéines myofibrillaires constituent 55 à 60% des protéines totales de la fibre musculaire. Elles assurent trois fonctions fondamentales : 1- la contraction : produite par deux protéines, l’actine et la myosine, qui sont respectivement les principaux constituants des filaments fins et épais. 2- la régulation de la contraction : essentiellement due aux protéines de la régulation calcique, qui sont principalement, la tropomyosine, les troponines I, C, T. 3- Le maintien de l’intégrité et de l’organisation sarcomérique qui peut être attribué à deux polypeptides de taille exceptionnelle, la titine et la nébuline, appartenant au réseau des filaments myofibrillaires.  A.1.2. Le reticulum sarcoplasmique et les tubules T : Les tubules T et le réticulum sarcoplasmique interviennent dans le contrôle de la contraction musculaire, en agissant sur le relargage du calcium dans la cellule. Les tubules T sont des invaginations de la membrane sarcolemmique, dont l’abondance et la localisation peuvent varier suivant les types musculaires. Ceux sont les responsables de la propagation rapide du potentiel d’action à l’intérieur de la fibre (pour revue : Franzini-Armstrong, 1986). Les tubules T forment des jonctions avec les citernes terminales du réticulum sarcoplasmique, qui se trouvent être des compartiments spécialisés dans le stockage et le relargage du calcium (Escobar et coll, 1994). Dans sa partie centrale, le réticulum sarcoplasmique forme un immense réseau entourant toutes les myofibrilles. Cette zone riche en Ca2+-ATPases, est spécialisée dans la " récupération " du calcium (revue : Flucher, 1992). Les protéines du réticulum sarcoplasmique représentent 30 à 35% des protéines musculaires totales. Elles sont solubles à faible force ionique, sont généralement de faible masse moléculaire, de conformation spatiale globulaire et de faible viscosité. A.1.3. Les structures transverses : Une autre des caractéristiques remarquables de l’organisation de la cellule musculaire, réside dans la disposition strictement parallèle des différents systèmes de filaments myofibrillaires et, dans l’alignement des myofibrilles entre elles. Deux structures transversales supportent le maintien de l’agencement intra et extra-sarcomérique : - les lignes Z ou stries Z, qui cloisonnent l’espace sarcomérique et assurent l’ancrage des filaments fins et élastiques. - le réseau de filaments transverses qui relie les myofibrilles adjacentes entre elles ou à la membrane sarcolemmique. Ces filaments intermédiaires, constitués de différentes protéines (desmine, vimentine, synémine...), forment des liaisons entre les disques Z, et entre les bandes M (structure spécialisée au centre de la bande A) des myofibrilles voisines. De plus, il existe également des jonctions entre la membrane sarcolemmique et les myofibrilles au niveau d’invaginations du sarcolemme, appelés costaméres. Ces dernières par l’intermédiaire de certains éléments du cytosquelette peuvent être reliées aux lignes Z.  
A.2. Le sarcomére : A.2.1. Le moteur de la contraction : Il est principalement formé du filament fin (actine et protéines de régulations) et du filament épais (essentiellement de la myosine). La contraction ou l’étirement résultent du glissement du filament fin par rapport aux filament épais. Ce phénomène se traduit lors de la contraction par une diminution voire une disparition de la bande I, et inversement lors de l’étirement. Comme pour tout moteur, l’apport d’énergie est essentiel à son fonctionnement. Celle-ci est apportée par l’hydrolyse de l’ATP. Le facteur déclenchant de la contraction est l’entrée de calcium dans la cellule musculaire. Au cours du cycle contraction-relâchement, l’ATP lié à la tête de myosine est hydrolysé en ADP+Pi, lors de cette étape la tête de myosine ne rentre que faiblement en contact avec le filament fin. Pour que l’interaction devienne forte, il faudra que le Pi soit libéré. A ce moment là, la tête de myosine se lie fortement à l’actine et subit un changement conformationnel (ou bascule) lui permettant de faire glisser le filament fin. Ensuite l’ADP est relargué dans le milieu et est à nouveau remplacé par un ATP. Parfois, le site de myosine est vide, et celle-ci est fortement liée à l’actine, ce niveau d’interaction est connu sous le nom de " rigor mortis " ou rigidité cadavérique. Ce phénomène se produit dans un état " post-mortem ", lorsque le muscle est privé d’ATP, ceci se traduit par une forte contracture du muscle et donc un raccourcissement maximal du sarcomère. A.2.1.1. La myosine : La myosine est une protéine de 520 kDa qui combine les propriétés des protéines fibreuses et globulaires. Sa structure peut être divisée en six chaînes polypeptidiques. Elle comprend deux chaînes lourdes de 205 kDa, présentant une structure en hélice-a, qui s’enroulent l’une autour de l’autre pour former une queue fibrillaire ou " rod ". Ces chaînes lourdes se séparent du côté N-terminal pour se combiner chacune à deux chaînes légères, dites alcalines ou régulatrices, de 27,5 et 16,5 kDa respectivement, formant ainsi les têtes globulaires de la molécule. Ce sont ces têtes globulaires qui constituent des ponts transversaux ou " cross-bridges " entre les filaments fins et épais dans la myofibrille. En raison de la taille de la myosine, la plupart des études physico-chimiques ou biochimiques ont été effectuées sur des