Ministere de la jeunesse de l'éducation nationale et de la recherche

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Ministere de la jeunesse, de l'éducation nationale et de la recherche ecole Pratique de hautes etudes Sciences de la Vie et de la Terre MéMoire Présenté par Agnès DOREAU Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes rôle des Protéines twist-1 et twist-2 dans l'altération des MécanisMes de sauvegarde cellulaire 29 septembre 2006 Soutenu devant le jury suivant : Président Jean-Luc Vayssière Tuteur pédagogique Jean-Marie Exbrayat Tuteur scientifique Stéphane Ansieau Examinateur Patrick Melhen Examinateur Emmanuelle Gormally Directeur : Pr. Jean-Marie EXBRAYAT Laboratoire de Biologie Générale Université Catholique de Lyon 25 rue du Plat – 69002 Lyon Directeur : Pr. Alain PUISIEUX Centre Léon Bérard – Unité Inserm 590 Inactivation fonctionnelle de p53 28 rue Laënnec – 69373 Lyon Cedex 08 Une cellule normale est soumise à une succession de cycles de division. Chacune des EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • pcr quantitative en temps réel

  • transitions des phases g1

  • rt pcr

  • protéines twist

  • cellule normale

  • succession de cycles de division

  • altération de l'intégrité du génome

  • prolifération cellulaire

  • adn arn

  • rt-pcr semi-quantitative


Publié le : vendredi 1 septembre 2006
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Ministere de la jeunesse,de léducation nationale et de la recherche   ecolePeutaqir dehautesetudes Siees de la Vie et de la Terre  MéMoire  Préseté par  Agès DOREAU Pour lobtention du diplôme de lEcole Pratique des Hautes Etudes
   
