MINISTÈRE DE LA JEUNESSE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE

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MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE présenté par NAURA CHOUNLAMOUNTRI Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études Soutenu le 08 Novembre 2005 devant le jury composé de : Dr. Norbert KOENIG Président Dr. Geneviève CORDIER Rapporteur Dr. Santiago RIVERA Rapporteur Dr. Nicole THOMASSET Examinateur Dr. Claire MEISSIREL Examinateur Laboratoire d'EPHE : Interactions cellulaires, Rétrovirus et Cancer EPHE-UMR 754-INRA- ENVL Université Claude Bernard, Lyon. Directeur d'étude-EPHE : Dr. Geneviève Cordier E-mail : Laboratoire d'accueil : INSERM U. 433, Neurobiologie expérimentale et physiopathologie Faculté de Laënnec, Lyon. Directeur : Dr. Marie-Françoise Belin Responsable scientifique : Dr. Nicole Thomasset E-mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1

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  • molécule de guidage axonal


Publié le : mardi 1 novembre 2005
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MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L’ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE présenté par
NAURA CHOUNLAMOUNTRI
Pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études  
Soutenu le 08 Novembre 2005 devant le jury composé de : Dr. Norbert KOENIG Président Dr. Geneviève CORDIER Rapporteur Dr. Santiago RIVERA Rapporteur Dr. Nicole THOMASSET Examinateur Dr. Claire MEISSIREL Examinateur
Laboratoire d’EPHE : Interactions cellulaires, Rétrovirus et Cancer EPHE-UMR 754-INRA-ENVL Université Claude Bernard, Lyon. Directeur d’ é tude-EPHE  : Dr. Geneviève Cordier E-mail : genevieve.cordier@univ-lyon1.fr  Laboratoire d'accueil : INSERM U. 433 , Neurobiologie expérimentale et physiopathologie Faculté de Laënnec, Lyon. Directeur : Dr. Marie-Françoise Belin Responsable scientifique : Dr. Nicole Thomasset E-mail : thomasse@lyon.inserm.fr
Résumé : La compréhension des mécanismes qui sous-tendent la capacité des cellules souches nerveuses à migrer sur de grandes distances et à se différencier dans un type cellulaire approprié est un enjeu important pour la thérapie cellulaire dans le système nerveux. Cependant le rôle du microenvironnement dans la migration des progéniteurs nerveux reste encore restreint. Notre objectif est d'étudier les molécules impliquées dans les changements d'orientation de la migration tangentielle à la migration radiale des précurseurs du cervelet. Ce changement de migration dépend de l'extension de l'axone et les molécules de guidage impliquées dans ce processus sont encore à caractériser. Nous utilisons le modèle de développement du cervelet qui présente l'avantage d'être constitué en couches cellulaires successives où les précurseurs nerveux proliférent, puis commencent leur migration tangentielle suivie d'une migration radiale jusqu'à la couche granulaire interne du cervelet où s'effectue leur différenciation finale. Notre étude a montré que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), une molécule impliquée dans l'angiogenèse, est fortement exprimée dans les neurones de Purkinje avec l'expression de son récepteur Flk-1 restreint aux cellules granulaires de la couche profonde de la couche granulaire externe (CGE). Cette expression spatiotemporelle du ligand-récepteur coïncide avec la migration radiale des cellules granulaires et nous avons développé des méthodes in vitro  pour caractériser l'effet du VEGF sur des cultures de cellules granulaires purifiées, des cultures de précurseurs et de coculture. Ainsi, nous avons montré que le VEGF exerce une action chimioattractante sur le corps cellulaire, sur le cône de croissance et l’axone des cellules granulaires par l'intermédiaire de son récepteur Flk-1. Plus précisément, l'effet local du VEGF sur l'orientation du cône de croissance a été évalué en utilisant un test chimiotropique standard. La confirmation physiologique de ces résultats a été obtenue en étudiant la migration des cellules granulaires chez une souris mutante VEGF d / d  où le gradient de VEGF est perturbé dans le cervelet en développement. Nous montrons qu’il se produit chez ces souris une accumulation des cellules granulaires à l'interface de la couche profonde de la CGE et de la couche moléculaire provoquant un retard de migration des cellules granulaires.