fragments protéolytiques de la protéine, et ont conduit à une meilleure appréhension de ses propriétés fonctionnelles. Ainsi, des protéases telles que la papaïne, la trypsine, ou la chymotrypsine, ont permis d’obtenir par clivage les quatre unités essentielles de la molécule : - un fragment appelé LMM correspondant à la " queue " de la myosine, qui a la capacité de former in vitro  des filaments bipolaires ressemblant aux filaments épais. - une portion appelée HMM regroupant les têtes (nommées S1) et le " cou " (nommé S2) de la myosine. - le sous fragment-1 (S1) représente les têtes globulaires. Il possède à lui seul les deux fonctions essentielles au mouvement : l’hydrolyse de l’ATP et l’interaction avec l’actine. Des expériences de motilité in vitro  ont montré que la tête globulaire isolée du reste de la molécule, était suffisante au glissement des filaments d’actine (Toyoshima et al, 1987). - le sous fragment-2 (S2), par sa flexibilité, assure la mobilité des têtes globulaires en leur permettant de se projeter à des distances variables de l’axe du filament épais en direction des filaments fins.  A.2.1.2. L’actine : C’est une protéine globulaire de 42 kD (actine G) qui a pour propriété principale le fait de s’auto-associer pour former un filament (actine F). Elle est ubiquitaire chez les eucaryotes, et on peut aussi la retrouver chez les cellules procaryotes (ex : cyanobactéries). Outre son rôle dans la contraction musculaire, celle-ci intervient aussi dans la motilité cellulaire ou dans la structuration de la matrice cytoplasmique. De nos jours, peuvent être distinguées six actines différentes chez les mammifères; trois a-actines spécifiques des muscles squelettique, lisse et cardiaque ont été identifiées, ainsi que les b et g-actines dans les tissus non musculaires, et la dernière qui est une g-actine dans le muscle lisse. L’actine est formée de deux domaines; le " petit domaine " contenant le sous domaine I (extrémités C et N terminal de la molécule) et le sous domaine II, le " grand domaine " divisé lui même en deux sous domaines le III et le IV. La molécule d’actine est associée de façon non covalente à un ion divalent (Mg2+ ou Ca2+), ainsi qu’à un nucléotide (ATP ou ADP).
Ses liaisons avec le nucléotide et l’ion divalent confèrent à l’actine une structure globulaire très dense, et une forte résistance au clivage protéolytique. Ainsi, la plupart des coupures enzymatiques produisent un fragment résistant d’environ 33kD appelé le " core ". Des protéases, comme la trypsine ou la chymotrypsine, clivent essentiellement dans des boucles (ou " loops ") situées entre les résidus 60-70 et 40-52 et dans la région C-terminale. Les seuls moyens d’obtenir d’autres fragments d’actine, sont de travailler en milieu dénaturant, par exemple en Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) 1% ou en urée, ou encore en chélatant son ion divalent, conditions qui permettent une destructuration favorisant l’accessibilité des protéases.  Le processus de polymérisation de l’actine monomérique pour former des filaments peut-être divisé en quatre étapes (Carlier, 1991) : - L’activation : elle correspond à la fixation des cations (Ca2+ ou Mg2+) à la protéine, ce qui entraine un changement conformationnel du monomère, indispensable au processus de polymérisation. De ce fait l’actine acquiert certaines propriétés structurales de l’actine F, telles qu’une plus grande résistance protéolytique (Rich et Estes, 1976), une modification de ses propriétés spectrales (Rouayrenc et Travers 1981) et antigéniques (Benyamin et col, 1979). - La nucléation : cette étape correspond à l’association de monomères d’actine activés en de petits agrégats nommés noyaux ou " nucleï ". Cette étape est aussi appelée " lag ". - L’élongation : c’est une étape rapide au cours de laquelle les noyaux croissent en de longs filaments de différentes tailles. - L’association des filaments : elle correspond à l’étape où les filaments d’actine s’additionnent pour donner une structure plus complexe. A ce moment là, un équilibre actine F-actine G se fait dans le milieu. La concentration à l’équilibre des monomères s’appelle la concentration critique, si l’on augmente la quantité d’actine seule dans le milieu, les filaments recommenceront à croître. D’un point de vue structural, l’empilement des monomères d’actine pour former le filament, s’effectue en un enroulement dextre hélicoïdal (double brin) avec 13 monomères pour six tours d’hélices (Egelman, 1985). Par ailleurs, il est à noter que la réaction de polymérisation peut-être réalisée in vitro  par addition dans le milieu de sels (100 mM KCl) et de magnésium (2 mM MgCl2). Au cours de la polymérisation, l’hydrolyse de l’ATP portée par l’actine permet des réarrangements conformationnels qui différencient les monomères d’actine appartenant à l’une ou l’autre des régions distales du filament. De ce fait, une des extrémités est caractérisée par une élongation rapide (extrémité " + " ou " barbelée ") liée à l’ATP et l’autre par une croissance lente (dite " - " ou " pointue ") liée à l’ADP. Cette orientation du filament d’actine avait déjà été observée en microscopie électronique par Huxley (1963) qui, mélangeant, mole à mole, de l’actine F à de la tête S1 de myosine, a obtenu une décoration en tête de flèche linéairement asymétrique du filament par les S1. Dans le muscle strié, le filament d’actine est coiffé en son extrémité (+) ou " barbelée " par une protéine se trouvant dans la strie Z, la cap Z (Schafer et Cooper, 1995). Il en est de même pour l ’extrémité (-) où se trouve une autre protéine de capping la tropomoduline (Gregorio et Fauler, 1995). Ces deux protéines de coiffe protégent le filament des processus de polymérisation / dépolymérisation, et contribuent au maintien de la longueur du filament fin. Le filament fin est aussi constitué de protéines de régulation de la contraction, les troponines I,C,T, et la tropomyosine (Tm).  