Recherche et identification des gènes régulés par Nur77 in vivo, au cours de la sélection négative thymique

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE présenté par COSTA Fleur Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Recherche et identification des gènes régulés par Nur77 in vivo, au cours de la sélection négative thymique Soutenu le 14 décembre 2004 devant le jury suivant : Pr Jean-Claude GLUCKMAN Président Dr Susan SAINT-JUST Rapporteur Dr Marie-Claude POTIER Examinateur Dr Sylvia COHEN-KAMINSKY Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur: Dr Andràs PALDI EPHE (Sciences de la vie et de la Terre) CNRS UMR 8078-Université Paris XI, IPSC Directeur: Dr S. COHEN-KAMINSKY Remodelage Tissulaire et Fonctionnel : Signalisation et Physiopathologie Hôpital Marie Lannelongue 133, Avenue de la Résistance 92350 Le Plessis Robinson ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Recherche et identification des gènes régulés par Nur77 in vivo, au cours de la sélection négative thymique COSTA FLEUR Soutenu le 14 décembre 2004 Le récepteur nucléaire Nur77 est un facteur de transcription impliqué dans la sélection négative thymique, nécessaire à l'apoptose des lymphocytes T immatures autoréactifs. Les gènes cibles de Nur77 dans le thymus au EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : mercredi 1 décembre 2004
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre
MEMOIRE   présenté par
COSTA Fleur
Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
Recherche et identification des gènes régulés par Nur77 in vivo , au cours de la sélection négative thymique
               Soutenu le 14 décembre 2004 devant le jury suivant :  Pr Jean-Claude GLUCKMAN Président Dr Susan SAINT-JUST Rapporteur Dr Marie-Claude POTIER Examinateur Dr Sylvia COHEN-KAMINSKY Examinateur                                                                                                                               Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur: Dr Andràs PALDI EPHE (Sciences de la vie et de la Terre)   CNRS UMR 8078-Université Paris XI, IPSC Directeur: Dr S. COHEN-KAMINSKY Remodelage Tissulaire et Fonctionnel : Signalisation et Physiopathologie Hôpital Marie Lannelongue 133, Avenue de la Résistance 92350 Le Plessis Robinson ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE  Recherche et identification des gènes régulés par Nur77 in vivo , au cours de la sélection négative thymique  COSTA F LEUR  Soutenu le 14 décembre 2004  Le récepteur nucléaire Nur77 est un facteur de transcription impliqué dans la sélection négative thymique, nécessaire à l’apoptose des lymphocytes T immatures autoréactifs. Les gènes cibles de Nur77 dans le thymus au
cours de l'apoptose sont inconnus. Dans le but de les identifier, une banque de séquences cibles de Nur77 a été construite au laboratoire par la technique TFChIP (Transcription Factor Chromatin Immunoprecipitation). Dans la mesure où les séquences cibles identifiées in vivo sont souvent différentes du consensus établi in vitro , nous avons développé une méthode de criblage de cette banque, permettant de présélectionner les sites potentiels de fixation de Nur77, en vue d’une étude plus poussée. Dans un premier temps, nous avons démontré que Nur77 est exprimé et fonctionnel dans les thymocytes humains stimulés en apoptose via l’activation du récepteur des lymphocytes T. Nous avons ensuite étudié l’influence de la variabilité des bases du site de fixation de la protéine Nur77 sur la formation du complexe [ADN-Nur77] afin d’identifier les bases indispensables dans le site de liaison de Nur77 à l'ADN. La comparaison de la fixation de Nur77 produite par traduction in vitro  ou contenu dans des extraits protéiques de thymocytes induits en apoptose sur des oligonucléotides synthétiques mutés à chacune des 8 positions par rapport au site consensus de forte affinité n'a permis d'observer que très peu de correspondance entre les intensités de liaison produites avec Nur77 traduit in vitro  et celle avec Nur77 provenant des thymocytes. La protéine traduite in vitro  se fixe sur des sites très dégénérés par rapport au site consensus connu pour Nur77, contrairement à Nur77 ex vivo , qui ne se fixer que sur des sites plus restreints dans lesquels 4 bases précises sont indispensables. Ce travail a permis de proposer un nouveau site consensus de liaison pour Nur77, et de mettre en évidence que la liaison de Nur77 à ses cibles est complexe et pourrait impliquer des cofacteurs soit pour stabiliser la