MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

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MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nadia BELAÏDOUNI-COMBIER Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études ÉTUDE DU MÉCANISME D'ACTION DE LA PROTÉINE VPR DU VIRUS: UN EXEMPLE DE DÉTOURNEMENT DU SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME PAR UNE PROTÉINE VIRALE Soutenu le 1er décembre 2009 devant le jury suivant : -Président : Christophe Terzian - Rapporteur : Claudine Pique - Examinateur : Katy Janvier - Examinateur : Bruno Canque - Examinateur : Florence Margottin-Goguet Laboratoire EPHE: Directeur : Pr. Bruno CANQUE « Immunologie Cellulaire et immunopathologie » CNRS UMR 5171-IUH, centre Hayem 1 avenue C. Vellefaux 75010 Paris Laboratoire de l'Institut Cochin: Directeur : Dr. Florence Margottin-Goguet « Contrôle du cycle cellulaire et protéines virales » INSERM U567-CNRS UMR 8104 22 rue Méchain 75014 Paris

  • cul4a-ddb1

  • leucine-rich repeat protein

  • détournement des complexes e3

  • ubiquitine ligase

  • arrêt en phase g2 du cycle cellulaire

  • complexe e3

  • ubiquitine ligases par les protéines

  • recrutement du complexe cul5-elongin-roc1 par vif


Publié le : mardi 1 décembre 2009
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MINISTÈRE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nadia BELAÏDOUNI-COMBIER Pour lobtention du diplôme de lÉcole Pratique des Hautes Études ÉTUDE DU MÉCANISME DACTION DE LA PROTÉINE VPR DU VIRUS: UN EXEMPLE DE DÉTOURNEMENT DU SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME PAR UNE PROTÉINE VIRALE Soutenu le 1erdécembre 2009 devant le jury suivant :  -Président : Christophe Terzian - Rapporteur : Claudine Pique Examinateur : Katy Janvier -- Examinateur : Bruno Canque - Examinateur : Florence Margottin-Goguet  
Laboratoire EPHE: Directeur : Pr. Bruno CANQUE « Immunologie Cellulaire et immunopathologie » CNRS UMR 5171-IUH, centre Hayem 1 avenue C. Vellefaux 75010 Paris Laboratoire de lInstitut Cochin: Directeur : Dr. Florence Margottin-Goguet « Contrôle du cycle cellulaire et protéines virales » INSERM U567-CNRS UMR 8104 22 rue Méchain 75014 Paris
RÉSUMÉ DES TRAVAUX : Lactivité la plus largement reconnue de Vpr, une protéine auxiliaire du VIH-1, concerne sa capacité à arrêter les cellules infectées en fin de phase G2 du cycle cellulaire, une phase durant laquelle la transcription du génome viral est optimale. Les données de la littérature saccordent sur le fait que larrêt en transition G2/M résulte du maintien sous forme inactive du complexe Cdk1/cycline B, responsable de lentrée des cellules en mitose. Certaines données de la littérature suggèrent que Vpr sassocie directement avec à des complexes ubiquitine ligases de type culline (ou CRUL pour Cullin-RING-Ubiquitin-Ligase): les cullines Cul-1 et Cul4A. Par ailleurs, ces complexes jouent un rôle majeur dans le contrôle du cycle cellulaire. En 2006, plusieurs publications décrivent une nouvelle famille de protéines appelée « DCAFs » (DDB1 Cul4A Associated Factor) qui en interagissant avec le complexe E3 ubiquitine ligase Cul4A-DDB1, jouent le rôle dadaptateur entre la ligase et le substrat destiné à être dégradé par le protéasome. Parmi ces adaptateurs, nous nous sommes intéressés à la protéine DCAF-1, auparavant identifiée comme étant un partenaire dinteraction de Vpr. Nos travaux ont permis de mettre en évidence le rôle crucial de DCAF-1 dans larrêt en phase G2 du cycle cellulaire induit par Vpr. Notre groupe a été le premier à montrer que pour induire un arrêt en phase G2 du cycle cellulaire, Vpr sassocie à la protéine DCAF-1, afin de recruter le complexe E3 ubiquitine ligase Cul4A-DDB1 et cibler lubiquitinylation dune protéine cellulaire pour être dégradée par le protéasome.