A.2.2. Protéines de régulation de la contraction musculaire :  A.2.2.1. Les troponines (Tn) : Ce sont les protéines responsables de l’activité calcium-dépendante du complexe acto-myosine. On en dénombre trois, nommées I, T, C. - La troponine I : elle inhibe l’hydrolyse de l’ATP par l’acto-myosine. Elle interagit avec l’actine et, en présence de tropomyosine la stoechiométrie est de une Tn I pour sept monomères d’actine. Elle se fixe aussi à la Tn C et la Tn T. - La troponine T : cette molécule est relativement allongée. En présence de tropomyosine (Tm), elle peut inhiber l’activité ATPase de la tête de myosine. Elle ne se fixe pas sur l’actine et exerce ses effets au travers de la Tm.
- La troponine C : c’est l’unité du complexe des troponines qui fixe le calcium. Elle est liée à la Tn T et I. Elle possède quatre sites de liaison pour le calcium et joue un rôle déterminant dans la régulation calcique de la contraction (Fujimori et Coll.1990, Grabarek et Coll.1990). Ainsi, quand la concentration calcique augmente, ce sont les changements de conformation subis par la troponine C qui, transmis au complexe des troponines-tropomyosine, sont finalement responsables de la levée de l’inhibition de l’activité ATPase de l’acto-myosine.  A.2.2.2. La tropomyosine : C’est une protéine fibreuse de 66 kD et de 400 Å de long. Elle est composée de deux sous unités a et b de 284 acides aminés chacune, qui s’organisent en structure hélicoïdale. Elle s’associe en polymères selon un enchaînement tête-queue, et se positionne le long du filament d’actine dans le sillon de l’hélice. Son interaction avec l’actine suit une stoechiométrie de sept monomères d’actine pour une tropomyosine. Des expériences ont montré que la tropomyosine, lors du cycle contraction-relaxation du muscle, avait une certaine mobilité sur le filament d’actine. Ce qui a permis de définir deux états, selon l’état d’activation ou d’inhibition de l’ATPase dû à la troponine C. On parle respectivement d’état " on " ou activé et d’état " off " ou inhibé (Kabsch et Vandekerckhove, 1992). Le mouvement induit par la fixation du calcium aurait pour conséquence d’affecter l’interaction entre l’actine et la tête de myosine, dans le sens d’une  libération des sites de l’actine nécessaires à l’activation de l’activité ATPase du S1. Les recherches à ce sujet ont été très controversées et différents modèles ont été proposés : - modèle du blocage stérique : Celui-ci implique que la tropomyosine (Tm) empêcherait physiquement le contact acto-myosine, indépendamment du nucléotide. La liaison du calcium à la troponine C aurait pour conséquence d’induire un changement conformationnel de la Tm à la surface du filament rendant à nouveau accessible les sites de fixations complémentaires du S1 sur l’actine. - modèle de l’allostérie : Il semblerait que le fragment S1 puisse interagir avec le filament fin régulé en absence de calcium, mais pas de la même façon qu’en sa présence. De plus, le système Tm-troponines n’inhiberait pas l’activité ATPase en empêchant la liaison S1-ATP (ou S1-ADP.Pi) à l’actine, mais plutôt en bloquant la libération de Pi du complexe acto-S1-ADP.Pi (Lymn et Taylor 1971). Donc, dans ce modèle, l’état " off " dont l’activité est inhibée, serait corrélé à un faible contact acto-myosine, et l’état " on " à une forte interaction entre les deux protéines. Le calcium, via la Tn C, ainsi que le complexe S1-ADP, agiraient comme effecteurs allostériques en déplaçant l’équilibre depuis le premier vers le second état. -modèle intermédiaire de Geeves : Ici le modèle de l’allostérie est quelque peu modifié par l’ajout d’une étape correspondant à un état conformationnel supplémentaire du filament, à un état bloqué, incapable de lier le S1. Ensuite l’interaction suivrait le modèle de l’allostérie. Plus récemment, des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) ont montré qu’en présence de calcium la tropomyosine avait un mouvement plus limité sur filament reconstitué que celui initialement décrit dans le modéle du blocage stérique (Miki et coll, 1998). Ce dernier résultat contredit donc le modèle présenté précédemment impliquant un mouvement de la Tm sur le filament fin. Ainsi, comme nous pouvons le constater, de nombreux points restent encore à préciser à ce propos.  A.2.3. Le troisiéme réseau paralléle  : Lors d’un étirement musculaire, sans stimulation électrique, donc causé par une force extérieure, le sarcomére peut s’allonger jusqu’à ce que les filaments fins et épais ne se chevauchent plus. Pourtant, lorsque l’on arrête la pression extérieure, le muscle se rétracte et reprend sa longueur initiale. Aussi, un tel phénoméne laisse envisager la présence de systèmes de " ressorts " permettant aux unités contractiles de retrouver leur état initial.
