MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES

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MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Hélène BERNARD Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études Développement d'une méthode d'interférence ARN chez la souris pour l'étude des mécanismes moléculaires intervenant dans le développement de l'épilepsie mésiotemporale Soutenu le 1er Octobre 2010, devant le jury suivant : Président : Marcilhac Anne Rapporteur extérieur : Deglon Nicole Examinateur : Lombard Marie-Christine Laboratoire d'accueil : Centre de recherche INSERM « Grenoble – Institut des Neurosciences » U836 Inserm-UJF-CHU-CEA Équipe N°9 « Dynamique des réseaux synchrones épileptiques » Tuteur scientifique : Antoine Depaulis () Laboratoire de tutelle EPHE : INSERM U710, Université de Montpellier 2, EPHE Mécanismes moléculaires dans les démences neurodégénératives Tuteur pédagogique : Jean-Michel Verdier ()

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Publié le : vendredi 1 octobre 2010
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Source : ephe.sorbonne.fr
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                                                                                                            MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre  MEMOIRE  Présenté par Hélène BERNARD Pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études  Développement d’une méthode d’interférence ARN chez la souris pour l’étude des mécanismes moléculaires intervenant dans le développement de l’épilepsie mésiotemporale   Soutenu le 1 er Octobre 2010, devant le jury suivant : Président : Marcilhac Anne Rapporteur extérieur : Deglon Nicole Examinateur : Lombard Marie-Christine
 Laboratoire d’accueil : Centre de recherche INSERM « Grenoble – Institut des Neurosciences » U836 Inserm-UJF-CHU-CEA Équipe N°9 « Dynamique des réseaux synchrones épileptiques » Tuteur scientifique : Antoine Depaulis (antoine.depaulis@ujf-grenoble.fr)  Laboratoire de tutelle EPHE : INSERM U710, Université de Montpellier 2, EPHE Mécanismes moléculaires dans les démences neurodégénératives Tuteur pédagogique : Jean-Michel Verdier (jean-michel.verdier@univ-montp2.fr)  
 
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
DEVELOPPEMENT D’UNE METHODE D’INTERFERENCE ARN CHEZ LA SOURIS POUR L’ETUDE DES MECANISMES MOLECULAIRES INTERVENANT DANS LE DEVELOPPEMENT DE L’EPILEPSIE MESIOTEMPORALE  Hélène BERNARD
                                                           A l’heure actuelle plusieurs technologies visent à bloquer l’expression d’une protéine ou son action au niveau d’un récepteur  ou d’une enzyme. Dans le cadre d’un projet utilisant une approche par modélisation mathématique, mon objectif a été de développer deux techniques d’interférence ARN permettant d’obtenir la diminution du taux de certaines protéines au niveau d’une région précise du cerveau chez la souris. Ces techniques sont l’électroporation de siRNA et l’infection par lentivecteurs sh-RNA. Leur efficacité, les types cellulaires transfectés et leur potentielle toxicité ont été évalués dans un modèle d’épilepsie mésiotemporale chez la souris. Dans un premier temps, l’expression de la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) a été utilisée comme gène rapporteur pour chacune de ces techniques. Le plasmide pEGFP-C1 pour l’électroporation et le sh-RNA exprimant la GFP pour l’infection par lentivecteurs.  Dans un deuxième temps, le but a été d’invalider l’expression de protéines d’intérêts dans le développement de l’épilepsie chez la souris. Plusieurs techniques d’observations qualitatives et d’analyses quantitatives ont été nécessaires. Les résultats obtenus montrent que la technique d’ARN interférence la plus efficace dans nos conditions est l’infection par lentivecteurs sh-RNA. En effet, l’utilisation de vecteurs lentiviraux a permis d’infecter un nombre significatif  de cellules (neurones  et  astrocytes) dans la zone d’injection,  pendant une période de plusieurs jours et avec  peu de toxicité. L’application de cette approche a permis de réduire les taux d’ARNm d’une neurorophine : le BDNF (brain derived neurotrophic factor). De plus, la perte cellulaire observée dans le modèle d’épilepsie mésiotemporale chez la souris a été réduit en bloquant cette protéine mais également en bloquant l’expression d’une protéine déterminée par modélisation mathématique. L’interférence ARN par lentivecteurs offre donc des possibilités d’exploration du rôle de certaines protéines dans le développement d’une pathologie ou d’une fonction physiologique qui sont discutées dans ce mémoire.    Mots clés : interférence ARN, électroporation, lentivirus, hippocampe, épilepsie mésiotemporale, BDNF, neurodégénérescence.
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5  L ÉPILEPSIE  MÉSIOTEMPORALE  (EMT)...............................................................................................................5  C HEZ L HOMME ........................................................................................................................................................................5  U N MODÈLE ANIMAL D ’EMT  : LA SOURIS KAÏNATE ..........................................................................................................6  P ROCESSUS  CELLULAIRES  ET  MOLÉCULAIRES  SURVENANT  AU  COURS  DE  L ÉPILEPTOGENÈSE  DANS  L EMT  CHEZ  LA  SOURIS  KAÏNATE ......................................................................................................................................8  R APPELS ANATOMIQUES D UN HIPPOCAMPE NORMAL .....................................................................................................8  R ÔLE D UNE NEUROTROPHINE : LE BDNF ..................................................................................................................... 11  C ONTEXTE  DE  L ÉTUDE ....................................................................................................................................... 13  L E PROJET VALAPODYN .................................................................................................................................................. 14  P ROTÉINES CANDIDATES ISSUES DE LA MODÉLISATION INFORMATIQUE ................................................................... 16  S TRATÉGIE  DE  L ÉTUDE ...................................................................................................................................... 17  
 