liaison de Nur77, soit pour y participer à part entière. Le criblage de la banque nous a permis de trouver deux clones contenant des parties de séquences de gènes cibles de Nur77 similaires à celles de gènes codant pour le récepteur au glutamate GluR6 et sa protéine associée GRIP2. Nous avons cherché à caractériser ces gènes et à les valider comme cibles de Nur77, d’abord en confirmant la présence et l'expression de ces gènes cibles potentiels dans les thymocytes, puis en demontrant que les gènes cibles se trouvent dans des régions chromatiniennes ouvertes dont les gènes sont activés et accessibles au facteur de transcription Nur77 lors de l'induction de l'apoptose. Enfin, nous avons recherché une corrélation entre l'induction d'apoptose dans les thymocytes, l'expression de Nur77 et celle de ses gènes cibles au niveau trancriptionnel et protéique. Ceci nous a permis d'émettre l'hypothèse d'un mécanisme de régulation de l'expression du récepteur au glutamate dans le thymus qui serait similaire à celui connu dans le cerveau pour la régulation du récepteur NMDA. Notre travail contribue à l’orientation de nouveaux projets de recherche au Laboratoire et offre ainsi de nombreuses perspectives.  MOTS CLES : sélection thymique, récepteur nucléaire Nur77, apoptose, récepteur au glutamate, ChIP. INTRODUCTION ........................................................................................ 1
 
1       L E  THYMUS ............................................................................................................................. 1 2       L E  RÔLE  PHYSIOLOGIQUE  DU  THYMUS ..................................................................................... 1 3       L’ APOPTOSE , MORT  CELLULAIRE  PROGRAMMÉE  DANS  LE  THYMUS ........................................... 2 4       L E  RÉCEPTEUR  NUCLÉAIRE N UR 77 .......................................................................................... 2 4.1        La structure de NUR77 .............................................................................................. 3 4.2        Redondance fonctionnelle ........................................................................................... 3 4.3        Les séquences cibles attendues pour Nur77 ............................................................. 4 5       R ÉGULATION  DE  L EXPRESSION  DE N UR 77 .............................................................................. 4 6       L E  RÔLE  PHYSIOLOGIQUE  DES  RÉCEPTEURS  NUCLÉAIRES NFGI-B / N UR 77 ............................ 5 6.1        Implication de Nur77 dans l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien ........... 5 6.2        Implication de Nur77 dans la différenciation et la fonction neuronale .................. 6 6.3        Implication de Nur77 dans la sélection négative thymique ..................................... 6 7       I DENTIFICATION  DES  GÈNES  CIBLES  DE N UR 77 ....................................................................... 7 7.1        Situation du sujet ........................................................................................................ 7 7.2        Construction d’une banque de cible de Nur77 par immunoprécipitation de la chromatine (TFChIP) .................................................................................................................................. 8 7.3        Objectifs ....................................................................................................................... 8      
ABREVIATIONS ET ANGLICISMES
                A adénine ACTH “ Adrenocorticotropic Hormone” ADN Acide Désoxibonucléique ADNc ADN complémentaire AICD Activation Induced Cell Death ARN Acide Ribonucléique ARNm Acide Ribonucléique messager ATP adénosine triphosphate Bq becquerel BEt bromure d’éthidium C cytidine CD cluster de différenciation CMH complexe majeur d’histocompatibilité cpm coups par minute CsA Cyclosporine DBD domaine de liaison à l’ADN DNase désoxyribonucléase D.O. densité optique DTT dithiotréitol ECL enhancer chemiluminescence EDTA Ethylène-Diamine-TétraAcétique EGTA Ethylène-glycol-bis (b-aminoethyl ether)N,N,N’,N’-tétraacéticacide Facs Fluorescence Activated Cell Sorter FITC fluorescéine FL fluorescence FSC forward angle light scatter G guanine GluR « Glutamate receptor » GRIP « Glutamate receptor interacting protein » HBSS solution saline équilibrée de Hanks Hepes Acide sulfonique N-2Hydroxyéthylpipérazine-N’2Ethane HPA axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien I inosine dIdC polymère d’inosine et de cytosine IgG Immunoglobuline G IPTG isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside kb kilobase kDa kilodalton   LB milieu Luria Bertani M molaire min. minute NurRE Nur77 response element NBRE NGFI-B binding response element NGF Neuron growth factor pb paire de bases PBS Solution Saline Tamponnée au Phosphate PE phycoérythrine