TABLE DES MATIERES LISTEDESABREVIATIONS...... 4 AVANT-PROPOS.. 6 INTRODUCTION.. 8 I.LE SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME 8 A. Le système ubiquitine-protéasome (UPS).. 8  1. Lubiquitinylation. 8  1.1 Assemblage de la chaîne dubiquitine... 8  1.2 Cascade enzymatique.... 9  2. Le protéasome... 10 B. 11Rôle de lUPS dans la régulation du cycle cellulaire..  1. Généralités sur le cycle cellulaire...... 11  2. Dégradations des facteurs impliqués dans la régulation du cycle cellulaire. 11 C. Les E3 ubiquitine ligases à domaine RING.... 12  1. Les complexes APC.. 13  2. Les complexes CRULs...... 13  2.1 Les complexes SCF.. 14  2.2 Les complexes ECS.. 14  2.3 Les complexes Cul3.. 15  2.4 Les complexes Cul4A/4B..15  3. La protéine DCAF-1.. 16 D. Détournement du système ubiquitine-protéasome par les virus : quelques exemples....18 II.LUTILISATION DESE3UBIQUITINE LIGASES PAR LE VIH-1..20 A. VIH-1.. 20  1. La maladie : le SIDA 20  2. Les traitements anti-viraux... 20  3. Classification..... 21  4. Génome du VIH-1..... 21  4.1 Gènes de structure. 22  4.2 Gènes de régulation.. 22  4.3 Gènes « auxiliaires »..... 23  5. Structure de la particule virale... 23  6. Les cellules cibles . 24 7. Le cycle réplicatif.. 24  7.1 Phase précoce.... 24  7.2 Phase tardive..25 B. Détournement des complexes E3 ubiquitine ligases par les protéines « auxiliaires » du VIH-1....26
 1. Recrutement du complexe SCFβTrCPpar Vpu.... 26  1.1 Dégradation du récepteur CD4.. 26  1.2 Inhibition de la dégradation des substrats de laβTrCP. 28  1.3 Inactivation de la Tétherine....... 28  2. Recrutement du complexe Cul5-Elongin-Roc1 par Vif : dégradation de APOBEC3G29 III.PROTEINE VPR ET SA CAPACITÉ À ARRÊTER LE CYCLE CELLULAIRE EN PHASE G2LA 29B.La protéine Vpr... 29  1. Généralités. 29  2. Structure et localisation. 30  3. Activités de Vpr au cours du cycle viral... 30  4.Activité « arrêt G2 » de Vpr.. 31  4.1 Rappel sur la transition G2/M du cycle cellulaire 31  4.2 Blocage du cycle cellulaire en phase G2.. 32  4.3 Données bibiographiques sur lactivité « arrêt G2 » de Vpr. 32  4.3.1 Effets observés sur lactivité transcriptionnelle virale. 33  4.3.2 Vpr et les voies de régulation du cycle cellulaire.... 33  a. Effets de Vpr sur lactivité de Wee1 et Cdc25 33  b. Vpr active la voie ATR... 34 BIBLIOGRAPHIE. 76
LISTE DES ABRÉVIATIONS ADNARNARNmAPC/C ATMATPATRBCRA1TrCPCdkChk1Chk2CMH I CMVCKiCRULsCulDCAFsDDB1DUBECSFBWFBXLFBXOHAARTHECTINLTRMAPIC
Acide desoxiribonucléique Acide ribonucléique Acide ribonucléique messager Anaphase promoting complex/cyclosome Ataxia Telangiectasia MutatedAdénine triphosphate Ataxia Telangiectasia RelatedBreast cancer 1 Beta Transducin repeat Containing ProteinCyclin-Dependent Kinase Checkpoint1Checkpoint2Complexe majeur dhistocompatibilité de classe I Cytomegalovirus Cyclin-dependent Kinase inhibitors Cullin Ring Ubiquitin Ligases Culline DDB1-Cul4A-associed Factor Damage-DNA-binding protein Deubiquitinating enzymeElongin/ cullin /SOCs F-box and WD repeat domain-containing F-box and leucine-rich repeat protein F-box and others protein Highly anti-viral therapy Homolog to the E6-AP carboxy terminus Intégrase Long terminal repeat Matrice Complexe de préintégration
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HPVpRbRevRINGRRERTSCFSOCsSV5SWI/SNF2TARTatUPSVIHXPE
Papillomavirus Rétinoblastome protein Regulation of expression of viral proteins Really interesting new gene Rev responsive element Transcriptase inverse SKP1-Cullin-F-box-protein Suppressor of cytokine signaling Simian virus type 5 Swiching/sucrose non fermating Ttransactivation response element Transactivator of transcriptionUbiquitine-protéasome Virus de limmunodéficience humaine Xeroderma pigmentosum complementation group E