  
rôle des Protéinestwist-1ettwist-2dans l altération des MécanisMes de sauvegarde cellulaire
29 septembre 2006 Souteu devat le jury suivat :   Présidet Jea-Lu Vayssière Tuteur pédagogique Jean-Marie Exbrayat Tuteur scientifique Stéphane Ansieau Examinateur Patrick Melhen Examinateur Emmanuelle Gormally
   Directeur : Pr. Jean-Marie EXBRAYAT          hoatonlyr.fjembxaray@tnuvic-Laboratoire  de Biologie Générale Université Catholique de Lyon 25 rue du Plat 69002 Lyon  Directeur : Pr. Alain PUISIEUX       iupueislcncfrc.lyx@.fon Centre Léon Bérard – Unité Inserm 590 Iativatio fotioelle de p53 28 rue Laënnec – 69373 Lyon Cedex 08 Une cellule normale est soumise à une succession de cycles de division. Chacune des
phases du cycle cellulaire est hautement régulée au niveau des points de contrôle et en particulier lors des transitions des phases G1/S (Gap 1/Synthèse) et G2/M (Gap2/Mitose, Pommier Y et al., 2003). Le bon fonctionnement de ces régulations est essentiel pour garantir une prolifération cellulaire normale et s’assurer de l’intégrité du patrimoine génétique. Un disfonctionnement peut avoir deux conséquences : favoriser l’apparition de mutations ou une mauvaise ségrégation (cellules polyploïdes). Les mutations peuvent concourir à l’altération des fonctions ou de la régulation d’un certain nombre de gènes. Dans une cellule normale, l’activation des oncogènes ou l’altération de l’intégrité du génome peut avoir pour conséquence d’induire un arrêt définitif du cycle cellulaire (sénescence) ou une mort cellulaire programmée (apoptose, Ben-Porath I and Weinberg R, 2005). La réponse engendrée suite à une activation oncogénique dépend de la nature de la voie de signalisation induite. Ainsi l’oncogène Myc est davantage associé à l’apoptose et l’oncogène Ras à la sénescence. Si cette hypothèse est vérifiée depuis longtempsitro vi, l’importance de l’altération des mécanismes de sauvegarde i vivo est la tumorigénèse démontrée que depuis peu comme un élément déterminant dans (Bartkova Jet al, 2005 ; Braig M et al., 2005 ; Chen Z et al., 2005 ; Collado M et al., 2005 ; Michologlou C et al., 2005). Notre équipe s’intéresse aux protéines Twist et leur rôle dans les mécanismes de sauvegarde cellulaire. Plus particulièrement, mon travail a consisté à analyser le rôle des protéines Twist-1 et Twist-2 dans la neutralisation de la sénescence cellulaire induite par une forme activée de l’oncogèneaR.s
tables desMresatie  TESABL DSEMSEREITA3 _________________________________________ TBLEA DESITIOnSLLUSTRA _____________________ ______________________________________ LIEST SDEASBRBAIvéNoIT 7 ____________________ PETIARI  ITRnnOITcUDO i- i  rpp p__________ 8 ___________________ ii- cy   ____________________________________ 8 2.1 Cycle cellulaire_______________ 8 _____________________________________________________ 2.2 Régul cy le cellulaire_______________________________________________________ ation du c10 2.2.1 Synthèse et destruction cyclique de protéines ____________________________10 2.2.2 Cyclines, kinases dépendantesyc_______________  des clines et leurs inhibiteurs 11 2.2.3 Complexes CyclineD/Cdk4,6_11 _________________________________________ 2.2.4 Protéines Rb et E2F 12 ________________________________________________ 2.2.5 La protéinp21f______________________________________________ e 11/WaCip 12 2.2.6 La protéine p27iK1p____12 _____________________________________________ 2.2.7 Les protéines p16Ia4KN51p ,NKI4b, 8p1I4cNKp 9IKNd4________________________ et 1 13 y le cellulaire et c___________________________________________________________ 13 2.2 C c ancer iii Mm  mè___________________________________ 14 -
3.1 Proto-oncogènes et oncogènes_______________________________________________________ 14 ènes suppresseurs de tumeurs_____________________________________________________ 3.2 G15 3.2.1 Mise en évidence et définition________________________________________ 15 3.2.2 Classification des gènes suppresseurs de tumeurs_________ ________________16 3.2.3 La protéie p53__________________________ _________________________16 3.2.4 La protéine Rb____________________________________________________  17 iv- l      pf _______________ 18 4.1 Sén p ativ__________________________________________________ escence cellulaire ou ré lic e19 4.2 Princip s vo_____________________________________________ ale ies de la sénescence induite19 4.3 Voies de signalisation de la sénescence cellulaire_______________________________________ 20 v- a  mm        21 _________________________________________________________________ 5.1 Locus INK4a/Arf21 5.2 Régulations directes_______________________________________________________________ 22 l ___________________________________________ vi- èTWIST22 6.1 Homologies entre Twist-1 et Twist-2________________________________ 22 ___ ______________ 6.2 Rôle de Twist-1 dans le développement embryonnaire__________________________________ 23 6.3 Twist et pathologie : Syndrome de Saethre-Chotzen____________________________________ 23 6.4 Twi , apoptose e_______________________________________________________ 24 st-1 t cancers 6.6 Twist-1, transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et mé_______________________ 5 tastase2 ___________________________________________________________ 6.7 Twist et chimiorésistance26 sauveg de cellulaire :__ 6.7 Twist-1 et altération des mécanismes de ar un rôle dans la sénescence ?27 _____________ PARETIII – MATEIREL TEMTéEDoHS ______ ManiPulation des lignees cellulaires i- rp  f my m (MeF) ii c  -__________________________ 2.1 Entretien des cellules ___________________________________________ 2.2 Culots cellulaires (culots secs)___________________________________ 2.3 Transfections cellulaires et infections _____________________________ 2.3.1 Transfection des PlatE et PlatA___________________ 2.3.2 Transfection des MEF immortalisées par E1A_ ________ 2.3.3 Ifetio des ellules réeptries__________________ iii-Mesure de l’activité luciférase_ ______ ________ clonages __________________________________ i- Pp   mp Xli-b ii- ep   Xli- _________ iii- c  dna  rna  p t_ 3.1 Clonage des cDNA des protéines Twist ____________________________ 3.2 Clonage ShRNA Twist-1 dans le ve p etro Super puro_________ cteur R _______________________ ANALYSE D’EXPRESSION i- ampf   p   _____   Pcr 1.1 PCR et RT-PCR _______________________________________________ 1.2 RT-PCR semi-quantitative______________________________________ 1.2.1 Synthèse des ADN complémentaires(cDNA)__________  
1.2.2 PCR quantitative en temps réel____________________ 1.2.3 Quantification________________________________ II- Mise en évidence de l’arrêt du cycle en phase G1 par cytométrie en flux iii-Analyse des ARN et extraction des ARN totaux__ iv- ay  p__________________ _____ 4.1 Extractions protéiques_________________________________________ 4.2 Dosage des p___________________________________________ rotéines 4.3 Western Blott g______________________________________________ in 4.3.1 Préparation des échantillons et électrophorèse en gel de polyacrylamide 4.3.2 Transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose 4.3.3 Saturation et incubation des antp______________ icors ____________________________________ 4.3.4 Révélation _ eXPeriMentation aniMale - tuMorigenicite i- t  fm  : fm      m m-    ii- t  m_____  z   n _____________________ PRAITEIII - RéSULTATS I- Collaboration entre les protéines Twist et l’oncogèneRsadans l’immortalisation et  fm   pmtioriv  1.1 Tests d’immortalisation ________________________________________ ________________________________________ 1.2 Tests de transformation ii- dff  miv voientre les deux lignées iii- t-1      p à       m   IV- Mécanismes d’inhibition de la sénescence prématurée par les protéines Twist 4.1 voie p__________________________________ Inhibition de la 16 – Rb e la voie p 3_______________________________________ 4.2 Inhibition d 5 Analy des tumeurs___________________________________________ 4.3 se IV- Twist inhibe différentiellement l’induction du gèneFAR p à ff è V- L’inhibition de p16 et p21 est directement dépendante des protéines Twist PAEITRIV  DIISSUncOS ETPIVESEPTcESR __________ i- M     anisme d’altération des voies de sauvegarde cellulaire par Twist : une action à plusieurs niveaux II- Différence de tumorigénicité des protéines Twist : l’apport d’un nouveau modèle d’étude  III- Extension du modèle établi __________________ iv- cmp  mm  mè  t-1oiv vi: un nouveau défi, de nouveaux outils 
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