Il s’est avéré que les traitements de myofibrilles purifiées, à l’iodure de potassium (pour enlever les filaments épais) (Wang et Ramirez-Mitchell, 1983 ; Sawada et coll, 1983 ; Wang et coll,1984), ou bien de traitement à la gelsoline (pour éliminer les filaments fins) (Funatsu et coll, 1990, 1993), ont permis de repérer un réseau de filaments de trés grande taille et de faible diamètre, dont la visualisation même en microscopie électronique ne pouvait se faire en présence des filaments contractiles. D’autre part, une analyse en gel dénaturant à faible pourcentage d’acrylamide, d’extraits totaux de myofibrilles (Wang et Mac Clure, 1978 ; Etlinger et coll, 1976) a montré la présence d’un doublet de protéines de poids moléculaire environnant les 3 MDa correspondant à une protéine appelée titine et d’une troisiéme bande de 800 kDa correspondant à une protéine nommée, nébuline.  A.2.3.1. La nébuline : C’est une protéine de masse molaire comprise entre 600 et 900 kD qui représente trois à quatre % des protéines myofibrillaires (Wang, 1985 ; Kruger et coll, 1991). Le géne codant pour sa séquence protéique se situe sur le chromosome 2. La nébuline a été détectée dans la plupart des muscles squelettiques de vertébrés, et des analogues de celle-ci ont également été décrits dans les bordures en brosse des structures microvillositaires (Eilersten et Keller, 1992), dans le muscle lisse (Wang et Wright, 1988) et chez certains invertébrés (Hu et coll, 1986). - Localisation : L’immunodétection grâce à des anticorps anti-nébuline révélée par microscopie électronique, a montré des striations transverses tout au long du filament fin. Contrairement aux marquages de titine, leurs positions semblent indépendantes de l’état de contration du muscle, c’est à dire de la longueur du sarcomère (Wang et Wright, 1988 ; Furst et coll, 1989). Des techniques similaires montrent qu’un fragment de 30 kD C-terminal de la nébuline qui est un domaine de type SH3 à potentiel de phosphorylation, serait positionné au niveau de la ligne Z (Millevoi et Labeit, 1998). - Propriétés : La nébuline a une structure primaire comportant des répétitions de modules de 35 acides aminés, ne correspondant à ce jour à aucun motif connu. Ces domaines se retrouvent sous forme de " super répétitions " de sept modules tout au long de la molécule, excluant toutefois le C et N-terminal (Labeit et coll, 1991 ; Wang et coll, 1996). La partie C-terminale semblerait favoriser l’ancrage de l’actine dans le disque Z. La structure secondaire de la nébuline est essentiellement formée d’hélices  a, dont la périodicité de 38 nm correspond à celle du complexe Tm-Tn, qui lui même se lie chaque sept monomères d’actine. Cette disposition pourrait refléter le marquage en strie obtenue par immunomarquage et détecté en microscopie électronique sur le filament fin. Par ailleurs, un fragment N-terminal situé dans la région des chevauchements entre filaments fins et épais aurait pour propriété d’inhiber l’activité ATPase de la myosine. Cependant, il a été montré que l’interaction calmoduline-nébuline inverserait cet effet, et que ce complexe favoriserait le glissement de l’actine de manière calcium dépendante (Root et Wang,1994). De plus, bien que la nébuline possède la propriété d’être phosphorylée in vivo  (Somerville et Wang, 1987), aucune donnée fonctionnelle ne nous renseigne quant au rôle de cette modification post-traductionnelle. Des expériences ont montré que la nébuline favorisait la nucléation de l’actine, et pourrait donc protéger le filament fin de la dépolymérisation ou d’éventuelles fragmentations (Chen et coll, 1993). Il a aussi été montré qu’il existait une étroite corrélation entre la longueur de l’isoforme de nébuline exprimée et celle du filament fin, selon le type de muscle considéré (Kruger et al, 1991). Dans le muscle cardiaque, la longueur des filaments fins est moins strictement régulée et, dans ce tissu on ne trouve qu’une forme de nébuline trés différente de bien plus petite taille (110 kDa) appelée nébulette (Moncman et al, 1995). Ainsi, de telles propriétés laissent envisager que la nébuline ait un rôle important pour la stabilisation du filament d’actine ainsi que pour la régulation de sa longueur.  A.2.3.2. La titine  : La titine ou connectine est une protéine d’environ trois millions de Daltons. Elle représente à ce jour la plus longue chaîne