En conclusion, nos résultats montrent que le VEGF contribue au guidage cellulaire et axonal
des précurseurs nerveux.  TABLE DES MATIERES 1. LISTE D’ABRÉVIATIONS.................................................................... 2.  INTRODUCTION.................................................................................. 3.  RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................... 3.1. L E  CERVELET ................................................................................................................... 3.1.1.   Organisation du cervelet adulte.................................................................................
3.1.2.   Histologie du cervelet................................................................................................ 3.2. D ÉVELOPPEMENT  DU  CERVELET ......................................................................................... 3.2.1.   Développement embryonnaire du cervelet................................................................ 3.2.2.   Développement postnatal du cervelet......................................................................... 3.3. L A  MIGRATION  DES  PRÉCURSEURS  DU  CERVELET .................................................................. 3.3.1.   La migration tangentielle.......................................................................................... 3.3.2.   La migration radiale................................................................................................. 3.4. L ES  MÉCANISMES  DE  GUIDAGE ........................................................................................... 3.4.1.   Le guidage de la glie radiaire.................................................................................... 3.4.2.   Le guidage par les composants de la matrice extracellulaire.................................... 3.4.3.   Molécules d’adhésions permettant la migration des granulaires.............................. 3.4.4.   Orientation de la migration par les molécules de guidage axonal............................ 3.4.5.   Conclusion................................................................................................................. 3.5.          R ÔLE  DU  FACTEUR  DE  CROISSANCE  DE  L ENDOTHÉLIUM  VASCULAIRE (VEGF) DANS  LE  CERVELET      
LISTE D’ABRÉVIATIONS ADN :  acide désoxyribonucléique ARNm :  acide ribonucléotide messager
bFGF : facteur de croissance de fibroblaste de base BDNF : facteur neurotrophique dérivé du cerveau BME :  milieu de base de Eagle BrdU  :  bromodésoxyuridine BSA :  serum albumine bovine
CAM :  molécule d’adhésion cellulaire CFV/VIII : facteur de coagulation V et VIII CGE :  couche granulaire externe CGI :  couche granulaire interne CM :  couche moléculaire CP :  couche de Purkinje CUB :  complément de liaison Dapi :  4,6-diamidino-2-phénylindole-déhydrochloride
E :  embryonnaire
FGF :  facteur de croissance du fibroblaste
GABA : acide gamma aminobutyrique GBSS :  solution saline équilibrée de Gey
HBSS :  solution saline équilibrée de Hanks
Ig :  immunoglobuline
kDa : kilo Dalton
MAM :  méprine, A5, µ MEC :  matrice extracellulaire MEM :  milieu essentiel minimal MMPs  :  métalloprotéases matricielles MT-MMP  : membrane type métalloprotéases matricielles
NgCAM :  molécule d’adhésion cellulaire de type neuro-gliale NrCAM : molécule d’adhésion neuronale
P :  postnatal PBS :  tampon phosphate 0,1M pH 7.4-chlorure de sodium 0,15M PBS-CMF : PBS  dépourvu de calcium et magnésium PBST: PBS-triton X100 0,3% psi :  pression du circuit d’assistance de direction PFA :               paraformaldehyde