 
 
 
BBIILGOPHRA..IE........................TCOI.N..........................NTIDURO
 
Abréviations  ADN : Acide désoxyribonucléique  AP  : Antéro‐postérieur  ARN : Acide ribonucléique  ARNm : Acide ribonucléique messager  ARNi : Acide ribonucléique interférence  ARNt : Acide ribonucléique de transfert  BDNF : Brain derived neurotrophic factor   DV  : Dorso‐ventral  dsRNA  : Double stranded RNA  EEG  : Electroencéphalographie  ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay  EMT : Epilepsie Mésiotemporale  GFAP : Glial fibrillary acidic protein  GFP : Green fluorescence protein  IRM : Imagerie par Résonnance magnétique  KA  : Acide kaïnique  ML  : Médio‐latéral  PAP : Poly A polymérase  RISC : RNA induced silencing complex  shRNA : Short hairpin RNA   SNC : Système nerveux central  VALAPODYN : Validated Predictive Dynamic Model of Complex Intracellular Pathways Related to Cell Death and Survival
 Introduction  L’épilepsie mésiotemporale (EMT)  Chez l’homme Les épilepsies constituent un ensemble de maladies neurologiques qui affectent environ 0,8% de la population et qui se manifestent par des crises ayant des expressions cliniques très différentes. Ces crises épileptiques ont pour origine l’hyperactivation mais aussi la synchronisation de neurones, qui se situent au sein de circuits neuronaux plus ou moins étendus et qui sont spécifiques d’une forme donnée d’épilepsie. Ces « générateurs de crises » résultent le plus souvent d'une organisation et/ou d’un fonctionnement anormal de certains circuits neuronaux pendant la maturation du cortex cérébral. Notre travail s’est effectué sur une forme d’épilepsie particulière, l’épilepsie mésiotemporale, étudiée dans l’équipe d’Antoine Depaulis, en particulier dans le cadre d’un projet Européen VALAPODYN (Validated Predictive Dynamic Model of Complex Intracellular Pathways Related to Cell Death and Survival), qui sera détaillé plus loin.  L’épilepsie mésiotemporale (EMT) se caractérise par la récurrence spontanée de décharges électriques focales qui prennent naissance dans les structures du lobe temporal ( hippocampe, amygdale, cortex entorhinal et pyriforme ) et qui se propagent occasionnellement jusqu’aux aires corticales et/ou à certains noyaux du thalamus (Wieser and Hane, 2004). Ces décharges focales sont généralement associées à des sensations épigastriques, des troubles de la conscience, des automatismes oroalimentaires ou verbaux et des postures dystoniques du bras contralatéral à la décharge épileptique (Engel, 1996). Chez 80% des patients atteints d’EMT, un traumatisme initial (convulsions fébriles complexes, infections) a pu être identifié pendant la petite enfance (Cendes et al., 2002). Les premiers épisodes épileptiques se manifestent quelques mois ou quelques années après le traumatisme initial mais aucun symptôme n’est observé pendant cette période de latence aussi appelée “période silencieuse”. Cependant, durant cette période, plusieurs processus moléculaires se développent et participent à la mise en place de circuits aberrants capables de générer des crises d’épilepsies. En effet, chez la plupart des patients, ce syndrome est associé à une
 
