Présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE STRASBOURG

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THESE Présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE STRASBOURG par Nicolas BARTHÉLEMY Protéomique qualitative et quantitative, une passerelle pour relier l'expression génomique à la construction des édifices biologiques. Application à la compréhension de la structure moléculaire du cheveu humain. Soutenue le 22 juin 2011 devant la commission d'examen : Dr Alain VAN DORSSELAER Directeur de thèse Dr Odile SCHILTZ Rapporteur Dr Thierry RABILLOUD Rapporteur Dr Olivier POCH Examinateur Dr Bruno BERNARD Examinateur

  • précieux conseils sur les plans d'expérience

  • compétences humaines

  • échanges d'idées et d'expériences scientifiques

  • encadrement au laboratoire

  • compréhension de la structure moléculaire du cheveu humain

  • laboratoire de spectrométrie de masse bio-organique


Publié le : mercredi 1 juin 2011
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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THESE



Présentée pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE STRASBOURG

par

Nicolas BARTHÉLEMY




Protéomique qualitative et quantitative, une passerelle pour relier
l’expression génomique à la construction des édifices biologiques.
Application à la compréhension de la structure moléculaire du cheveu
humain.







Soutenue le 22 juin 2011 devant la commission d’examen :



Dr Alain VAN DORSSELAER Directeur de thèse
Dr Odile SCHILTZ Rapporteur
Dr Thierry RABILLOUD Rapporteur
Dr Olivier POCH Examinateur
Dr Bruno BERNARD Examinateur
A ma famille,
A la mémoire de mon grand-père Pierre Tabarant,















« On ne trouve que ce qu’on a idée de chercher. »
Cours de chimie analytique d’Alain Tchapla, IUT d’Orsay Remerciements
Ce travail de thèse a été réalisé au Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-Organique, au sein du
Département Sciences Analytiques de l’Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien de Strasbourg (IPHC, CNRS-UdS
7178).
Tout d’abord, je tiens à remercier Alain Van Dorsselaer pour m’avoir permis de bénéficier des moyens
techniques et des compétences humaines et scientifiques de son laboratoire.
Je tiens également à adresser ma reconnaissance à L’ORÉAL et personnellement à Dominique Julien pour
avoir soutenu financièrement ce travail. Mes remerciements s’adressent particulièrement à Nükhet Cavusoglu et
Georges Hussler pour avoir suivi mon travail tout au long de ces années. J’ai une pensée pour Franck Zerbib grâce
à qui j’ai mis les doigts dans l’engrenage.
Je suis profondément reconnaissant à Olivier Poch, président du jury, Odile Schiltz et Thierry Rabilloud,
rapporteurs, et Bruno Bernard, examinateur, pour m’avoir fait l’honneur d’évaluer ce travail de thèse.
Merci à Christine Schaeffer-Reiss pour le temps consacré à mon encadrement au laboratoire.
Un remerciement spécial à Christine Carapito pour son aide, son écoute et ses encouragements tout au
long de mon périple docto «râle».
Merci tout particulièrement à Cyril Colas pour m’avoir fait bénéficier de ses inestimables connaissances
entre autres des couplages LC-MS et pour toutes les manips faites jour et surtout nuit pour entrevoir la rationalité
du séquençage en protéomique.
Je remercie René Brennetot pour m’avoir permis de faire une collaboration extra-capillaire et pour ses
précieux conseils sur les plans d’expérience.
Merci aux cadres du laboratoire : Jean Marc Strub (qui est le plus fort : l’Alien, la Mammoet PTC 35 DS ou
le Prédator ?), Danièle Thierse (Grrr… encore un coup des Snockeles), François Delalande (il est à tout le monde le
canap’…), Agnès Hovasse, Hélène Diemer, Fabrice Varrier, Fabrice Bertile, Sarah Sanglier-Cianférani et Laurence
Sabatier. Merci à Alexandre Burel et Patrick Guterl (toc, toc, toc, c’est ici pour les macros ?) et aussi à Véronique
Trimbour et Kévin Jeanpert pour leur travail qui nous a simplifié la vie et les départs en congrès.
Mes sincères remerciements aux deux équipes de grouillots d’étudiants, post-docs, contractuels qui ont
accompagné mon séjour au LSMBO rythmé par la bonne humeur et les échanges d’idées et d’expériences
scientifiques. Courage, encore un peu de négociations et il y aura des lits pliants à la cave (avec planning de
réservation intégré au CEI).
Les Pouilleux : Sébastien Gallien (dit le grand chef, guide spirituel dans mon parcours initiatique à la
protéomique), Audrey Bednarczyck, Cédric Atmanène (maître suprême non-covalentiste), Thierry Wasselin (697
heures de PD-Quest et 18 palettes de REM au compteur), Daniel Ayoub, Céline Heng, Stéphanie Petiot-Becard et
François Debaene.
Les Précieux : Guillaume Béchade (précieux parmi les précieux), Véronique Delval-Dubois, Laëtitia
Fouillen, Jean-Michel Saliou, Christel Husser, Antoine Zieger, Amandine Bœuf (l’exilée), Tchilabalo Dilezitoko
’’Elie’’ Alayi (une question ?), Sarah Lennon et Magali Rompais (56 blagues et mises en scène de bureau à leur
actif, série en cours), Diego Bertaccini et Marine Plumel.
Merci à l’ensemble des membres de la section volley de la Fraternelle pour tous les bons moments extra
labo sportifs et non sportifs (principalement au MB…). Enfin, j’ai une pensée pour mes professeurs de la Licence Professionnelle de Chimie Analytique de l’IUT
d’Orsay et du Master Instrumentation et Méthodes d’Analyse Moléculaire de l’Université Paris Sud pour la qualité
de leurs formations. Je pense également à tous ceux qui ont pris de leur temps pour me transmettre de leurs
connaissances et de leur savoir-faire pendant mes stages et particulièrement à Michel Tabarant, Jean-Marie
Duda, Patrick Dupuis et Laurent Verreman.
Plan du manuscrit