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AVANT-PROPOS Les virus sont des parasites intracellulaires stricts. Pour se répliquer et se disséminer, les virus ont acquis des stratégies efficaces afin dexploiter à leur profit les divers processus cellulaires, comme le système-ubiquitine protéasome. Chez les eucaryotes, le système ubiquitine-protéasome constitue la principale machinerie protéolytique intracellulaire non lysosomale. La destruction sélective des protéines par ce système est assurée par deux événements successifs.Une première étape dubiquitinylation est mise en place par laction de plusieurs enzymes appelées E1, E2 et E3 et qui consiste à marquer, par des molécules dubiquitine, les protéines destinées à être dégradées. La seconde étape est lattaque protéolytique, des protéines poly-ubiquitinylées, par le protéasome 26S, un complexe protéase ATP-dépendant de 2,5 MDa. Les enzymes E3 ubiquitine ligases sont les acteurs essentiels de cette réaction car elles sont responsables de la reconnaissance spécifique des substrats destinées à être dégradés. Le système-ubiquitine protéasome joue un rôle majeur dans le contrôle du cycle cellulaire, en participant à la dégradation chronologique et ordonnée des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire.De nombreux virus ont su détourner à leurs avantages la machinerie du système ubiquitine-protéasome afin de protéger de la dégradation leurs protéines virales ou alors provoquer la dégradation des protéines cellulaires qui pourraient leur être nuisible. Cest le cas du VIH-1, qui a travers les fonctions de ces protéines « auxiliaires » comme Vif et Vpu, est capabledinterférer avec le système ubiquitine-protéasome afin de cibler des protéines cellulaires, comme le facteur de restriction APOBEC3G et le récepteur CD4, vers la dégradation protéasomale.Le VIH-1 présente également la particularité de pouvoir infecter les cellules en division et les cellules en quiescence. La capacité du VIH-1 à moduler le cycle cellulaire est associée à lactivité de la protéine « auxiliaire » Vpr. En effet, Vpr possède la propriété darrêter les cellules en fin de phase G2 du cycle cellulaire. Nous nous sommes donc intéressés à la capacité du VIH-1 à perturber la progression du cycle cellulaire, afin de comprendre comment et pourquoi le virus tire profit du cycle cellulaire de la cellule hôte, et permettre ainsi de découvrir de nouveaux mécanismesimpliqués dansla progression du cycle cellulaire.
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La capacité du VIH-1 à détourner le système ubquitine-protéasome et certaines données de la littérature rapportant des interactions entre Vpr et les complexes E3 ubiquitine ligases, appartenant à la famille dit « CRUL » (Cullin-RING-Ubiquitin-Ligase,) notamment avec le complexe E3 Cul4A-DDB1, nous ont conduis à envisager lhypothèse que les complexes E3 ubiquitine ligases pouvaient participer à lactivité de Vpr, notamment dans son activité darrêt en phase G2 du cycle cellulaire. Des nouvelles données bibliographiques, concernant la découverte dune nouvelle famille de protéines appelée « DCAFs » (DDB1-Cul4A-Associated-Factor-protein), des protéines associées au complexe E3 Cul4A-DDB1, nous ont confortés dans notre hypothèse. En effet, parmi les membres de cette famille, la protéine DCAF-1 a été auparavant identifiée comme étant un partenaire cellulaire de Vpr. Ainsi, mon travail a consisté à déterminer et caractériser le rôle de linteraction entre Vpr et la protéine cellulaire DCAF-1 dans lactivité arrêt en phase G2 du cycle cellulaire de Vpr. INTRODUCTION I.LESYSTÈMEUBIQUITINE-PROTÉASOME Le système ubiquitine-protéasome (UPS) représente la principale machinerie de dégradation non lysosomale des protéines cellulaires et joue un rôle central dans la régulation dévènements cellulaires essentiels tels que le cycle cellulaire, la présentation dantigènes par le complexe majeur dhistocompatibilité de classe I (CMH I), la transcription et la transduction de signaux. Dans ce système, les complexes E3 ubiquitine ligases jouent un rôle prédominant dans le mécanisme dubiquitinylation des protéines qui précède leur dégradation par le protéasome. Elles assurent la spécificité de reconnaissance des substrats destinés à être dégradés. Le rôle crucial joué par les E3 ubiquitine ligases, font delles une cible de choix pour de nombreux virus.  A. Le système ubiquitine-protéasome  1. Lubiquitinylation des protéines cellulaires  La destruction sélective des protéines par le système ubiquitine-protéasome est assurée par deux événements successifs. Le premier est le marquage des protéines destinées à être