polypeptidique connue dans le monde cellulaire et correspond à prés de 10% de la masse totale du muscle squelettique. Malgré sa grande taille, sa mise en évidence au sein du sarcomère fût trés tardive, et ce pour deux raisons trés simples, qui sont : le faible diamétre des filaments qu’elle constitue (< 5 nm) qui ne permettait pas sa détection en microscopie électronique au milieu des protéines contractiles, et sa grande taille l’empêchant de pénétrer dans des gels électrophorèse d’acrylamide de concentrations classiques. Des protéines analogues à la titine ont été mises en évidence dans les muscles de nombreux invertébrés (projectine= arthropodes ; twitchine= nématodes). Récemment, Machado, et coll (1998) ont montré, l’existence d’une titine dite chromosomique dans différentes lignées cellulaires non musculaires, alors que jusque là, celle ci était décrite comme étant spécifique des tissus musculaires. Dans ce contexte, cette forme de titine colocalisée avec le matériel génétique jouerait un rôle au niveau de la condensation des chromosomes lors de la mitose, ce qui est essentiel pour la ségrégation et le compactage des chromosomes. Localisation : La localisation sarcomérique de la titine a été démontrée à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre différentes régions de la molécule. Ces marquages en immunofluorescence montrent que cette molécule part de la strie Z, s’étend tout au long de la bande I, mais aussi de la bande A, pour finir dans la ligne M (Maruyama et coll, 1985 ; Fürst et coll, 1988, 1989a ; Higuchi et coll, 1992 ; Pierobon-Bormioli et coll, 1989, 1992).  La titine s’étend de manière paralléle aux filaments fins et épais sur la longueur d’un demi sarcomère, et une seule molécule couvre une distance de près de un mM. Récemment, il a été montré que les extrémités N-terminales (environ 80 kDa) des filaments de titine de polarité opposée appartenant à des sarcoméres adjacents se chevauchent dans la ligne Z (Gregorio et coll, 1998). La partie de la molécule se trouvant dans la bande I a une masse comprise entre 700 et 1500 kDa, selon les isoformes. Cette zone est la région la plus élastique de la molécule, et on peut observer un déplacement du marquage des anticorps dans cette zone, en fonction de l’étirement du sarcomére (Furst et coll, 1988), alors que tout au long de la bande A, le fragment de titine d’environ deux MDa ne présente pas de propriétés élastiques comparables in situ . La partie C-terminale de la molécule se trouve au centre de la bande A au niveau d’une structure dense, qui est la ligne M. Ce fragment de titine d’environ 200 kDa traverserait entièrement la ligne M et serait chevauchant avec les extrêmités C-terminales des molécules de titine de l’autre demi sarcomére. Ainsi, comme nous pouvons le constater, la titine, forme un réseau continu tout au long de la myofibrille. Structure : La titine est un polypeptide de plus de 3 MDa dont le gène se situe sur le chromosome 2 (comme celui de la nébuline), qui par transcription produit un ARNm de prés de 100 kbases (Pelin, Wallgren-Petterson et al, 1997). L’isoforme cardiaque de la titine a une structure composée de 132 répétitions d’un motif de 100 résidus homologue à la fibronectine de type III, et de 166 répétitions d’un motif de 90 à 95 résidus ayant une homologie avec le domaine C2 des immunoglobulines (Ig). Ces domaines Ig et FN III constituent 90% de la masse de la titine.  La séquence totale de la titine de muscle cardiaque (la seule actuellement séquencée totalement) (Labeit et coll 1995) révèle que les domaines de type Ig sont majoritairement représentés dans la partie de la molécule située en bande I. Des études de résonance magnétique nucléaire (RMN) montrent que ces modules sont organisés préférentiellement en feuillet-b et donc pourraient partiellement être responsables du pouvoir d’élasticité de la molécule lors de leur dépliement (Improta et al, 1998). Par contre, les domaines de FN III sont plutôt localisés au niveau de la région de titine appartenant à la bande A, et chaque deux ou trois répétitions de ces domaines, un module Ig se trouve intercalé (Muhle-Goll et al, 1998). Les 10% restant de la séquence de la titine, sont constitués de domaines uniques disposés entre des séquences répétitives des deux modules précédents. Au niveau de la bande I, il existe une séquence de 2200 résidus (pour le muscle squelettique) riche en PEVK (Proline, Glutamate, Valine, Lysine), qui confère une forte élasticité à la protéine. Ces motifs ont la faculté de pouvoir considérablement s’étirer et revenir aisément à leur forme initiale sans aucun dommage. La taille de cet enchaînement peptidique peut varier selon le type musculaire et donc modifier l’élasticité de la titine en fonction du besoin du tissu.