Introduction générale ................................................................................................... …..1

Partie I Introduction à la biologie et à l’état de l’art des connaissances de la fibre
capillaire
Chapitre I Avant propos ..................................................................................................... 4
1. Des cheveux et des hommes ............................................................................................................................ 4
2. Universalité de la structure chez les mammifères ........................................................................................... 5
3. Histoire de la science du cheveu ...................................................................................................................... 6
Chapitre II Biologie du cheveu............................................................................................ 9
1. Morphogénèse ................................................................................................................................................. 9
a) Le follicule ..................................................................................................................................................... 9
b) Les différentes étapes de différenciation folliculaire ................................................................................. 10
2. Structure du cheveu humain .......................................................................................................................... 11
a) Structure générale de la section du cheveu ............................................................................................... 11
b) Ultrastructure du cortex ............................................................................................................................. 12
c) Ultrastructure de la cuticule ....................................................................................................................... 14
d) Ultrastructure de la médulla ...................................................................................................................... 15
3. Les origines du polymorphisme des fibres capillaires de l’espèce humaine .................................................. 15
4. Diversité des structures chez les mammifères ............................................................................................... 17
Chapitre III Aspects moléculaires de la structure du cheveu ............................................. 19
1. Notion d’homologie de séquence et de famille multigénique ....................................................................... 19
a) Définition et origine de l’homologie de séquence ..................................................................................... 19
b) Famille multigénique et isoformes ............................................................................................................. 20
2. La découverte des protéines du cheveu et leur caractérisation .................................................................... 20
a) L’isolement des protéines .......................................................................................................................... 20
b) La recherche des gènes .............................................................................................................................. 21
c) L’évidence de l’expression des gènes en protéine ..................................................................................... 22
3. Les kératines ................................................................................................................................................... 23
a) Les kératines, des protéines des filaments intermédiaires ........................................................................ 23
b) Les catégories de kératines ........................................................................................................................ 23 c) Structures primaires et secondaires des kératines : la programmation de l’hétérodimérisation ............. 25
d) La formation des filaments intermédiaires ................................................................................................ 26
4. Les protéines associées aux kératines (KAP) .................................................................................................. 27
a) Fonctions .................................................................................................................................................... 27
b) Les familles de KAP ..................................................................................................................................... 27
5. De l’expression des gènes à la structure finale du cheveu : la formation des structures corticales et
cuticulaires .............................................................................................................................................................. 30
a) Les étapes de l’assemblage macrofibrillaire du cortex .............................................................................. 31
b) La formation des structures lamellaires cuticulaires .................................................................................. 33
6. Le réseau des liaisons et des interactions dans le cheveu ............................................................................. 34
a) Les interactions non covalentes et la solvatation ...................................................................................... 34
b) Le réseau des ponts disulfures ................................................................................................................... 35
c) Le réseau covalent des liaisons GGEL ......................................................................................................... 37
d) Les structures des interfaces cellulaires ..................................................................................................... 37
e) Les modifications induites par des traitements ......................................................................................... 38
7. Les maladies associées aux protéines du cheveu ........................................................................................... 39
a) Les maladies impliquant des mutations des gènes des kératines du cheveu ............................................ 40
b) Les maladies impliquant des mutations des gènes des kératines épithéliales du follicule ........................ 40
c) Les maladies impliquant des mutations des gènes d’autres protéines ...................................................... 40
Conclusion : les champs de recherche qui restent à explorer ............................................ 42

