MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Violaine TRIBOLLET Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Caractérisation des propriétés et activités des six isoformes de p63 Soutenu le 7 mars 2007 Devant le jury composé de : Docteur Claude CARON de FROMENTEL, Examinateur Professeur Jean Marie EXBRAYAT, Examinateur Docteur Sylvie GAZZERI, Examinateur Docteur Pierre HAINAUT, Examinateur Docteur Flore RENAUD-PAÏTRA, Présidente Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés Université Catholique de Lyon, 25 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02 Directeur pédagogique : Jean-Marie EXBRAYAT () Laboratoire d'accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale Directeur : Alain PUISIEUX Centre Léon Bérard, 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08 Directeur scientifique : Claude CARON de FROMENTEL () Caractérisation des propriétés et activités des six isoformes de p63 La famille p53 est composée de trois gènes, TP53, TP63 et TP73. Ces gènes codent pour plusieurs isoformes parmi lesquelles on distingue des formes transactivatrices TA et des formes tronquées d'une partie du domaine de transactivation présent en N-terminal, appelées DN. Les formes TA sont des facteurs de transcription qui modulent l'expression de nombreux gènes cibles impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose, ou la sénescence.

  • altération de l'expression de tp63 dans les cancers humains

  • acro-dermato-ungual-lacrymal-tooth

  • ectrodactyly-ectodermal dysplasia-clefting

  • mutations dans les cancers

  • p63 chez l'homme

  • dégradation lysosomiale

  • tp63

  • phase de dégradation cellulaire

  • p63

  • modèle cellulaire


Source : ephe.sorbonne.fr
Nombre de pages : 47
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE


ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

Sciences de la Vie et de la Terre


MEMOIRE

Présenté par

Violaine TRIBOLLET


Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

Caractérisation des propriétés et activités des
six isoformes de p63


Soutenu le 7 mars 2007

Devant le jury composé de :
Docteur Claude CARON de FROMENTEL, Examinateur Professeur Jean Marie EXBRAYAT,
Docteur Sylvie GAZZERI, Pierre HAINAUT, Examinateur
Docteur Flore RENAUD-PAÏTRA, Présidente



Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés
Université Catholique de Lyon, 25 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02
Directeur pédagogique : Jean-Marie EXBRAYAT (jmexbrayat@univ-catholyon.fr)



Laboratoire d’accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale
Directeur : Alain PUISIEUX
Centre Léon Bérard, 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08
Directeur scientifique : Claude CARON de FROMENTEL (CARONDEF@lyon.fnclcc.fr)

Caractérisation des propriétés et activités
des six isoformes de p63

La famille p53 est composée de trois gènes, TP53, TP63 et TP73. Ces gènes codent pour
plusieurs isoformes parmi lesquelles on distingue des formes transactivatrices TA et des formes
tronquées d’une partie du domaine de transactivation présent en N-terminal, appelées DN. Les
formes TA sont des facteurs de transcription qui modulent l’expression de nombreux gènes cibles
impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose, ou la sénescence. Les formes DN inhibent
EPHE Banque de Monographies SVT 1l’activité des formes TA. De ce fait, la prolifération et la survie des cellules sont étroitement
dépendantes de l’équilibre entre ces deux formes.
Si les fonctions des membres de la famille p53 commencent à être mieux identifiées, les mécanismes
qui régissent leur expression et leur stabilité sont encore peu connus. Pour cette raison, nous avons
entrepris d’étudier les six isoformes de p63, en termes de stabilité et d’activité.
Pour cela, nous avons analysé l’expression, les modifications post-traductionnelles, la demi-
vie, ainsi que la dégradation des isoformes, après surexpression transitoire ou stable de chacune des
isoformes de p63 dans les cellules Hep3B. Cette étude a été réalisée en présence et en absence de
stress génotoxique avec de la doxorubicine.
En absence de stress, l’expression des différentes isoformes est variable. Leur demi-vie est assez
courte (moins d’une heure), excepté pour l’isoforme DNp63g, et leur dégradation est dépendante du
protéasome. Dans les clones stables, l’expression semble être inversement proportionnelle à l’activité
anti-proliférative exercée par l’isoforme étudiée. Le traitement à la doxorubicine induit une
augmentation du taux d’expression des six isoformes. Cette augmentation s’accompagne d’une
hyperphosphorylation de certaines isoformes (a et b). De plus, nos résultats suggèrent que cette
augmentation d’expression pourrait être due à une diminution de la dégradation de p63 par le
protéasome.
L’étude présentée a permis de mieux caractériser les isoformes de p63 et surtout, de comparer les
propriétés des six isoformes dans un même environnement cellulaire. L’étape suivante consistera à
étudier et comparer leurs activités et fonctions dans notre modèle cellulaire.