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atrophie de l’hippocampe qui peut être visible par Imagerie à Résonance Magnétique (IRM) (Cendes et al., 2002). Plus précisément, l’examen histologique du lobe temporal après résection chirurgicale révèle souvent des pertes neuronales au niveau des aires CA1/CA3 et dans le hile de l’hippocampe ainsi qu’une gliose importante et un bourgeonnement des fibres moussues au niveau de la région supragranulaire du gyrus denté (Houser, 1990). Ces modifications caractérisent la « sclérose hippocampique ». Chez 50 à 75% des patients, une dispersion et une hypertrophie des cellules granulaires du gyrus denté sont observées (Houser, 1990; Engel, 1996). Toutes ces modifications suggèrent donc une importante réorganisation des circuits de l’hippocampe qui se développe sur plusieurs mois ou années. Une des caractéristiques importante du syndrome d’EMT est le développement d’une résistance des patients à la plupart des médicaments anti-épileptiques qui en fait l’une des formes d’épilepsie les plus préoccupantes (Semah et al., 1998). Pour ces patients, lorsque cela est possible, la chirurgie de résection du lobe temporal devient alors la thérapie la plus efficace (Engel, 1996). Elle est réservée à certains patients lorsque le foyer et clairement identifiable et qu’il n’est pas localisé dans une région vitale du cerveau. Ainsi, seulement un tiers des patients peuvent bénéficier de ce traitement chirurgical qui présente certains risques et effets indésirables.  Un modèle animal d’EMT : la souris kaïnate  L’aspect silencieux de cette pathologie ne permet pas à l’heure actuelle de procéder à certaines analyses telle que l’imagerie médicale (IRM, PET Scan,...). Ceci pour des raisons techniques, éthiques et économiques. Ainsi, de façon à pouvoir étudier cette forme d’épilepsie et en particulier son épileptogenèse, plusieurs modèles animaux ont été développés principalement chez le rat (Cavazos and Sutula, 1990; Inoue et al., 1992; Lehmann et al., 1998; Brandt et al., 2004). La plupart des modèles obtenus après un état de mal ( i.e.  convulsions continues) de plusieurs heures induit par un convulsivant (kaïnate, pilocarpine) par voie systémique, ne reproduisent généralement qu’une partie des caractéristiques de l’EMT, ou sont associés à des lésions cérébrales très étendues ou encore ne présentent pas de résistance particulière aux antiépileptiques comme c’est le cas chez les patients. Depuis quelques années, l’équipe d’Antoine Depaulis a développé un nouveau modèle d’EMT chez la souris suite à l’observation de caractéristiques histologiques de sclérose de l’hippocampe après l’injection unilatérale de kaïnate (KA) dans cette structure (Bouilleret, 1999). Chez la
 
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souris adulte, une injection unilatérale de kaïnate dans l’hippocampe dorsal induit des pertes cellulaires ipsilatérales au niveau de CA1, CA3 et du hile, ainsi qu’une gliose et un bourgeonnement des fibres moussues (Bouilleret, 1999). Durant les semaines qui suivent l’injection de KA, on peut également observer une dispersion radiaire progressive et une hypertrophie des cellules granulaires du gyrus denté. Ce modèle de syndrome d’EMT est l’un des seuls actuellement à présenter une telle modification histologique.  Pendant les 2-3 premières semaines après l’injection de KA, des décharges focales spontanées récurrentes se développent progressivement puis restent stables durant toute la vie de l’animal (Riban et al., 2002). Elles surviennent régulièrement avec une durée moyenne de 15 à 20s, lorsque l’animal est dans un état de veille calme. Pendant ces décharges, les animaux cessent leur activité et présentent parfois de légers automatismes. Occasionnellement, les animaux présentent des décharges qui se prolongent au delà de 40s, gagnent le cortex et sont associées à des convulsions. Ces crises sont en partie résistantes aux médicaments anti-épileptiques classiques (valproate, carbamazépine, lamotrigine), et ne sont diminuées de façon dose-dépendante qu’à la suite de l’injection de diazépam ou de prégabalin (Higgins et al.; Riban et al., 2002). Les antiépileptiques classiques (carbamazépine, valproate, lamotrigine) peuvent bloquer les décharges mais à des doses qui induisent des effets secondaires importants sur l’EEG et/ou sur le comportement (Higgins et al.).  Ainsi, l’injection unilatérale de KA dans l’hippocampe chez la souris, reproduit à la fois les caractéristiques histologiques, électriques, comportementales et pharmacologiques du syndrome de l’EMT. L’utilisation de souris, plutôt que de rats offre un avantage important pour une analyse transcriptomique, mais également pour l’utilisation d’animaux transgéniques. Ceci en raison de la connaissance très poussée du génôme de cette espèce et de la possibilité de réaliser des mutations dirigées.    
 