A proximité de la région C-terminale dans la séquence de la titine se trouve un domaine sérine / thréonine kinase. Il a été montré que l’activation de la kinase passait par une phosphorylation d’une tyrosine localisée sur une boucle différente de celles habituellement responsables de la régulation des sérine / thréonine kinases conventionnelles. De plus, au cours de cette étude structurale du domaine kinase de la titine, son premier substrat a été identifié. Il s’agit de la téléthonine qui est une protéine de la ligne Z, phosphorylée par la titine au cours des stades précoces de la myofibrillogénèse (Mayans et al, 1998). Dans la région N-terminale de la protéine, on distingue également une série de tamdems KSP (Lysine, Sérine, Proline), potentiellement phosphorylables.  Les partenaires : Compte tenu de la taille exceptionnelle de la titine, et de son étendue dans le sarcomère, il est logique d’imaginer que celle ci présente un grand nombre de partenaires. En effet, elle possède de multiples sites de liaisons pour d’autres protéines, dont nombreux se situent dans ses extrémités N et C-terminale, à savoir respectivement, au niveau de la ligne Z et de la bande M. Trés récemment, la technique de " double hybride " a permis d’identifier certains des partenaires de la titine, dont la téléthonine ou " T-cap ", qui est une molécule de 19 kDa. Cette protéine coiffe (d’où le nom " T-cap ") l’extrémité N-terminale de la titine (Gregorio et coll, 1998). Une interaction a aussi été caractérisée avec le principal constituant du filament Z, qui est l’a-actinine, et plus précisemment avec les 10 kDa de l’extrémité C-terminale de cette protéine (Astier et coll, 1992 ; Ohtsuka et al, 1997 ; Raynaud, résultats non publiés, 1997). Ainsi, la molécule d’a-actinine (détaillée plus avant dans le manuscrit) assurerait à la fois l’ancrage du filament fin (interaction avec l’actine) et celui du filament élastique. A proximité de la strie Z, la titine serait également en interaction avec le principal constituant du filament fin, l’actine. Nous avons montré que la titine était capable de favoriser la polymérisation de l’actine. De plus, nous avons mis en évidence que l’association actine-titine était sensible aux phospholipides, le phosphatidyl inositol 4,5 diphosphate (PIP2), ayant un pouvoir dissociant sur le complexe (Astier et al, 1998). La liaison actine-titine pourrait jouer un rôle dans le dépliement des domaines Ig de cette dernière, et donc intervenir pour le contrôle du maintien de l’architecture sarcomérique lors du travail musculaire. Dans la partie de la molécule se situant au centre de la bande I et dans la région C-terminale, la titine posséde des sites de liaison avec une protéase spécifique du muscle, la calpaïne III ou P94 (Sorimachi et coll, 1995). Toutefois, le site dans la bande I serait absent dans certaines isoformes de titine, car il se situe dans une région d’épissage alternatif de la molécule. Nos travaux les plus récents montrent que tout au long de la bande I, la titine pourrait être en interaction avec une protéine de régulation du filament fin, la tropomyosine (Raynaud, résultats non publiés). Dans la partie de sa séquence présente en bande A, la titine présente de multiples sites pour la myosine, ainsi que pour d’autres protéines du filament épais, telles que la protéine C (MyBP-C) qui s’associe à la titine par sa partie C-terminale (Freiburg et coll, 1996), la protéine X et l’AMP désaminase. Au niveau de la ligne M plusieurs partenaires ont été identifiés, tels que la myomésine, qui une fois phosphorylée n’interagit plus avec la titine (Oberman et coll, 1997), mais aussi la protéine C, et la P94, et la protéine M (Kimura et coll, 1983 ; Soteriou et coll, 1993 ; Wang et coll, 1992 ; Vinkemeier et coll, 1993 ; Koretz et coll, 1993). Les isoformes : A ce jour, seule l’isoforme (ou une des isoformes) cardiaque humaine a été complétement séquencée, cependant de multiples études montrent qu’il existe des titines de tailles différentes chez un même individu, selon le type de fibre considéré et peut-être dans une même cellule musculaire. Dans le muscle squelettique, les fibres lentes et rapides ont des isoformes différentes. Des variations dans les séquences des extrémités N-terminales ont également été mises en évidence. Ainsi, ces structures variables pourraient être à l’origine de la disparité de la largeur de la strie Z observée entre ces différents tissus musculaires. La bande I renferme une grande zone d’épissage localisée dans les répétitions des segments PEVK. Ces différences peuvent faire varier la masse du fragment de titine situé en bande I de, 0,7 MDa à 1,5 MDa, dans le muscle cardiaque humain. Ainsi, alors que les séquences PEVK sont des motifs à forte élasticité, les modifications apportées dans les différents muscles, permettraient d’ajuster l’élasticité de la molécule en fonction de la demande physiologique et de la sollicitation du tissu (Labeit et coll, 1995). Des modifications séquentielles ont aussi lieu en extrémité C-terminale de la molécule, en fonction des isoformes.  La titine dans la myofibrillogénèse :