PKC protéine kinase C PM poids moléculaire PMA phorbol myristyl acétate P S phénylméthyl sulfonylfluoride M F PSM II poste de sécurité microbiologique de niveau II PVDF polyvinylidène Diluoride RPMI Roswell Park Memorial Institute RNase ribonucléase SDS dodécylsulfate de sodium SSC side angle light scatter SVF sérum de veau fœtal T thymine TBE tris-borate EDTA TCA acide trichloroacétique TCR récepteur des cellules T TEMED N,N,N’,N’ tétraméthyl-éthylène diamine TFChIP Transcription factor chromatin immunoprecipitation Tris hydroxyméthyl-aminométhane Tween20 polyoxyéthylène sorbitan monaulaurate U unité internationale U.V. rayons ultra-violets V volts
 INTRODUCTION 1         L E  THYMUS  Le thymus des mammifères est un organe bilobé, lympho-épithélial, situé dans la partie supérieure de la cage thoracique (médiastin antéro-supérieur), au-dessus du cœur. Chaque lobe est constitué de lobules avec un cortex externe et une médulla centrale. La fonction de cet organe est de permettre la maturation des lymphocytes T au contact des cellules stromales thymiques (Figure 1).   2         L E  RÔLE  PHYSIOLOGIQUE  DU  THYMUS  Le thymus joue un rôle majeur dans la mise en place d’un système immunitaire fonctionnel notamment par la production de cellules T dites compétentes, c'est-à-dire capables de reconnaître des antigènes étrangers, tout en restant tolérantes aux antigènes du soi. Chez l’homme, l’atrophie du thymus (involution thymique) commence à la puberté et se poursuit tout au long de la vie, mais il a été montré que son activité (la production de cellules T matures et immunocompétentes) est maintenue à un taux plus faible même pendant la vie adulte.  Le processus de maturation des cellules T est résumé sur le schéma ci-dessous :  Les progéniteurs hématopoïétiques issus de la moelle osseuse migrent dans le thymus. Ces progéniteurs ne s'engagent définitivement vers la lignée T que in situ  au sein du parenchyme thymique. Au cours de leur maturation dans le thymus (Figure 2), les précurseurs migrent à travers les différents compartiments thymiques et évoluent vers leur maturité par contact avec les différents types de cellules stromales thymiques (cellules épithéliales, cellules dendritiques, macrophages). Parallèlement à la différenciation (acquisition des marqueurs CD4 et CD8), les cellules T immatures subissent les réarrangements du récepteur T et des processus de sélection avant de migrer vers la périphérie. Les réarrangements de la chaîne β ont  lieu  au stade double négatif (DN), c'est à dire lorsque les cellules n'expriment ni CD4 ni CD8. Ces cellules expriment un TCR transitoire nommé pré-TCR formé de la chaîne β  et d'une chaîne invariante Pt α  en association avec le complexe CD3. L'expression de ce récepteur définit un point de contrôle important (la sélection β ) au cours duquel les thymocytes incapables de produire un TCR β fonctionnel meurent par apoptose. La sélection β inclut aussi plusieurs évènements simultanés : engagement vers la lignée T αβ , apparition des molécules CD4 et CD8, échappement à l'apoptose, arrêt du réarrangement du TCR β (exclusion allélique) et initiation des réarrangements et de l'expression du gène TCR α . Les cellules T vont alors évoluer vers le stade double positif c'est à dire exprimant à la fois CD4 et CD8 pour subir les sélections positive et négative. La maturation des cellules T CD4+CD8+ et les processus de sélections positive et négative intrathymique dépendent en partie de l’affinité/avidité de l’interaction entre récepteur T (TCR) et son ligand. Ce dernier, présenté par les cellules stromales du thymus, est formé de la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et du peptide antigénique (Zuniga-Pflycker and Leonardo 1996) .  Les cellules T immatures sont ainsi évaluées pour leur capacité à reconnaître les complexes CMH-peptide du soi. La population qui atteint un stade double positif (CD4+CD8+TCRfaible) du développement est la cible des processus de sélection qui déterminent quelles cellules vont évoluer en cellules matures sim CD4+TCRfort ou CD8+TCRfort. Seules 3 à 5% des cellules T