SB :  substance blanche SNC :  système nerveux central
TyrK :  tyrosine kinase
VEGF :  facteur de croissance de l’endothélium vasculaire VPF :  facteur de perméabilité vasculaire  
INTRODUCTION La mise en place des structures du système nerveux central (SNC) au cours du développement nécessite des mécanismes cellulaires précis, permettant aux précurseurs nerveux de migrer, de se différencier, et aux axones en croissance de naviguer jusqu’aux régions cérébrales adéquates. Les précurseurs nerveux, nés dans la zone ventriculaire, stoppent leur prolifération dès leur sortie de cette zone et migrent sur des longues distances pour atteindre leur cible finale où ils achèvent leur différenciation. Ce processus est contrôlé et coordonné, pour une large partie, par des facteurs de microenvironnement. Ces facteurs regroupent des composants divers tels que les molécules de la matrice extracellulaire, des facteurs de croissance, des facteurs neurotrophiques, des facteurs hormonaux et des facteurs de guidage. Parmi ceux-ci, le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF-A) découvert comme facteur spécifique de croissance des cellules endothéliales a été impliqué depuis dans de nombreux
processus du développement, y compris l’angiogenèse, la vasculogenèse et l’hématopoïèse chez les vertébrés et non vertébrés. Récemment, sa fonction s’est élargie à un rôle de facteur de prolifération et de migration neuronale dans le SNC. Le VEGF est un facteur crucial pour le développement vasculaire et la perte d’un allèle résulte d’une létalité embryonnaire précoce (Carmeliet et al ., 1996, Gerber et al ., 1999, Ferrera et al ., 2001). Dans le SNC, le VEGF participe à la neurogenèse des précurseurs nerveux in vivo et in vitro  (Jin et al ., 2002) et a un rôle protecteur dans certaines pathologies neurodégénératives comme la sclérose amyotrophique latérale (Lambrechts et al ., 2003, Azzouz et al ., 2004, Storkebaum et al., 2005). Ainsi le VEGF exprimé dans les cellules nerveuses joue un rôle important dans le développement du système nerveux et dans la survie des neurones. Or, au cours du développement du cervelet, la migration orientée des précurseurs est un processus clé pour la mise en place des structures cérébrales. Si le rôle du VEGF dans le SNC a été montré dans la migration des précurseurs, son rôle dans l’orientation de la migration reste à démontrer. Cette étude est importante car elle ouvre un champ d’investigation pour le VEGF comme molécule de guidage axonal.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Pour caractériser la migration des précurseurs nerveux sous l’effet du VEGF-A, nous avons choisi le modèle du développement du cervelet. Celui-ci présente l’avantage d’être organisé en couches de cellules constituées d’un nombre limité de types cellulaires, et organisées en relation avec les processus de prolifération, d’apoptose, ou de migration des précurseurs des cellules granulaires.
L E  CERVELET Le cervelet occupe une position centrale dans le maintien de l’équilibre et de la posture. C’est un centre nerveux qui relie la sphère cognitive à la sphère motrice. Le cervelet joue donc un rôle important dans le contrôle des mouvements volontaires mais aussi involontaires. Il contrôle par exemple les réflexes de redressement, l’adaptation posturale, la régulation de l’équilibre et il participe au contrôle de la motilité axiale et d’attitude. Cet organe présente les particularités de se développer précocement pendant l’embryogenèse et ce processus se poursuit longtemps après la naissance, pendant plusieurs semaines de la vie postnatale.