 
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Processus cellulaires et moléculaires survenant au cours de l’épileptogenèse dans l’EMT chez la souris kaïnate  
Rappels anatomiques d’un hippocampe normal  L’hippocampe est une structure sous corticale enroulée sur elle même, possédant sur sa face dorsale un fuseau de fibres appelé fimbria constituant le fornix. L’hippocampe fait partie des structures qui composent le système limbique et il est impliqué notamment dans la formation de la mémoire à long terme, la navigation spatiale et l’orientation dans l’espace. L’hippocampe se divise en plusieurs structures:
Le gyrus denté ( GD ) qui possède 3 couches cellulaires : le stratum granulosum ( sg ), le stratum moléculare ( sm ) et une couche polymorphique ( cp ).
 Le stratum granulosum contient les corps cellulaires des cellules granulaires, alors que le stratum moleculare est composé des segments terminaux des dendrites apicales de ces cellules. Enfin, la couche polymorphique est formée par les axones des cellules granulaires qui se rassemblent pour donner naissance aux fibres moussues ( fm ). La corne d’Ammon est une structure subdivisée en 3 secteurs : CA1 , CA2  et CA3 , chacun ayant des propriétés particulières. La corne d’Ammon possède plusieurs couches cellulaires : l’alveus ( a ), le stratum oriens ( so ), le stratum pyramidale ( sp ) et les stratum radiatum ( sr ) et moleculare ( sm ). L’alveus contient les axones des cellules pyramidales dirigées vers la fimbria ou le subiculum ( S ). Le stratum oriens, situé entre l’alveus et les cellules pyramidales, contient les dendrites basales de ces dernières. Le stratum pyramidale quant à lui, contient les corps cellulaires des cellules pyramidales et les stratum radiatum et moleculare contiennent les segments terminaux de l’arbre dendritique apicale. Dans le CA3, il éxiste une couche supplémentaire reconnue qui est le stratum lucidum. Cette couche se trouve entre le stratum pyramidale et le stratum radiatum et reçoit les fibres moussues des cellules granulaires.
 
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 Le circuit trisynaptique de l’hippocampe  
Le cortex entorhinal ( EC ) est la porte d’entrée et de sortie principale des informations, qui sont envoyées au gyrus denté par l’intermédiaire de fibres constituant ce que l’on appelle la voie perforante ( pp ). C’est alors que l’information passe des cellules granulaires aux fibres moussues, puis à la région CA3, où il y aura synapse entre les fibres moussues du gyrus denté et les dendrites des cellules pyramidales de CA3. L’information remonte ensuite le long des axones des cellules pyramidales de la zone CA3 qui vont se projeter par l’intermédiaire des collatérales de Schaeffer ( sc ), sur les dendrites des cellules pyramidales de la zone CA1. Celles-ci projettent leurs axones soit vers le subiculum qui se projette au niveau du cortex entorhinal, soit vers le cortex entorhinal lui même
 
 Types cellulaires présents dans l’hippocampe  
Il existe différents types cellulaires au sein de l’hippocampe, comme dans la majorité du système nerveux central.
Les neurones pyramidaux, nommés ainsi à cause de leur forme, constituent la majeure partie des cellules du stratum pyramidale de la corne d’Ammon. Ces cellules peuvent avoir une morphologie différente selon la zone où elles se situent dans l’hippocampe. En effet, les neurones pyramidaux des zones CA2 et CA3 sont plus larges et moins condensés que dans le CA1. Dans le gyrus denté, les neurones principaux sont des cellules granulaires, de petite taille, de forme arrondie et qui ne possédent pas de dendrites basales. Environ 12% des neurones présents dans l’hippocampe sont des cellules dites non-pyramidales, c’est à dire qu’elles n’appartiennent ni à la classe des cellules pyramidales, ni aux cellules granulaires.
Ces cellules non-pyramidales sont les cellules en corbeille ( so ), les neurones fusiformes dans le hile ( H ), les cellules en corbeille de type pyramidal ( sg ) et enfin, les cellules bipolaires et multipolaires ( sp ).
75% des cellules non neuronales sont des astrocytes, distinguées en 2 types. Les astrocytes de type I sont fibreux et ont une morphologie ressemblant aux neurones. Les astrocytes de type II
 
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sont eux plus compacts, plus larges et plats. Il existe également plusieurs types de cellules gliales dans l’hippocampe, commes les cellules NG2+, les oligodendrocytes, la microglie.
 