Mots clés : TP63, stabilité, activités, modifications post-traductionnelles, réponse au stress



SOMMAIRE


INTRODUCTION...................................................................................................................................... - 1 -
LA CANCEROGENESE...................................................................................................................... 1
I. LE CANCER..................................................................................................................................... 1
A. Définition.................................................................................................................................... 1
B. Classification des tumeurs.............................................................................................................. 1
C. Processus de Cancérogenèse........................................................................................................... 2
II. MÉCANISMES IMPLIQUÉS DANS LA TUMORIGENÈSE.............................................................................. 3
A. Le cycle cellulaire......................................................................................................................... 3
1.
Généralités.................................................................................................................................................................................................
3
2. Contrôle du cycle cellulaire..................................................................................................................................................................
4
a.
Généralités............................................................................................................................................................................................
EPHE Banque de Monographies SVT 24
b. Les différents complexes cycline/Cdk au cours du cycle cellulaire.................................................................................... 4
c. Régulation des complexes cycline/Cdk...................................................................................................................................... 5
B. Mort cellulaire............................................................................................................................. 6
1. Les différents types de mort cellulaire............................................................................................................................................... 6
2.
L’apoptose.................................................................................................................................................................................................
6
a. Phase
d’initiation............................................................................................................................................................................... 7
b. Phase de
décision7
c. Phase de dégradation cellulaire......................................................................................................................................................
7
C. La sénescence cellulaire................................................................................................................. 9
III. DIFFÉRENTS FACTEURS À L’ORIGINE DE LA TUMORIGENÈSE................................................................. 9
LA FAMILLE TP53........................................................................................................................... 12
I. LES DIFFÉRENTS MEMBRES DE LA FAMILLE TP53............................................................................... 12
II. P53 CHEZ L’HOMME..................................................................................................................... 12
A. Structure génomique et protéique de p53......................................................................................... 12
B. Les différentes formes de p53........................................................................................................ 13
C. Activités et fonctions de p53.......................................................................................................... 14
III. P73 CHEZ L’HOMME.................................................................................................................... 16
A. Structure génomique et protéique de p73 16
B. Les différentes formes de p7316
C. Expression et rôles de p73............................................................................................................ 17
IV. P63 CHEZ L’HOMME18
A. Structure génomique et protéique de p63......................................................................................... 18
V. RELATIONS ENTRE LES DIFFÉRENTS MEMBRES DE LA FAMILLE TP53.................................................... 19
ETUDE DE TP63............................................................................................................................... 20
I. EXPRESSION DE TP63..................................................................................................................... 20
A. Profil d’expression de TP63 dans les tissus sains adultes................................................................... 20
B. Implication de p63 au cours du développement................................................................................. 20
1. Le modèle des souris TP63-/-.............................................................................................................................................................
20
2. Maladies associées à une altération de TP63................................................................................................................................. 22
C. Rôle de p63 dans la différenciation de l’épiderme adulte.................................................................... 23
II. ACTIVITÉS DE P63......................................................................................................................... 24
A. Rôle de p63 comme facteur de transcription..................................................................................... 24
1. p63 active et réprime des gènes cibles de p53.............................................................................................................................. 24
a. Les formes TAp63............................................................................................................................................................................
24
b. Les formes
DNp63............................................................................................................................................................................ 25
2. p63 active et réprime des gènes cibles spécifiques..................................................................................................................... 25
EPHE Banque de Monographies SVT 33. Activités relatives des différentes isoformes................................................................................................................................ 27
a. Structure de p63...............................................................................................................................................................................
27
b. Interaction avec d’autres facteurs de transcription................................................................................................................ 27
III. RÉGULATION DE LA STABILITÉ ET DES ACTIVITÉS DE P63................................................................... 28
A. Généralités sur les systèmes de dégradation des protéines.................................................................. 28
1. La dégradation lysosomiale...............................................................................................................................................................
28
2. Protéolyse par des protéases spécifiques....................................................................................................................................... 28
3. Dégradation dépendante du protéasome......................................................................................................................................... 28
a. Structure et fonctionnement du protéasome............................................................................................................................ 29
b. Processus d’ubiquitination et de protéolyse.......................................................................................................................... 29
B. Dégradation de p63 par le protéasome............................................................................................ 29
C. Modulation de l’activité de p63 par interaction avec d’autres protéines................................................ 31
D. Modifications post-traductionnelles de p63...................................................................................... 32
1. Acétylation de p63................................................................................................................................................................................
32
2. Phosphorylation de p63......................................................................................................................................................................
32
3. Sumoylation de p63.............................................................................................................................................................................
33
IV. RÔLES DE P63............................................................................................................................. 34
A. Implication de p63 dans la sénescence............................................................................................. 34
B. p63 et réponse au stress............................................................................................................... 35
V. IMPLICATION DE P63 DANS LES CANCERS HUMAINS........................................................................... 37
A. p63 et mutations dans les cancers.................................................................................................. 37
B. Altération de l’expression de TP63 dans les cancers humains.............................................................. 38
C. Le modèle murin TP63+/-............................................................................................................ 38
D. Certaines isoformes de p63 possèdent-elles un pouvoir oncogénique ou oncosuppresseur ?...................... 39
1. Les isoformes TAp63............................................................................................................................................................................
39
2. Les isoformes
DNp63............................................................................................................................................................................ 40
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................................ 40
Unités de mesures & Abréviations