Organisation du cervelet adulte Le cervelet est ancré dorsalement sur le tronc cérébral et est situé au-dessus du quatrième ventricule. Il est formé de trois lobes : le lobe central appelé vermis et deux lobes latéraux appelés hémisphères cérébelleux (figure 1). Sa surface entière est creusée de fissures et de sillons transversaux délimitant des lobes antérieurs et postérieurs et des lobules au nombre de dix chez les mammifères. La partie périphérique du cervelet forme le cortex cérébelleux qui se compose, de la surface au centre, d’une superposition de couches uniformes. La couche superficielle située sous la pie-mère est la couche moléculaire  (CM)  : elle se caractérise par la présence d’interneurones (cellules en panier et cellules étoilées) et des projections de l’arbre dendritique très ramifié des cellules de Purkinje, des cellules de Golgi, des cellules de Bergmann et des axones des cellules granulaires qui constituent les
fibres parallèles. Les dendrites des deux groupes d’interneurones (cellules étoilées et cellules en panier) sont orientées vers la surface et leurs épines sont contactées par les fibres parallèles. Leurs axones se connectent avec les cellules de Purkinje en s’enroulant autour de leur soma dans le cas des cellules en panier ou en contactant leurs dendrites dans le cas des cellules étoilées. Les fibres parallèles des cellules granulaires rentrent en contact avec les dendrites des interneurones et les excitent, et ceux-ci à leur tour inhibent les cellules de Purkinje. Puis vient la couche des cellules de Purkinje ( CP) constituée des soma des cellules de Purkinje. Sous cette couche apparaît la couche la plus interne : la  couche granulaire interne  (CGI) constituée d’interneurones de type granulaire pour la majorité et de cellules de Golgi peu nombreuses. La toute dernière couche constituée de la substance blanche (SB) se compose de fibres afférentes et efférentes du cervelet. Le cervelet communique avec les autres structures cérébrales par trois systèmes de fibres afférentes (les fibres moussues, les fibres grimpantes et d’autres fibres diffuses moins individualisées) et un système de fibres efférentes (les axones des cellules de Purkinje). L’ensemble des fibres est rassemblé dans les pédoncules cérébelleux qui relient le cervelet au tronc cérébral. Les fibres moussues proviennent de différents noyaux extracérébelleux de la moelle épinière, du tronc cérébral et du pont. Leurs terminaisons axonales excitatrices contactent les dendrites des cellules granulaires disposées dans la CGI et les axones des cellules de Golgi. Les fibres grimpantes sont originaires du complexe olivaire inférieur controlatéral et se projettent directement sur les dendrites des cellules de Purkinje et la CM, à raison d’une fibre par cellule de Purkinje. La troisième catégorie de fibres est issue du locus  cœruleus  et des noyaux du raphé et se projette sur les cellules de Purkinje et la CM. Les seules efférences du cervelet sont formées des axones des cellules de Purkinje et se projettent sur les noyaux profonds (dentelés, fastigiaux et emboliformes).
Histologie du cervelet Une des premières grandes découvertes sur l’organisation du cortex cérébelleux eut lieu en 1911 par Ramon Y Cajal. Il établit que leur cytoarchitecture était une structure en couches et renfermait des neurones et des cellules gliales en nombre réduit. L’illustration de la figure 2 montre les principales subdivisions du cortex cérébelleux. La couche la plus profonde est la couche granulaire interne (CGI), elle contient 90% de neurones granulaires . Ces cellules de petite taille (4 à 6 micromètres) et abondantes constituent un trait spécifique du cervelet. Chaque cellule possède trois à cinq dendrites contactées par les fibres afférentes dites fibres moussues . À l’opposé du pôle dendritique, l’axone se prolonge hors de la CGI, traverse la CP et se termine en forme de « T » dans la couche moléculaire (CM). Il s’y divise en deux branches qui s’allongent parallèlement à la surface corticale. Ce réseau de collatérales forme les fibres parallèles dans la CM qui établissent des synapses en contact avec les dendrites des cellules de Purkinje, les cellules en panier, les cellules étoilées et les cellules de Golgi. De nombreuses fibres parallèles (500.000 fibres) parcourent et croisent ainsi le chemin d’arborisation dendritique des cellules de Purkinje. Bien que les neurones granulaires soient majoritaires, les interneurones comme les cellules de Golgi sont également présents dans la CGI. Leur soma et leur axone sont localisés dans la CGI, leurs extensions dendritiques s’arborisent dans la CM. Les fibres parallèles qui croisent les dendrites des cellules de Golgi les excitent par libération du glutamate, et la
