Présentée pour l'obtention du titre de Docteur de l'université de Strasbourg

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Thèse Présentée pour l'obtention du titre de Docteur de l'université de Strasbourg. Discipline : Sciences de la vie et de la santé Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie Par Vincent Dalibard Les protéines Lsb3 et Lsb4 : une connexion entre la machinerie de l'actine et le trafic au niveau des corps multivésiculaires chez S. cerevisiae Soutenue le 18 Decembre 2009 Jury Mme G. Mirey Directrice de Thèse M S. Gasman Rapporteur interne M Ch. Lamaze Rapporteur externe Mme V. Moreau Rapporteur externe Mme R. Haguenauer-Tsapis Examinateur Mme B. Winsor Examinateur Mme S. Friant Membre invité UMR7156 CNRS-ULP, Génétique Moléculaire Génomique Microbiologie institut de physiologie et de chimie biologique , Strasbourg

  • epsines

  • gasman rapporteur interne

  • cytosquelette d'actine chez la levure

  • protéines lsb3

  • expériences complémentaires de trafic

  • actine

  • internalisation des protéines empruntant la voie vps

  • lsb3

  • localisation des epsines dans les mutants lsb3∆


Publié le : mardi 1 décembre 2009
Lecture(s) : 27
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 201
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Thèse


Présentée pour l'obtention du titre de Docteur de l'université de Strasbourg.

Discipline : Sciences de la vie et de la santé
Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

Par Vincent Dalibard

Les protéines Lsb3 et Lsb4 : une connexion entre la
machinerie de l’actine et le trafic au niveau des corps
multivésiculaires chez S. cerevisiae


Soutenue le 18 Decembre 2009









Jury


Mme G. Mirey Directrice de Thèse
M S. Gasman Rapporteur interne Ch. Lamazeexterne
Mme V. Moreau
Mme R. Haguenauer-Tsapis Examinateur B. Winsor Examinateur
Mme S. Friant Membre invité







UMR7156 CNRS-ULP, Génétique Moléculaire Génomique Microbiologie
institut de physiologie et de chimie biologique , Strasbourg
2Remerciements

Je tiens à remercier les membres de mon jury pour m'avoir fait l'honneur d'accepter de juger le
travail réalisé au cours de ma thèse.

Je tiens également à remercier ma directrice de thèse, Gladys Mirey, sans qui cette thèse
n'aurait pas été possible. Merci de m'avoir accompagné et supporté durant toutes ces péripéties, merci
pour ta bonne humeur et merci d'avoir tenté jour après jour de lutter contre mon esprit finistérien.

Je tiens à remercier Barbara Winsor pour m'avoir accueilli au sein de son équipe durant ces
trois années de thèse ainsi que pour m'avoir trouvé un financement pour les quelques mois
supplémentaires.

Merci aux différents membres de l'équipe qui étaient là à mon arrivé: Lydia, Clélia, Albert et
ceux qui seront là lors de mon départ: Audrey, Ray, Guillaume, Aline et Matthias. Merci pour tous ces
bons moments passés ensemble, que ce soit au laboratoire, en ville, dans les Vosges ou même en
Suisse.

Merci aux stagiaires, Dimitri, Dina, Marina, Thibault, Samantha, Elodie et Marie qui ont
travaillé avec moi ou Gladys sur ce projet et apporté leur bonne humeur au laboratoire.

Merci à Sylvie et à son équipe. Merci à Sylvie pour ses conseils et son investissement. Merci à
Vanessa à l'origine de ce projet. Un grand merci à Johan et Joëlle pour leurs conseils, leur disponibilité
et l'intérêt tout particulier porté au travail du Petit. Merci à Serge, Dimitri et Bruno pour les bons
moments passés ensemble.

Merci à Cathy et Aline pour m'avoir aidé dans les démarches administratives et pour
l'organisation de mes voyages professionnels.

Merci à mes amis de Strasbourg (certains déjà cités plus haut) qui m'ont fait découvrir et
apprécier l'Alsace. Merci pour tous les bons moments passés ensemble, au resto, dans les Vosges,
devant un film/un docu/une série ou devant une table de JDR. Merci à Nico, mon colocataire pendant
ces trois années.

Merci aux Zamis de Francfort à Toulouse, en passant par Mâcon et la région parisienne, qui
sont restés très présents malgré la distance.

Merci à ma famille qui me supporte depuis un certain temps déjà...