parviennent à la transition double positifs CD4+CD8+ vers simples positifs CD4+ ou CD8+ et migrent à la périphérie. Environ 95% des cellules T meurent dans le thymus (Anderson, Hare et al. 1999) . Les cellules T immatures subissent des processus de sélection successifs : la sélection positive (von Boehmer 1994) dans le cortex au contact des cellules épithéliales au cours de laquelle ne sont conservées que les cellules capables de reconnaître les complexes CMH-peptide avec une affinité modérée et la sélection négative (Nossal 1994)  à la jonction cortico-médullaire et dans la médullaire au contact des cellules dendritiques et des macrophages qui éliminent les cellules T capables d’agression contre les éléments du Soi (cellules autoréactives). Les cellules sélectionnées positivement reçoivent un signal de survie et celles sélectionnées négativement un signal d’apoptose. Les cellules T portant un récepteur d’affinité trop faible meurent par ignorance (ne reçoivent aucun signal). Les dérèglements de ces mécanismes de sélection qui reposent sur le contrôle de l’équilibre apoptose/survie, pourraient favoriser des situations pathologiques comme l’auto-immunité  (Mountz, Zhou et al. 1996; Thomas-Vaslin, Damotte et al. 1997; Jameson and Bevan 1998; Tolosa, King et al. 1998; Kretz-Rommel and Rubin 2000)  3         L’ APOPTOSE , MORT  CELLULAIRE  PROGRAMMÉE  DANS  LE  THYMUS  L’apoptose est un processus au cours duquel la cellule elle-même active un programme interne conduisant à la mort cellulaire. Son induction dans le thymus se produit via  plusieurs voies de signalisation cellulaires (Figure 3). Une signalisation par les glucocorticoïdes met en jeu le récepteur des glucocorticoïdes et concerne les thymocytes doublement positifs ignorés. Une signalisation via le récepteur T avec une co-stimulation met en jeu le facteur de transcription Nur77 et concerne les thymocytes auto-réactifs au cours de la sélection négative. Enfin, un signal d’altération de l’ADN (irradiation, drogue, ADN altéré par les réarrangements non productifs du récepteur T) induit l’activation du facteur de transcription p53. Ces trois voies sont indépendantes (Osborne and Schwartz 1994; Mountz, Zhou et al. 1995) et stimulent différents gènes impliqués dans l’apoptose.  
Au cours de la sélection négative, les cellules autoréactives sont éliminées par apoptose. Des expériences utilisant des souris génétiquement modifiées ont montré que le facteur de transcription Nur77 est impliqué dans la sélection négative thymique (Liu, Smith et al. 1994; Woronicz, Calnan et al. 1994; Calnan, Szychowski et al. 1995; Zhou, Cheng et al. 1996) . Un des premiers évènements après l'activation du récepteur T des cellules T immatures est en effet l'induction massive, immédiate et soutenue du facteur de transcription Nur77. De plus, ce facteur est nécessaire pour initier l'apoptose des thymocytes immatures et éliminer les cellules T autoréactives. L’apoptose relayée par le TCR est dépendante du calcium et le signal emprunte la voie de la protéine kinase C (Woronicz, Lina et al. 1995) . On suppose que le facteur Nur77, en se fixant à l'ADN, régule l’expression de gènes encore inconnus dans le processus d’apoptose des thymocytes, qu'il va activer ou réprimer.   4         L E  RÉCEPTEUR  NUCLÉAIRE N UR 77  Nur77 appartient à la superfamille de NGFI-B (« Nerve Growth Factor Induced gene B ») contenant trois membres : §       Nur77 (NGFI-Ba) identifié comme un gène précoce (« immediate early gene ») en réponse à une  stimulation par du NGF (« nerve growth factor ») sur des cellules de la lignée PC12 pheochromocytoma (Milbrandt 1988) . §       Nurr1 (NGFI-Bb « Nur-related factor 1 ») isolé d’une banque de cerveau de souris (Law, Conneely et al. 1992) .  §    Nor1 (NGFI-Bg « Neuron-derived Orphan Receptor ») identifié dans une culture de cellules de cerveau de     rat fœtal (Laudet 1997; Giguere 1999) . Nur77 est un récepteur nucléaire. NGFI-B, Nor1 et Nurr1 appartiennent à une sous-classe de la famille des récepteurs nucléaires, pour lesquels aucun ligand n’a encore été défini pour leur activation (récepteur orphelins).  4.1La structure de NUR77  La structure de Nur77 est caractéristique des membres de la superfamille des récepteurs aux stéroïdes (facteurs de transcription ligand-dépendant). Nur77 comme tous les récepteurs nucléaires est organisé en domaines incluant un domaine de transactivation amino-terminal (N terminal), un domaine central de liaison à l’ADN (DBD : « DNA-binding domain ») et un domaine carboxyl terminal (LBD : « ligand binding domain ») (Figure 4).  4.2Redondance fonctionnelle  Depuis le clonage de Nur77 chez la souris (Ryseck, Macdonald-Bravo et al. 1989)  et de NGFI-B chez le rat