cellule de Golgi en retour module l’activité de la cellule granulaire par libération d neurotransmetteur inhibiteur d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). Les cellules granulaires sont les seules cellules excitatrices du cervelet et ont pour neurotransmetteur principal le glutamate. D’autres types de neurones peu représentés et dont la fonction est controversée se trouvent dans la CGI comme les cellules de Lugaro, les cellules « pâles », les cellules « unipolaires en brosse ». Au-dessus de la CGI se trouve la couche des cellules de Purkinje. L’arborisation dendritique des cellules de Purkinje est très ramifiée et se projette vers la CM, tandis que leur axone myélinisé continue son parcours à travers la CGI pour atteindre la SB avant de se terminer sur les neurones des noyaux profonds. Les axones des cellules de Purkinje constituent les seules efférences du cortex cérébelleux, et leur activité principale est d’inhiber l’activité excitatrice des neurones des noyaux profonds par l’intermédiaire du GABA, leur principal neurotransmetteur. La coche moléculaire située dans la partie la plus superficielle du cervelet contient peu de cellules, mais est riche en fibres (dendrites et axones des interneurones ; fibres parallèles des granulaires ; dendrites des cellules de Purkinje, dendrites des cellules de Golgi et fibres grimpantes). Deux types cellulaires bien distincts d’interneurones sont logés dans la CM : les premiers sont des cellules en panier  localisées dans la première moitié, la plus profonde de la CM et les seconds sont les cellules étoilées , plus petites, situées dans la partie superficielle de la CM. Les dendrites des interneurones sont orientées vers la surface et leurs épines sont en relation avec les fibres parallèles. Leurs axones se connectent avec les cellules de Purkinje en s’enroulant autour de leur soma, dans le cas des cellules en panier, ou en contactant leurs dendrites dans le cas des cellules étoilées. Dans le cortex cérébelleux, l’histologiste Ramon Y Cajal a décrit trois types de cellules gliales distribuées sélectivement dans ces couches : (1) l’astroglie de la CGI et de la SB, (2) les oligodendrocytes de la CGI et de la SB, (3) la glie de Bergmann (appelée aussi cellule épithéliale de Golgi) de la CP et de la CM. Les astrocytes protoplasmiques et les astrocytes fibreux que l’on trouve dans la CGI et dans la SB sont de nature semblable à ceux du reste du SNC. Les oligodendrocytes présents chez les rongeurs uniquement dans la CGI et dans la SB ont pour fonction de myéliniser les axones des neurones. Les cellules de la glie de Bergmann sont considérées comme des astrocytes spécialisés caractéristiques du cervelet. Leur prolongement est disposé autour des soma des cellules de Purkinje. Elles étendent radialement leurs longs prolongements à travers la CM puis forment leurs terminaisons coniques sous la surface piale.
D ÉVELOPPEMENT  DU  CERVELET
Développement embryonnaire du cervelet Le cervelet dérive de la plaque alaire du tube neural et réside dans le métencéphale. Cette structure présente, contrairement aux autres régions cérébrales, deux zones germinatives dans la structure. La première est limitée antérieurement par l’isthme (jonction entre métencéphale et mésencéphale) et postérieurement par le plexus choroïde. Elle est composée d’une zone ventriculaire (neuro-épithéliale) et d’une région superficielle en forme de triangle nommé la lèvre rhombique. Chez les rongeurs, et notamment la souris, le développement embryonnaire du cervelet débute
tôt, dès E10. Au stade embryonnaire, entre E10 et E11, les premières cellules post-mitotiques quittent la zone ventriculaire et formeront les noyaux profonds du cervelet. Au stade (E11- E13), se poursuit la migration des précurseurs des cellules de Purkinje (Altman et Bayer, 1985). Les cellules migrent le long des fibres de la glie radiale s’étendant de la zone ventriculaire à la surface piale et se disposent en éventail jusqu’au début du développement postnatal. Dès la fin de leur migration, à E13, les futures cellules de Purkinje commencent à émettre une dendrite primaire. Enfin, les cellules de Golgi se forment dans la zone ventriculaire entre E12 et E15, puis l’activité mitotique de celle-ci décroît jusqu’à E17. À partir de E13 débute une deuxième vague de migration à partir d’une deuxième population proliférative située dans le triangle qui sera à l’origine de la CGE. Des précurseurs situés dans la partie latéro-caudale de l’épendyme se divisent et migrent sur la surface externe de la lèvre rhombique. À E14, une plaque cérébelleuse est alors formée. Elle contient, du ventricule vers la surface piale, la zone épendymaire primitive, une zone manteau, une couche moléculaire fine de la CGE. Les interneurones apparaissent à un stade plus tardif pendant les deux premières semaines du développement postnatal (Zhang et Goldman, 1996).