3
4Sommaire

Abréviations 13
Liste des protéines de levure mentionnées 17
Introduction 19
I. Le cytosquelette d’actine. 19
A. L’actine. 19
B. Dynamique de l’Actine. 20
C. Nucléation de la polymérisation de l’actine. 23
D. Le cytosquelette d’actine chez la levure. 33
II. Les protéines Lsb3/Lsb4. 43
A. Découverte de Lsb3 et Lsb4 lors d'un crible double-hybride. 43
B. Les homologues de Lsb3 et Lsb4. 44
C. Rôle de Lsb3 et Lsb4 au niveau des patchs corticaux d'actine. 47
D. Lsb3 et Lsb4 interagissent avec les epsines Ent3 et Ent5. 48
III. Le trafic intracellulaire. 51
A. Les grandes voies du trafic intracellulaire. 51
B. Le corps multivésiculaire ou endosomes tardifs 63
C. Les epsines. 77
D. Objectifs. 80
Résultats 81
I Article 83
II. Expériences complémentaires de trafic. 121
A. Endocytose. 121
B. Las17 et la voie VPS. 123
III. Localisation des protéines Lsb3, Lsb4, Ent3 et Ent5. 125
A. Lsb3 et Lsb4. 125
B. Localisation simultanée des epsines et de Lsb3. 129
C. La localisation des epsines dans les mutants lsb3 ∆ ou lsb4 ∆. 131
IV. Lsb3, Lsb4 et l’actine. 135
A. Latrunculine A. 135
B. Profil de bourgeonnement. 138
C. Organisation du cytosquelette d’actine. 139
Discussion 141
I.Interaction entre Lsb3 et Ent5. 141
II. L'internalisation des protéines empruntant la voie VPS. 143
III. Localisation de Lsb3 et Lsb4. 145
IV. Actine et MVB. 147
5 6Conclusion et perspectives 151
Matériels et méthodes 155
I. Bactéries. 155
A. Souches utilisées et génotypes. 155
B. Conditions de croissance, milieux de culture et conservation. 155
C. Transformation des plasmides chez les bactéries. 156
II. Levures. 159 159
B. Conditions et milieux de croissance, conservation des cellules. 160
C. Transformation d'ADN chez la levure. 161
D. Préparation d'ADN à partir des cellules de levures. 162
E. Techniques génétiques. 162
III. Manipulations de l'ADN. 165
A Oligonucléotides. 165
B. Plasmides. 166
C. Détermination de la concentration en ADN. 168
D. Clonage des gènes. 168
E. Séquençage de l'ADN. 170
IV. Manipulation de protéines. 171
A. Préparation d'extrait protéiques bruts. 171
B. Purification de protéines. 172
C. Séparation électrophorétique des protéines. 173
D. Coloration des protéines dans un gel de polyacrilamide-SDS. 173
E. Western blot. 174
F. Anticorps. 175
V. Méthodes cytologiques appliquées à la levure. 177
A. Test de sensibilité à la latrunculine A (LatA). 177
B. Fixation des cellules. 177
C. Marquage par des colorants. 177
D. Microscopie. 178
VI. Trafic intracellulaire. 179
A. Cargo sous promoteurs constitutifs. 179
B. Induction et endocytose de Fur4. 179
C. Pulse-Chase. 180
Bibliographie 181

7 8Liste des illustrations

Figure 1 : Processus de polymérisation de l’actine. 21
Figure 2 : Assemblage et cycle de l’actine. 22
Figure 3 : Les trois classes de nucléateurs. 24
Tableau 1 : Nomenclature des protéines du complexe Arp2/3. 24
Figure 4 : Structure et fonction du complexe Arp2/3. 25
Figure 5 : Les facteurs promouvant la nucléation et leurs domaines. 27
Tableau 2 : Les protéines WASP et SCAR dans différents organismes. 29
Figure 6 : Les domaines des protéines de la famille WASP/SCAR. 30
Figure 7 : Cycle de vie de la levure S. cerevisiae. 33
Figure 8 : Structure d’actine chez Saccharomyces cerevisiae durant le cycle cellulaire. 36
Figure 9. Les 5 NPFs chez S. cerevisiae. 39
Figure 10 : Lsb3 et ses homologues dans différents organismes. 44
Figure 11 : Alignement des domaines YAB de différents organismes (Johan De Craene). 46
Figure 12 : Ordre d’arrivée des protéines au site d’endocytose chez S.cerevisiae. 48
Figure 13 : Interaction protéine-protéines en utilisant Ent3 ou Ent5 comme appât. 49
Tableau 3 : Score-Z de Lsb3. 49
Figure 14 : Les grandes voies du trafic intracellulaire. 52
Figure 15 : Les étapes précoces de l’endocytose ou de l’internalisation. 56
Tableau 4 : Classification des mutants vps en fonction de la morphologie vacuolaire. 58
Figure 16 : Trafic de la protéine cytosoluble CPY empruntant la voie VPS. 60
Figure 17 : Trafic des protéines membranaire em61
Figure 18 : Trafic des protéines membpruntant la voie AP3. 62
Figure 19 : Rôle de l’ubiquitine dans le tri au MVB. 64
Figure 20 : Mutants vps de classe E. 66
Figure 21 : Les phosphoinositides. 67
Figure 22 : Complexe ESCRT-0. 70
Figure 23 : Complexe ESCRT-1. 71
Figure 24 : Complexe ESCRT-2. 72
Figure 25 : Complexe ESCRT-3 et protéines associées. 73
Figure 26 : Les deux modèles d'organisation des complexe ESCRTs. 75
Figure 27 : Localisation des cargos de la voie VPS chez le double mutant ent3Δent5Δ. 79
Figure 28 : Ent3 and Ent5 interact with Lsb3 in a protein-protein interaction screen. 101
Figure 29 : Lsb3 and Ent5 interact in vitro and in vivo. 103
Figure 30 : Lsb3 and Ysc84 are required for the sorting of biosynthetic cargos at the MVB.
107
Figure 31 : Lsb3 and Ysc84 are not required for cargo internalization at the MVB. 109
Figure 32 : Lsb3 and/or Ysc84 deletion do not show any defect in CPYp maturation. 111
Figure 33 : Subcellular fractionation of Ysc84-HA. 113
Tableau 5 : S. cerevisiae strains used in this study. 115
Tableau 6 : Oligonucléotides used in this study. 115
Figure 34 : Localisation de Fur4-GFP. 122
9 10

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