Unités de mesures :

ml : millilitre µl : microlitre
mM : millimolaire µM micromolaire
nM : nanomolaire nm : nanomètre
g :grammes µg : microgrammes
h : heure min : minute
s : seconde % : pourcentage
DO : densité optique g : force centrifuge
V : volt mA : milliampère
EPHE Banque de Monographies SVT 4kDa : KiloDalton J/m² : Joules par m²
°C: degré Celsius


Abréviations

A
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc: ADN complémentaire
ADULT: Acro-Dermato-Ungual-Lacrymal-Tooth

AEC: Ankyloblepharon-Ectodermal dysplasia-Clefting

APE : Alternate p63/p73 Element
ARN : Acide RiboNucléique
ARNi : ARN interférence
ARNm : ARN messager
ATP : Adénosine TriPhosphate

B
BET: Bromure d’Ethidium
BH : Bcl-2 Homology
BSA : Albumine Sérique Bovine

C
Caspase: Cysteinyl-aspartate-cleaving proteases

Cdk : Cyclin-dependent kinases
Cdki : - inhibitors
CHC : Carcinome HépatoCellulaire
CMV : Cytomégalovirus

D
DAD: Dako Antibody Diluent
DISC : Death-Inducing Signaling Complex
dNTP : désoxyNucléotide TriPhosphate
DMSO: Diméthyl Sulfoxide
DOXO: doxorubicine (= adriamycine)
DTT : DiThioThreitol

E
ECL : Electro ChimiLuminescence
EDTA : acide EthylèneDiamineTétraAcétique
EEC : Ectrodactyly-Ectodermal dysplasia-Clefting

ER : Elément de Réponse
ETO : étoposide

F
FasL: Ligang de FAS
EPHE Banque de Monographies SVT 5H
HEPES : acide N-2-HydroxyEthyl-Piperazine-N’-2-Ethane-Sulfonique

HNSCC : Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

I
IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein
Ig: Immunoglobulines
INK4 : INhibitor of CdK

J
jpc : jours post-coïtum

K
KCL : chlorure de potassium
KIP : Kinase Inhibitory Protein
KO : Knock-Out

L
LB : L-Broth
LMS : Limb-Mammary Syndrome
LOH : Loss Of Heterozygosity

M
MEF : Mouse Embryo Fibroblast
MEM : Minimum Essential Medium
MMS : Methyl Methane Sulphonate