Développement postnatal du cervelet Le développement initial du cervelet postnatal se caractérise par trois processus qui se déroulent en parallèle. Le premier processus aboutit à l’accumulation des précurseurs granulaires dans la couche la plus superficielle de la CGE. Ces précurseurs prolifèrent puis migrent et se différencient dans la CGI. Au septième jour postnatal (P7), 50% de la population granulaire est formée et plus de 80% le sera vers le P10. Ils sont situés dans la zone la plus externe de la CGE, au contact avec la lame basale qui la sépare des méninges. La durée du cycle cellulaire des précurseurs granulaires est de l’ordre de 20 heures, mais, au cours de cette période, le taux de prolifération n’est pas homogène dans l’ensemble de la CGE, l’effet le plus élevé a été observé dans les fissures (confirmé par Wood et Youle, 1995) et il semblerait que cette augmentation très localisée serait responsable de l’apparition des lobules. Ces disparités s’estompent au dixième jour du développement postnatal quand l’organisation en lobules est établie (Mares et Lodin, 1970). La CGE persiste jusqu’au vingt et unième jour de développement postnatal (P21) chez les rongeurs. Pendant le deuxième processus, les cellules de Purkinje issues de la zone germinative granulaire s’alignent en monocouche dans le cortex cérébelleux dès les premiers jours du développement postnatal et se différencient entre les stades P1 et P10 par l’extension de dendrites et la synaptogenèse. Ces extensions rencontrent les fibres parallèles granulaires vers le stade P7. Les connections synaptiques s’établissent de P7 à P21 et conservent leur plasticité tout au long de la vie. De P8 à P15 les fibres grimpantes, originaires du complexe olivaire inférieur, se connectent aux corps cellulaires et aux dendrites des cellules de Purkinje, à raison de plusieurs fibres par cellule de Purkinje. Puis à partir de P15, les synapses surnuméraires sont éliminées et ne reste qu’une afférence grimpante par cellule de Purkinje. Au cours des trois premières semaines postnatales, les précurseurs nerveux postmitotiques quittent la CGE puis migrent à travers la CM pour atteindre la CGI, la couche terminale où ils terminent leur différenciation. La zone plus interne de la CGE correspond à la
couche « prémigratoire » et se compose des précurseurs granulaires ayant achevé leur dernière mitose, en attente de migration dans les couches sous-jacentes. La cytoarchitecture des précurseurs granulaires varie, ils sont de petite taille avec des morphologies très arrondies dans la CGE. Ils deviennent fusiformes pendant la migration et s’arrondissent lorsqu’ils sont complètement différenciés dans la CGI. Durant les trois premières semaines postnatales, les précurseurs nerveux postmitotiques quittent la CGE puis migrent à travers la CM pour atteindre la CGI, la couche terminale où ils terminent leur différenciation. Au cours du troisième processus, les interneurones de la CM sont issus des divisions mitotiques de progéniteurs localisés dans la SB, eux-même issus de la population germinative située dans la zone ventriculaire. Ces progéniteurs migrent de cette zone vers la SB où ils conservent pour un moment leur propriété de cellules prolifératives. Les interneurones encore indifférenciés de forme bipolaire quittent la SB et migrent une deuxième fois de la SB vers la CM où ils se différencient. Ces processus s’étalent pendant les deux premières semaines postnatales chez le rat (Zhang and Goldman, 1996).
L A  MIGRATION  DES  PRÉCURSEURS  DU  CERVELET La migration des précurseurs granulaires du cervelet est une étape très importante de leur maturation qui débute dans la zone interne de la CGE dès leur sortie du cycle de prolifération et se poursuit dans la CM et dans la CGI où se termine leur différenciation. Durant les trois premières semaines de développement postnatal, les cellules granulaires subissent deux étapes de migration successives : une migration précoce de type tangentielle et une migration radiale.