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dégradées par la liaison covalente dune chaîne poly-ubiquitine. Le second événement est lattaque protéolytique des protéines poly-ubiquitinylées par le protéasome 26S. Le substrat est dégradé par le protéasome en petits peptides de 7-9 acides aminés, tandis que les molécules dubiquitine sont recyclées. La dégradation par le protéasome 26S des protéines ubiquitinylées peut intervenir dans le cytoplasme et le noyau. 1.1 Assemblage de la chaîne dubiquitine  Lubiquitine est une protéine de 8 kDa constituée de 76 acides aminés. Lubiquitine se lie de façon covalente aux protéines cibles par lintermédiaire de résidus lysine et nécessite des étapes successives impliquant lactivité de plusieurs enzymes spécifiques (1). La liaison covalente entre lubiquitine et le substrat nécessite la fixation du groupement carboxyle du résidu glycine (G76) de lubiquitine à la fonction amine NH2 du résidu lysine du substrat à ubiquitinyler. Il peut se fixer sur le substrat protéique une seule molécule dubiquitine, cest la mono-ubiquitinylation, ou bien plusieurs molécules formant une chaîne, on parle alors de poly-ubiquitinylation. Dans le cas de la poly-ubiquitinylation, la formation de chaînes dubiquitine seffectue entre une lysine de la molécule dubiquitine et lextrémité carboxy-terminale de la suivante. Lubiquitine contient sept résidus lysines (K6, K11, K29, K27, K33, K48 et K63). Seules les lysines K6, K29, K48 et K63 sont impliquées dans la formation de chaînes de poly-ubiquitine. La modification des protéines par mono-ubiquitinylation ou poly-ubiquitinylation change leur fonction. La mono-ubiquitinylation est impliquée dans la régulation du transport intracellulaire des protéines en agissant comme un signal de tri dans la voie dendocytose (2).Pour lapoly-ubiquitinylation, la fixation dun polymère dau moins quatre molécules dubiquitine est nécessaire pour le ciblage du substrat protéique vers la dégradation par le protéasome 26S. Pour engager un signal de dégradation, la chaîne de poly-ubiquitine doit être située sur les résidus lysine 48 et 29. Alors que, la chaîne de poly-ubiquitine K63 participe aux évènements cellulaires tels que, linitiation de la réponse inflammatoire, la fonction des ribosomesin vitroetin vivo, et la réparation de lADN (3).La dissociation des polymères dubiquitine est catalysée par des enzymes de déubiquitinylation, générant des molécules dubiquitine libre (4). 1.2 Cascade enzymatique  La dégradation par le protéasome 26S nécessite le « marquage » des substrats par une chaîne de poly-ubiquitine. Une série de réactions enzymatiques est nécessaire à
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létablissement de cette chaîne poly-ubiquitine. La réaction débute par lactivation, en présence dATP, de lubiquitine par une enzyme activatrice appelée E1. Lubiquitine activée est ensuite transférée à une enzyme de conjugaison E2 qui établi une liaison thioester avec lubiquitine (5,6). Par la suite, lenzyme E2 recrute une enzyme E3 appelée ubiquitine ligase qui interagit directement avec le substrat et transfère la molécule dubiquitine sur celui-ci. Enfin, un dernier type denzyme, appelé E4, pourrait jouer un rôle dans lélongation de certaines chaînes dubiquitine (7). Chez lhomme, il nexiste que deux enzymes E1 et une trentaine denzymes E2. Par contre, compte tenu de la diversité des substrats, il existe une grande variété dE3 ubiquitine ligases. Actuellement, on dénombre entre 500 et 1000 enzymes E3 ligases différentes chez lhomme. On distingue principalement deux grandes classes dE3 ubiquitine ligases : les E3 à domaine HECT (Homolog to the E6-AP carboxy terminus) et les E3 à domaines RING (« really interesting new gene ») (8-10). Les E3 ligases à domaine U et à domaine PHD (plant homeodomain) sont relativement proches des E3 à domaine RING, mais nentrent pas dans cette classification. Je ne développerai pas de paragraphe sur ces deux derniers types dE3.  