N
NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate

NES : Nuclear Exportation Signal
NLS : Localisation
NP40 : Nonidet P40

P
PBS : Phosphate Buffered Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
PSA : PerSulfate d’Ammonium
PVDF : PolyVinylineDiFluoride



R
ROS : Reactive Oxygen Species

RT-PCR : Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

S
SAM : Sterile Alpha Motif
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SHFM : Human Split-Hand/Foot Malformation
EPHE Banque de Monographies SVT 6SRB : SulfoRhodamine B
SUMO : Small Ubiquitin-related MOdifier
SVF : Sérum de Veau Fœtal
SV40 : Simian Virus 40

T
TBE : Tris Borate EDTA
TCA : TriChloroacetic Acid
TE: Tris EDTA
Tm : Température de fusion

U
UV : rayonnement ultraviolet

Liste des gènes

A
ADA : Adenosine Deaminase
AIF : Apoptosis Inducing Factor
APAF-1: Apoptosis Protein Activating Factor
ATM : Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase
ATR : Telangiectasia and Rad3 related

B
BAD: BCL2-Antagonist of cell Death
BAI-1 : Brain-specific Angiogenesis Inhibitor 1
BAK: BCL2-Antagonist/Killer1
BAX : BCL2-Associated X protein
BCL2: B-Cell Lymphoma 2
BCLX: B-Cell 2 like X
BCR-ABL: Break point Cluster Region-Abelson
BIM: BCL2-Interacting Mediator of cell death
BIRC5 : Baculoviral IAP Repeat-Containing 5 (=survivine)
BMP7: Bone morphogenetic protein 7
BPAG-1 : Bullous Pemphigoid AntiGen 1
BRCA1: Breast Cancer 1

C
CBP : CREB Binding Protein
CCNB1 : Cycline B
CCND1 : D
CDC25 : Cell Division Cycle 25 homolog
CHK1 et 2 : Check point Kinases 1 et 2

E
EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor
EPHA2: EPH receptor A2
ERCC2 et ERCC3 : Excision Repair Cross-Complementing rodent repair deficiency, complementation
group 2 et group 3
EVPL: Envoplakine
EPHE Banque de Monographies SVT 7
F
FADD : Fas-associating Protein with Death Domain
FDXR : Ferredoxin Reductase
FOS: FBJ murine osteasarcoma viral oncogen homolog

G
GADD45A : Growth Arrest and DNA Damage inducible protein 45 Alpha
GPX2 : Glutathione Peroxidase 2
GSK3b : Glycogen Synthase Kinase 3 beta

H
HIF-1 : Hypoxia Inducible Factor 1
HSP70 : Heat Shock Proteins 70

I
IAP: Inhibitor of Apoptosis Protein
IGFBP3: Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3
IGF-IR : -Like-I Receptor
ITGA3 : Integrin alpha 3

J
JAG 1 et 2 : Jagged 1 et 2
JUN : « 17 en japonnais »

M
MASPIN: mammary serpin
MDM2 : Mouse Double Minute 2 (hDM2 chez l’homme)
MDR1 : Multi Drug Resistance 1
MMP-1 et MMP-13 Matrix Metalloproteinase 1 et 13
MYC : v-myc myelocytomatosis viral oncogen homolog

N
NF-Y : Nuclear Factor Y
NF-kB: kappa B

P
PARP1 :Poly (ADP-Ribose) Polymerase family, member 1
PCAF : p300/CBP-associated factor
PCNA : Proliferative Cell Nuclear Antigen
PEDF : Pigment Epithelium-Derived Factor
PERP : P53 apoptosis Effector Related to PMP-22
PIG3 : P53-Inducible Gene 3
PML: Pro-Myelocytic Leukemia
PP2A : Protein Phosphatase 2A
PUMA : P53 Up-regulated Modulator of Apoptosis


R
RACK1 : Receptor of Activated protein Kinase C
RB: Rétinoblastome
EPHE Banque de Monographies SVT 8REDD1: REgulated in development and DNA Damage response
RPA : Replication Protein A