Partie II Mise au point de nouvelles stratégies protéomiques pour la caractérisation de
protéines issues des familles multigéniques pour l’analyse des constituants du cheveu
Chapitre I Introduction à la protéomique ......................................................................... 46
1) Le principe fondamental : la comparaison du protéome au génome ................................................................ 46
2) L’obtention des données de séquences protéiques expérimentales par spectrométrie de masse. ................. 47
a) Architecture et principe général de fonctionnement d’un spectromètre de masse ..................................... 47
b) Principe de l’utilisation d’un spectromètre de masse pour l’obtention d’information de séquence
protéique ............................................................................................................................................................ 47
c) Les spectromètres de masse utilisés pour le séquençage en protéomique ................................................... 49
3) L’identification des protéines ............................................................................................................................. 50
a) La comparaison des données expérimentales et théoriques ..................................................................... 50
b) La définition des critères de recherche ...................................................................................................... 51
4) La décomplexification de l’échantillon pour accroitre les capacités de séquençage en protéomique. ............ 51 5) L’acquisition automatisée des données spectrales en mode dépendant des données (DDA) .......................... 52
6) La notion d’erreur d’identification en protéomique et son contrôle ................................................................. 53
a) Les faux positifs et les vrais négatifs ........................................................................................................... 53
b) La validation des identifications ................................................................................................................. 55
Chapitre II Evaluation et développement d’une nouvelle stratégie expérimentale protéomique pour
l’identification des isoformes du cheveu .......................................................................... 56
1) L’homologie de séquence : un rempart à la discrimination des isoformes ....................................................... 57
2) Une approche multienzymatique pour augmenter le nombre de peptides protéotypiques ............................ 58
a) Les enzymes pour le séquençage par spectrométrie de masse ..................................................................... 58
b) Une stratégie adaptée pour l’étude des kératines et des KAPs ..................................................................... 58
3) L’extraction des protéines des structures kératinisées ...................................................................................... 59
a) Principe d’extraction des protéines du cortex ............................................................................................... 59
b) Principe d’extraction des protéines de la cuticule ......................................................................................... 60
4) Evaluation de l’efficacité de l’étude d’isoformes par séparation au niveau protéique ..................................... 60
a) Principe des stratégies de séparation des protéines ...................................................................................... 60
b) Evaluation théorique du potentiel des techniques de séparation protéiques par modélisation de la
physico-chimie des protéines étudiées .............................................................................................................. 61
c) Evaluation expérimentale de l’isoélectrofocalisation des protéines pour le préfractionnement par
approche off-gel. ................................................................................................................................................ 62
d) Evaluation expérimentale de l’analyse des protéines par électrophorèse bidimensionnelle. ...................... 63
e) Evaluation expérimentale de l’analyse des protéines par chromatographie d’exclusion ............................. 64
f) Les techniques de précipitations sélectives .................................................................................................... 64
g) Conclusion : limites des approches de séparation des protéines pour l’analyse des isoformes du cheveu .. 65
5) Evaluation de l’efficacité de décomplexification au niveau peptidique ............................................................ 65
a) L’analyse des peptides comme alternative à l’isolement des protéines ........................................................ 65
b) Les techniques multidimensionnelles de séparation des peptides ................................................................ 66
c) Principe et évaluation de techniques de chromatographie bidimensionnelles ............................................. 67
6) Choix de la stratégie de traitements des données ............................................................................................. 69
a) Le choix des banques protéiques utilisées pour la recherche ........................................................................ 69
b) L’utilisation de la complémentarité des moteurs de recherche pour renforcer la validation des résultats . 70