La migration tangentielle La migration tangentielle commence dès que les précurseurs granulaires cessent de proliférer et deviennent postmitotiques. Ils constituent ainsi une couche prémigratoire dans la CGE. Dès le premier rang de la couche prémigratoire, les précurseurs granulaires émettent deux prolongements axonaux horizontaux orientés parallèlement à la surface du cortex. Ce phénomène fut décrit par Ramon Y Cajal comme une « phase de bipolarité horizontale ». Ces précurseurs granulaires se déplacent tangentiellement sur une longueur de 220 micromètres dans la CGE, puis ils descendent progressivement vers la CM (Komuro et al. , 2001). Ce mécanisme de migration dépend essentiellement du guidage par les prolongements émis par les neurones : on qualifie cette migration de neuronophilique ou tangentielle. L’importance de la migration tangentielle est diversement appréciée. Elle pourrait permettre de positionner les cellules granulaires dans le compartiment qui leur est assigné. Une autre hypothèse suggère que la migration tangentielle pourrait conduire les cellules granulaires vers des zones préférentielles de migration, détectées chez le cervelet de poulet et dénommées « raphés » (Lin et Cepko , 1998). Ces zones seraient en partie des ouvertures de la CGE vers la CM. À ce niveau du cortex cérébelleux, la glie radiaire dont le soma entoure les cellules de Purkinje n’a pas encore atteint la surface piale et laisserait aux neuroblastes plus de possibilité d’interaction
entre eux. La migration tangentielle pourrait être guidée par les axones des granulaires en différenciation qui forment les fibres parallèles, par les composants de la matrice extracellulaire ou encore par des molécules de guidage axonal. Ainsi, peu à peu, les précurseurs granulaires atteignent l’interface des couches CGE et CM. Ils émettent un prolongement perpendiculaire à la surface piale, vers la profondeur de la CM, et parallèle aux prolongements gliaux des cellules de Bergmann. Leur corps cellulaire s’étire selon un axe radial. Les prolongements horizontaux émis dans la CGE restent en place en arrière, s’allongent et constituent les fibres parallèles.
1.1.1.  La migration radiale Après la période de positionnement débute l’étape de migration radiale des précurseurs des cellules granulaires le long des fibres de Bergmann à travers la CM : c’est la migration dite gliophilique, ou radiaire (figure 4). Ils adoptent une morphologie polarisée verticale. La cellule bipolaire développe rostralement un prolongement migratoire qui s’enroule autour de la glie de Bergmann (Rakic, 1971 ; Edmondson et Hatten 1987). La dynamique et les mécanismes du guidage par la glie radiaire ont été étudiés en vidéo-microscopie sur des cultures in vitro des cellules granulaires du cervelet et des cellules gliales puis sur des coupes cérébrales dont les neurones en migration avaient été marqués par une sonde fluorescente (Gasser et Hatten, 1990). Le neurone en migration a son soma étroitement accolé à la fibre gliale sur laquelle il se déplace de façon saltatoire et intermittente, avec des bouffées de mouvements entrecoupées de pauses plus ou moins longues. Il présente deux prolongements, l’un dans le sens de la migration, assez large, et l’autre, beaucoup plus fin, qui entoure la cellule gliale. Les prolongements neuronaux se terminent par des lamellipodes et des filopodes ayant des mouvements permanents de rétraction et d’extension. L’ensemble progresse à une vitesse moyenne de 10-60 micromètres par heure. Il existe deux types de contact entre le neurone et la cellule gliale, d’une part des « puncta adherentes  » et d’autre part des complexes jonctionnels situés respectivement au niveau des prolongements et du soma du neurone. Les complexes sont présents seulement lorsque le neurone progresse sur la cellule gliale. Lors de la migration à travers la CP, le prolongement radial s’estompe et se rétracte. On observe des lamellipodes motiles et l’apparition des fines extensions des filopodes au bout du prolongement radial antérieur, en même temps que le précurseur granulaire se détache de la glie de Bergmann. La cellule reste en phase stationnaire pendant quelques heures dans la CP, puis émet son prolongement en initiant une migration jusqu’à la CGI indépendante du contact avec la glie de Bergmann, (Yacubova and Kumoro, 2002, Kumoro and Yacubova, 2003).