Un des grands challenges de la recherche concernant la compréhension de la physiologie et biologie du muscle, est d’identifier la séquence des événements à l’origine de l’assemblage des filaments contractiles et de la strie Z dans le sarcomère. La titine semble être un candidat parfait pour servir de support lors de l’assemblage des différents constituants dans la myofibrille. En effet, du fait de son étendue dans tout un demi sarcomère, de ses interactions directes avec les protéines des filaments contractiles et certaines des structures stables de la myofibrille (ligne Z, ligne M), mais aussi, en raison de son expression précoce au cours de la mise en place des structures sarcomériques, il semble raisonnable de penser que la titine puisse constituer le " chef d’orchestre " de la myofibrillogénèse. De plus, la récente découverte du premier substrat de la sérine /thréonine kinase de la titine : la téléthonine, qui elle aussi apparait dans les premiers stades de la différenciation musculaire renforce cette idée. En effet, la localisation de la téléthonine en extrêmité N-terminale de la titine et la localisation du domaine kinase en C-terminal, montre que ces deux extrémités doivent être proches dans l’espace au cours des stades initiaux de la myofibrillogénése. Ainsi, cet état replié de la titine favoriserait des étapes de phosphorylation indispensables à la formation du sarcomère (Grégorio et coll, 1998). Cela impliquerait une communication ligne Z / bande M, qui par un mécanisme dépendant de la téléthonine permettrait la coordination de l’intégration des filaments fins et épais, lors du dépliement de la molécule de titine. Rôles : Au vue des propriétés physico-chimiques précédentes, nous pouvons constater que la titine joue un rôle essentiel au sein de la myofibrille. Effectivement, son fort pouvoir d’élasticité, et sa longue taille et ses multiples contacts contribuent au maintien de l’alignement des filaments contractiles, et permettent le retour du sarcomère à son état initial aprés contraction ou étirement de la myofibrille. Nous avons également vu, que la titine pourrait avoir une forte contribution pour l’assemblage des différents constituants sarcomériques. Elle servirait alors " d’empreinte " ou de " guide " pour l’agencement des autres protéines myofibrillaires. De plus, la récente découverte d’une forme de titine " chromosomique ", nous montre que cette protéine analogue pourrait jouer un rôle important au niveau du fuseau mitotique, lors de la division cellulaire. A ce jour, une seule équipe a publié sur ce sujet là, mais il parait manifeste qu’un grand nombre de propriétés et de fonctions restent à éclaircir ou découvrir pour cette forme nouvelle de la molécule géante.  A.2.4. La strie Z :  La strie Z (ou ligne Z ou disque Z) est une structure de trés forte densité, qui a pour principale fonction de " cloisonner " la myofibrille, d’ancrer et de relier les filaments fins de deux sarcomères adjacents. Elle correspond aussi à un lieu d’ancrages intermyofibrillaires puisque les filaments intermédiaires (desmine, vimentine...) lui sont associés. De plus, c’est par l’intermédiaire de la strie Z que se fait la jonction entre les myofibrilles et la membrane sarcolemmique au niveau des costamères. Ainsi, le disque Z joue un rôle trés important d’ossature dans l’architecture myofibrillaire. Il existe différents niveaux de complexité pour les stries Z selon le type du muscle (cardiaque, squelettique) ou l’espèce (poissons, mammiféres, insectes...) considérés. Des études de microscopie électronique et de reconstruction tridimensionnelle (rayons X) ont permis d’établir un modéle d’organisation de la structure de la ligne Z de muscle de poisson qui représente la structure la plus simple car elle ne comporte qu’un seul jeu de structure " Zig-Zag ". Cependant, de nombreuses précisions quant à la distribution relative et aux relations des protéines qui la constituent restent à apporter. La ligne Z est essentiellement formée de filaments Z qui en assurent l’ossature et d’une matrice amorphe. Ces filaments sont composés d’une protéine homodimérique, dont chaque sous-unité a une masse d’environ 100 kDa, qui se nomme a-actinine. Cette protéine dont l’interaction avec l’actine est connue, semblerait lier à la fois les filaments fins d’un même sarcomère mais aussi ceux des sarcomères adjacents au sein de la ligne Z. Des vues transversales de la ligne Z de poisson confirment l’existence de connections croisées entre les filaments d’orientations opposées. Ainsi, l’extrémité d’un filament d’actine serait en relation, à la fois avec les filaments de même polarité appartenant donc à un même sarcomère, et avec quatre autres  