S
S100A2 : S100 calcium binding protein Alpha 2
SIRT1: silent mating type information regulation 2
SMARCD3: SWI/SNF-related, Matrix-associated, Actin-dependent Regulator of Chromatin, subfamily D
member 3

T
TBP: TATA-Binding Protein
TGF: Tumor Growth Factor
TNF: Necrosis Factor
TSP-1: Thrombospondine-1

V
VDR : Vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) Receptor
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor

W
WAF1/CIP1 : Wild-type p53-Activated Fragment/Cdk2 Inhibiting Protein

X
XPC: Xeroderma Pigmentosum group C
XPE : Xeroderma E

Y
YB1 : Y-box Binding protein 1









INTRODUCTION




EPHE Banque de Monographies SVT 9


- LA CANCEROGENESE -

LA CANCEROGENESE
Le mot « cancer » est un terme général désignant un ensemble de plus de cent maladies
différentes qui possèdent des caractéristiques qui leur sont propres, mais aboutissent toutes à une
croissance incontrôlée des cellules, qui s’accumulent pour former une tumeur et éventuellement des
métastases. Il existe deux types de tumeurs (amas non structurés de cellules), les tumeurs bénignes et les
tumeurs malignes ou cancer. Les tumeurs bénignes sont localisées et sont caractérisées par une absence
de croissance, d’invasion et de dissémination des cellules dans les autres tissus. A l’opposé, les tumeurs
malignes sont mal limitées, modifient l’aspect du tissu d’origine et l’envahissent localement, puis
envahissent d’autres tissus. Le cancer peut se développer dans presque tous les organes. Les organes les
plus touchés dans les populations occidentales sont le sein, la prostate, les poumons, l’appareil digestif et
la gorge, la peau et le cerveau. Les tumeurs hématopoïétiques sont également très fréquentes. Les
cellules tumorales peuvent migrer dans d’autres organes. On parle alors de métastases. Néanmoins, elles
conservent toujours leurs caractéristiques cellulaires d’origine. En fonction de leur origine, les cellules
tumorales vont préférentiellement migrer dans certains organes cibles.
Les tumeurs malignes peuvent être classées en quatre groupes majeurs, selon les tissus à partir
desquels elles se développent : les carcinomes, les sarcomes, les lymphomes et les leucémies.
Les carcinomes sont les cancers les plus répandus, ils représentent 80% des cancers. Il s'agit de
tumeurs malignes naissant dans le tissu épithélial, c’est à dire à partir des cellules épithéliales constituant
la surface externe des organes ou délimitant les cavités internes (peau, muqueuses). De nombreux
organes possèdent des muqueuses, comme l'intestin, l'appareil génital, l'appareil urinaire, l'estomac ou
encore les poumons. D'autre part, il existe, associé au tissu de recouvrement, des tissus comme le sein, le
foie, le pancréas, la prostate, etc., qui sont également susceptibles de se cancériser. Il existe trois types de
carcinomes : Le carcinome épidermoïde, constitué de cellules reproduisant une structure semblable à
l'épiderme, et qui est essentiellement retrouvé au niveau de la peau, de la bouche, des poumons, de
l'anus, du vagin et du col de l'utérus ; le carcinome épithélial glandulaire (également appelé
adénocarcinome) qui touche les structures glandulaires comme le sein, la prostate, les reins mais
également l'utérus ou la thyroïde ; enfin le carcinome indifférencié (également appelé carcinome à petites
cellules) qui est le plus grave. Il touche parfois les bronches.
Les sarcomes sont des tumeurs malignes qui se développent à partir des cellules
mésenchymateuses, c'est à dire aux dépens du tissu conjonctif, principalement les muscles, l'os et le
cartilage. Le sarcome possède la caractéristique d'être composé de cellules en prolifération très active.
Ces cancers représentent environ 2% de l'ensemble des cancers. Ils surviennent essentiellement chez les
sujets jeunes et chez les enfants. Il est possible de distinguer deux types de sarcomes, selon qu'ils se
développent sur le tissu conjonctif commun ou dans le tissu spécialisé. Les sarcomes du tissu conjonctif
EPHE Banque de Monographies SVT 10

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