L ES  MÉCANISMES  DE  GUIDAGE
Le guidage de la glie radiaire Plusieurs données montrent que la glie radiaire n’est qu’un guide passif et que le neurone progresse selon une information qui lui est propre et via  des signaux du microenvironnement. Ainsi, les études in vitro  ont montré que les précurseurs du cervelet migrent le long des cellules gliales
hippocampiques avec les même caractéristiques que le long de la glie cérébelleuse. Il en est de même pour la migration d’un neurone d’hippocampe sur la glie cérébelleuse. Chez les souris mutantes weaver , dont les granulaires du cervelet ne migrent pas, le défaut génétique ne concerne que les cellules neuronales et non les cellules gliales (Hatten et al ., 1986). D’autre part, les cocultures hétérotypiques (granulaires cérébelleux sur de la glie d’hippocampe et vice-versa ) ont montré que la morphologie des cellules gliales est celle de leur région d’origine et non de la région d’origine du neurone. Les cellules gliales sont donc munies d’une information intrinsèque qui détermine leurs caractéristiques morphologiques, celles–ci déterminent à leur tour l’architectonie de la structure en fournissant la trame de la migration neuronale (Gasser et Hatten, 1990). Les mécanismes de la prolifération, migration et différenciation des cellules granulaires du cervelet reposent sur la modulation du microenvironnement extrêmement complexe. Certaines de ces molécules classées parmi les molécules d’adhésion permettent l’établissement intercellulaire, homotypique entre cellules granulaires ou hétérotypiques stimulant la synthèse de l’ADN et conduisent les précurseurs vers une spécificité neuronale. D’autres facteurs sécrétés dans le milieu extracellulaire modulent le comportement des précurseurs granulaires. Ces molécules sont des composants de la matrice extracellulaire, fonctionnent comme des liens entre les cellules et sont spécifiques pour chaque type cellulaire. Cependant, d’autres molécules interviennent de façon combinatoire et séquentielle permettant aux précurseurs granulaires de proliférer, de reconnaître les cellules gliales et d’y adhérer pour migrer, ce sont les récepteurs des facteurs de croissance, les molécules d’adhérence cellulaire.
Le guidage par les composants de la matrice extracellulaire Plusieurs systèmes non spécifiques interviennent probablement de façon combinatoire et séquentielle, pour permettre aux neurones de reconnaître et d’adhérer aux cellules gliales le long desquelles ils doivent migrer : les molécules d’adhérence cellulaire faisant partie de la superfamille des immunoglobulines (cadhérines …) et les composants de la matrice extracellulaire (Takeichi, 1991, Fishman and Hatten, 1993). La migration des cellules granulaires est un phénomène dynamique qui fait intervenir un remodelage du microenvirronement. Celui-ci est assuré par les métalloprotéases matricielles (MMPs)  secrétées ou membranaires (MT-MMP). Ces enzymes protéolytiques contrôlent par clivage l’activité des composants de la MEC, des facteurs membranaires, des facteurs solubles ou des récepteurs. L’expression spatiotemporelle des MMPs au cours du développement postnatal du cervelet renforce l’importance des composants de la matrice extracellulaire dans la migration cellulaire. En particulier, la MMP9 contrôle la migration et l’axiogenèse des précurseurs nerveux du cervelet (Vaillant et al. , 1999). In vivo , de nombreux composants de la MEC sont exprimés spécifiquement au cours du développement selon des schémas temporels précis. In vitro , des expériences montrent que les cellules granulaires dissociées placées en culture migrent sur un support recouvert par des molécules de la matrice (comme la laminine ou la fibronectine) en absence de toute interaction avec les cellules
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