2. Le protéasome Plusieurs formes de protéasomes sont présentes dans les cellules eucaryotes. Le terme courant du protéasome caractérise le protéasome 26S. Le protéasome 26S est un complexe protéase ATP dépendant de 2,5MDa qui assure la dégradation de protéines poly-ubiquitinylées en hydrolysant lATP. Il est constitué dun core catalytique : le protéasome 20S et de deux sous-unités régulatrices : les complexes 19S et 11S. Dans la cellule, on retrouve toutes les combinaisons possibles de protéasome, le cur 20S seul, associé à deux complexes 19S ou à deux complexes 11S ou bien encore associé à un seul complexe 19S et un seul complexe 11S. B.Rôle de lUPS dans la régulation du cycle cellulaire 1. Généralités sur le cycle cellulaire Le cycle cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule-mère se divise pour générer deux cellules-filles identiques entre elles et à la cellule dont elles dérivent. Ce processus comprend deux phases majeures : linterphase et la mitose. Lensemble est classiquement divisé en quatre phases : G1, S, G2 et M. Les phases G1 et G2, sont des phases
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de jonction (« Gap ») qui précèdent respectivement la phase S (« Synthesis » ou synthèse), durant laquelle lADN est répliqué, et la phase M (« Mitosis » ou mitose), au cours de laquelle les chromosomes dédoublés sont répartis dans les deux cellules-filles. Le déclenchement, le contrôle et la succession des différentes étapes du cycle cellulaire sont coordonnés par une famille de protéines kinases, les kinases cyclines-dépendantes (CDKs). Lactivation des CDKs est contrôlée par des évènements de phosphorylation, de déphosphorylation et par leur association à des protéines dites cyclines. Il existerait 13 CDKs et 25 cyclines (pour revue oncologie 2003). Les régulateurs négatifs des CDKs sont les inhibiteurs CKI (cyclin-dependent kinase inhibitors) appartenant à la famille INKA (p16, p15, p18 et p19), et à la famille Cip/Kip (p27, p21 et p57) (11).  2. Dégradation des facteurs impliqués dans la régulation du cycle cellulaire  La progression du cycle cellulaire est finement régulée par des étapes de phosphorylation/déphosphorylation, mais également des étapes de dégradation orchestrées par le système ubiquitine-protéasome. Les études génétiques et biochimiques, réalisées principalement sur le bourgeonnement de la levure, ont permis didentifier et de caractériser deux complexes E3 ubiquitine ligases majeures qui interviennent dans la régulation du cycle cellulaire : les complexes SCF (SKP1-Culline1-F-box-protein) (12) et les complexes APC/C (Anaphase-Promoting Complexe/Cyclosome) (13). Ces complexes sont actifs à des moments différents du cycle cellulaire, mais agissent de concert pour réguler leur propre activité. En effet, les complexes APC/C, actifs du début de la mitose jusquà la phase G1, induisent, entre autre, la dégradation de la cycline A, de la sécurine et de la cycline B (14,15). Les complexes de type SCF sont, quant à eux, actifs de la fin de la phase G1 jusquau début de la mitose. Parmi les complexes SCF, on peut citer le complexe SCFSKP2 cible des régulateurs qui négatifs du cycle tels que p27, p21, et p57, permettant ainsi la progression du cycle cellulaire en phase S et G2. Le complexe SCFFBW7 quant à lui, induit la dégradation de régulateurs positifs du cycle tels que Myc, Jun, Cycline E et Notch. On peut encore citer la dégradation des protéines, Emi 1, Cdc25 (16)et Wee1 (17) par le complexe SCFβTrCP. La dégradation de la protéine Emi 1 intervient en début de mitose juste après la rupture de lenveloppe nucléaire (18). Un défaut de la dégradation de la protéine Emi1 se traduit par un arrêt de la division des cellules qui ne peuvent plus progresser en mitose. La kinase Wee1 et les phosphatases Cdc25 régulent lactivité CDK (Cyclin-Dependant-Kinases) (19,20). C. Les E3 ubiquitine ligases à domaine RING
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