des filaments issus du sarcomère voisin (Yamaguchi et coll, 1985 ; Morris et coll, 1990 ; Luther, 1991 ; Tskhovrebova, 1991). Il en serait de même pour la titine qui elle aussi peut se lier à l’a-actinine et à l’actine. Plusieurs études ont montré que le disque Z était une structure dynamique dont la morphologie changeait avec l’état de contraction du muscle. Ces transitions se traduisent surtout par une modification de réticulation de la bande Z, détectable en coupe transversale. Dans le muscle relâché, un type de structure de la strie Z appelé la maille SS (small square) (Yamaguchi et al, 1985), prédominerait, alors que dans le muscle contracté, on trouverait plutôt un style de réticulation de type, bw pour basket wave. Ces transitions sont accompagnées d’une augmentation de 10% de la taille du filament Z et d’un épaississement du filament fin (Scroeter et coll, 1991). Des études sur muscles de mammiféres ont montré, que l’a-actinine et le filament fin ne seraient pas les seuls responsables de ces modifications, mais qu’un autre élément, le RIB (relaxed interconnecting body), s’étendant de manière parallèle aux filaments fins, jouerait un rôle essentiel dans la structure apparente du disque Z en microscopie électronique. Schroeter et coll (1996), ont émis l’hypothèse que cet élément serait composé de titine. Par ailleurs, des composants non protéiques, les phospholipides et les lipides, sembleraient avoir une place importante au sein de la strie Z. Ahn et coll (1993) ont estimé que la part de lipides dans la ligne Z constitueraient 1% de la masse totale de la myofibrille. Des études menées par Fukami et coll (1992) ont aussi mis en évidence que dans le muscle blanc de poulet, l’a-actinine était fortement liée au PIP2 (phosphatidyl inositol diphosphate). Pourtant, paradoxalement, des études conduites in vitro  sembleraient montrer que les phospholipides aient le plus souvent une propriété dissociante des interactions protéine-protéine, et ce en particulier dans le cas des complexes actine-protéine associée.  A.2.5. L’ a -actinine :  L'a-actinine a été découverte en 1964 par Ebashi. Elle est présente dans les cellules musculaires et non musculaires. Plusieurs isoformes d'a-actinine sont produites par trois gènes différents à la suite d'un épissage alternatif. Elle fait partie d’une grande famille de molécules, qui sont les protéines d’ancrages et de pontages de l’actine Dans les cellules non musculaires, l'a-actinine rassemble les filaments d'actine en faisceaux ou câbles tels que les fibres de stress. Dans le muscle strié, elle est la composante principale de la strie Z où elle lie entre autre les filaments d'actine. Elle est organisée en homodimères, avec des monomères de 94 à 103kDa, selon l'isoforme. En microscopie éléctronique, elle apparaît comme un batônnet, d’une longueur de 30 à 40nm et d’un diamètre de 3 à 4nm. Les sous-unités ont une orientation antiparallèle (Imamuya et coll 1988). Chaque sous-unité a un domaine de liaison à l'actine (ABD pour actin binding domain) dans sa région N-terminale. Un dimère d'a-actinine peut donc lier deux filaments d'actine, ce qui explique sa capacité à former des réseaux de microfilaments. Chaque molécule d'a-actinine est composée de trois régions bien distinctes (Blanchard et coll, 1989). Les résidus 1 - 245 contiennent trois sites de liaison à l’actine ou ABS (actin binding site). Cette région est bien conservée dans les divers membres de la famille des ABPs (actin binding proteins) (Baron et coll,1987). Elle est suivie de quatre unités répétitives, de 120 acides aminés chacune, homologues aux domaines intermédiaires de la spectrine et organisés en structure "coiled-coil" . La troisième région correspond à l'extrémité C-terminale qui contient deux sites de liaisons au Ca2+, de type " EF-hands ". Ces sites de liaison pour le Ca2+ seraient actifs seulement dans les formes non musculaires (Witke et coll, 1993; Baron et coll, 1987). L'a-actinine a été trouvée dans quasiment toutes les cellules eucaryotes, de l'amibe à l'homme, mais aussi dans les cyanobactéries (Usmanova et coll, 1998). Dans le muscle lisse, l’a-actinine se trouve au niveau des corps denses et de régions de la membrane appelées plaques d'adhésion (Endo et Masaki, 1984), impliquées dans l'adhésion cellulaire. L’importance de l'a-actinine dans le muscle strié a été vérifiée expérimentalement chez la Drosophile. Cet insecte posséde un seul gène d'a-actinine qui donne trois isoformes par épissage alternatif. Dans ce cas des mutations, non létales, induites ( fliA ) inhibent l'expression de l'isoforme musculaire, les muscles affectés sont inactifs et dégénèrent rapidement avec l'âge. Des études en microscopie électronique montrent que malgré une organisation régulière des fibres, le sarcomère est tout de même affecté. Les lignes Z sont irrégulières et moins denses (Fyrberg et coll, 1990; Roulier et coll, 1992). Ces études démontrent que l'a-actinine joue in vivo un rôle important dans l'intégrité du sarcomère et l'organisation du disque Z. En outre, il a aussi été montré que l’a-actinine avait la capacité de se lier avec des phospholipides ou des produits de leur hydrolyse (Meyer et coll, 1982). Grâce à des anticorps spécifiques dirigés contre le PIP2, Fukami et coll (1992) ont montré