Types cellulaires atteints dans le modèle d’EMT et neurodégénérescence  
Les processus moléculaires qui surviennent entre le traumatisme initial et la survenue des premières crises d’épilepsie dans l’EMT sont encore très mal caractérisés. Pourtant, leur connaissance pourrait permettre de mieux comprendre certains aspects de la neuroplasticité dans le cerveau en maturation et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques de l’EMT. Plusieurs modifications des circuits hippocampiques ont été décrites parmi lesquelles un bourgeonnement des fibres moussues et plusieurs processus morphologiques qui rappellent la maturation du système nerveux (Ben-Ari, 2001). Certaines études ont suggéré notamment
que l’augmentation de la prolifération de cellules progénitrices de la zone subgranulaire du gyrus denté observée après un état de mal induisait ces changements morphologiques (Goldman et al., 1997). Cette hypothèse est toutefois contestée par d’autres études réalisées chez l’homme ou dans d’autres modèles animaux qui indiquent que la  neurogenèse est au contraire réduite dans l’EMT (Mathern et al., 2002; Hattiangady et al., 2004; Kralic et al., 2005; Fahrner et al., 2007). Ceci est également le cas dans le modèle de souris kaïnate dans lequel une baisse de la neurogenèse a été mise en évidence au cours des jours qui suivent l’injection de KA par le marquage de la protéine double-cortine spécifique des neurones en formation (Kralic et al., 2005; Heinrich et al., 2006; Nitta et al., 2008). Cependant, de nouvelles cellules gliales sont générées au sein de l’hippocampe injecté et forment un nouveau réseau de type « glie radiaire » (Fahrner et al., 2007; Nitta et al., 2008).
 
D’autres hypothèses attribuent un rôle important à la mort cellulaire initiale qui survient dans les 24-48h qui suivent l’injection de kaïnate (Bouilleret et al., 2000; Riban et al., 2002). La sclérose hippocampique indique en effet une perte neuronale sélective de certaines populations (neurones pyramidaux et interneurones des régions CA1, CA3 et hile), alors que d’autres populations comme les cellules granulaires du gyrus denté sont maintenues. Il semblerait que ce phénomène soit l’élément déclencheur d’une cascade d’évènements moléculaires conduisant en quelques semaines à un remaniement important des circuits
 
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nerveux de l’hippocampe. Ce remodelage des circuits nerveux de l’hippocampe se caractérise par une germination axonale et une réorganisation synaptique. Effectivement, la perte des neurones de l’hippocampe dans les zones CA3 et le hile est suggérée comme déclencheur potentiel de la germination des fibres moussues. De plus le kaïnate provoque des changements morphologiques des cellules granulaires du gyrus denté. En effet, de 4 jours à 8 semaines après injection de kaïnate, un élargissement progressif de la couche des cellules granulaires est observé ainsi qu’un grossissement de ces cellules et une augmentation de l’espace intercellulaire (Suzuki et al., 1995; Heinrich et al., 2006). Le contact étroit entre les cellules est alors perdu, les cellules se dispersent dans la couche moléculaire et prennent peu à peu la place laissée par la corne d’Ammon. On notera aussi que les neurones du subiculum, du CA2 et quelques neurones pyramidaux de CA3 ne sont pas touchés.
La perte neuronale est associée à une gliose réactionnelle marquée par une forte augmentation de l’immunoréactivité des astrocytes pour le marqueur astrocytaire GFAP (glial fibrillary acid
protein) dans l’hippocampe ayant reçu l’injection de kaïnate et pas au niveau contralatérale à cette injection. Cette astrogliose, qui est très concentrée dans le hile et dans les couches moléculaires, est plus étalée dans les cellules granulaires du gyrus denté. Ceci est également observé après l’injection de kaïnate dans l’amygdale qui provoque aussi une prolifération des
cellules gliales et une activation de la microglie dans l’hippocampe dans des zones où il y a une perte cellulaire (hile et CA3). (Niquet et al., 1993; Represa et al., 1993b; Represa et al., 1993a; Niquet et al., 1994).
 
Rôle d’une neurotrophine : le BDNF  
 Généralités Les neurotrophines sont une famille de facteurs de croissance ayant un rôle dans la différenciation des neurones et dans leur survie ou non. On compte au moins 4 protéines chez les mammifères dans le système nerveux central (SNC) et périphérique (SNP) : le NGF (nerve growth factor), le NT-3 (neurotrophine 3), le NT-4/5 (neurotrophine 4/5) et le BDNF (brain derived neurotrophic factor). Ces neurotrophines se lient à un récepteur ayant une activité tyrosine kinase appelé kinase tropomyosine (Trk) (Barbacid, 1994; Huang and Reichardt, 2003).
 
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