c) L’analyse séquentielle des données pour réguler la probabilité d’entrées de faux positifs dans les listes
d’identification.................................................................................................................................................... 72
d) Le choix de l’analyseur : l’utilisation de l’apport de la précision de la mesure de masse .............................. 73
7) Estimation de l’abondance des protéines par mesure des digests peptidiques ................................................ 73
Chapitre III Optimisations instrumentales du couplage nanoLC-ESI-Q-TOF : de la compréhension du
système à son optimisation pour l’analyse protéomique .................................................. 75
1) Architectures et principe de fonctionnement d’un ESI-Q-TOF ....................................................................... 75
a) La source électrospray ................................................................................................................................ 75
b) De la source à l’interface ............................................................................................................................ 76
c) La transmission ........................................................................................................................................... 76
d) Les quadripôles pour la sélection et la fragmentation ............................................................................... 76
e) L’analyseur à temps de vol ......................................................................................................................... 77
f) L’injection orthogonale ............................................................................................................................... 77
g) Le réflecteur électrostatique ...................................................................................................................... 77
h) La détection ................................................................................................................................................ 77
i) La digitalisation ........................................................................................................................................... 79
j) La mesure de masse et son importance en protéomique .......................................................................... 81
2) Optimisation du système ESI-Q-TOF pour l’amélioration des acquisitions de données MS et MS/MS ......... 82
a) Optimisation des paramètres de source, de transmission et d’isolement................................................. 82
b) Optimisation de la fragmentation sur le SYNAPT G1 ................................................................................. 83
c) La détection ................................................................................................................................................ 85
d) Optimisation de l’acquisition des données et de leur traitement.............................................................. 85
3) Optimisation des paramètres chromatographiques du couplage nanoLC-ESI-MS ............................................ 89
a) L’optimisation de l’architecture des systèmes nanoLC .................................................................................. 89
b) Séparation des peptides en phase inverse ..................................................................................................... 91
c) Optimisation du gradient d’élution ................................................................................................................ 91
d) Optimisation des temps de gradient en fonction de la capacité de pic ......................................................... 93
e) Influence du débit et de la longueur de la colonne sur la séparation ............................................................ 95
f) Mise en évidence de l’influence des paramètres chromatographiques sur la sensibilité nanoESI-MS .......... 96
g) Evaluation de l’impact de la quantité injectée sur la dynamique du système LC-MS .................................... 97
4) Etude des paramètres influant sur les identifications en protéomique par l’utilisation d’un plan d’expériences
................................................................................................................................................................................ 99
a) La problématique de l’optimisation des paramètres d’acquisition pour la génération des données de
séquençage par spectrométrie de masse. .......................................................................................................... 99
b) Terminologie du plan d’expérience .............................................................................................................. 100
c) Les catégories de plan d’expérience ............................................................................................................. 100
d) Construction du plan .................................................................................................................................... 101
e) Choix et principe de construction de la matrice de Doehlert ...................................................................... 103
f) Construction de la matrice expérimentale .................................................................................................... 104

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