(Milbrandt 1988) , plusieurs équipes ont isolé de façon indépendante des homologues de ces protéines chez l'homme (Nakai, Kartha et al. 1990; Uemura, Mizokami et al. 1995) , la souris (Ryseck, Macdonald-Bravo et al. 1989; Law, Conneely et al. 1992) et le rat (Milbrandt 1988; Scearce, Laz et al. 1993)  à partir de sources cellulaires variées, ce qui a permis une classification de ces facteurs (Okabe, Takayanagi et al. 1995) . Certains facteurs sont colocalisés d'ailleurs dans le thymus aussi bien chez l'homme, la souris, que le rat (Milbrandt 1988; Ryseck, Macdonald-Bravo et al. 1989; Nakai, Kartha et al. 1990; Davis, Hazel et al. 1991; Law, Conneely et al. 1992; Scearce, Laz et al. 1993; Hedvat and Irving 1995; Okabe, Takayanagi et al. 1995; Ortiz, Piedrafita et al. 1995; Uemura, Mizokami et al. 1995; Zetterstrom, Solomin et al. 1996)  mais leurs rôles respectifs ne sont pas définis. Tous sont capables de se lier à l'ADN sous forme monomère sur la même séquence consensus que Nur77 : NBRE (« NGFI-B Response Element »: 5’-AAAGGTCA-3’ initialement identifiée par « casting » chez la levure)  (Philips, Lesage et al. 1997) . Ces facteurs sont classés en 3 sous-types (Tableau 1), qui sont respectivement chez la souris Nur77 (Hazel, Nathan et al. 1988; Ryseck, Macdonald-Bravo et al. 1989; Yoon and Lau 1993) , Nurr-1 (Law, Conneely et al. 1992)  et Nor-1 (Zetterstrom, Solomin et al. 1996) . Chez l'homme, l'homologue de Nur77 est NAK-1 (Nakai, Kartha et al. 1990) , l'homologue de Nurr-1 est TINUR (Okabe, Takayanagi et al. 1995) . Ces facteurs sont homologues à plus de 90% dans le domaine de liaison à l’ADN, moyennement homologues dans le domaine de liaison du ligand et divergents avec seulement 21% d’homologie en N terminal (Cheng, Chan et al. 1997) . Devant la diversité des récepteurs nucléaires, dont la majorité d’ailleurs sont orphelins, une nouvelle nomenclature pour les sous-familles et les groupes de récepteurs, basée sur un arbre phylogénétique prenant en compte la conservation des domaines de liaisons à l’ADN et de transactivation a été proposée et recommandée (Nuclear Receptors Nomenclature Committee, (Laudet, Auwerx et al. 1999) ) (Tableau 1). Ainsi le nom générique pour Nur77 est NR4A1, mais nous conserverons l’ancienne terminologie Nur77 dans la suite du mémoire. . L’hypothèse d’une redondance fonctionnelle de ces facteurs (Lee, Wesselschmidt et al. 1995)  en tant que membres homologues d'une même famille est appuyée par l'observation de souris ayant une inactivation du gène Nur77 par recombinaison homologue, qui ne présentent pas de diminution de la sélection négative, alors que des souris transgéniques exprimant une protéine Nur77 de type dominant négatif présentent une délétion clonale thymique inefficace des cellules T autoréactives. Ceci s’explique par le fait que les mutants dominants négatifs de Nur77 peuvent inhiber l'activité transactivatrice de Nur77 mais aussi de Nor-1 et Nurr-1. La redondance fonctionnelle entre Nur77 et Nor-1 a été prouvée dans l’apoptose des thymocytes (Cheng, Chan et al. 1997) . Cette redondance est confirmée chez l'homme puisque NAK-1 et ses deux homologues murins Nur77 et Nurr1 sont exprimés dans les mêmes cellules au cours de l'apoptose et se lient à la même séquence d'ADN in vitro (Okabe, Takayanagi et al. 1995) . Cependant, les cinétiques d'expression montrent un décalage dans le temps, indiquant que NAK-1 pourrait initier le processus d'apoptose et TINUR le maintenir, peut être en activant des gènes différents.  4.3Les séquences cibles attendues pour Nur77  Nur77 se lie in vitro  à l’ADN sur la séquence consensus NBRE (Figure 5) avec une forte affinité, sous forme de monomère et de façon indépendante du ligand. Ce site de liaison a été trouvé dans le promoteur de la 21-O hydroxylase, une enzyme limitante dans la synthèse des stéroïdes au niveau de l'axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien (HPA). Nur77 régule positivement l’expression de la 21-O hydroxylase (Wilson, Fahrner et al. 1993b) . Une autre séquence cible de Nur77 a été identifiée dans l'axe HPA par approche « gène cible candidat ». Il s’agit de la séquence NurRE (« Nur77 Response Element ») qui se trouve au niveau du promoteur du gène de la pro-opiomélanocortine (POMC), un intermédiaire de stéroïdogénèse. C’est une séquence palindromique espacée de 6 paires de bases (TGATATTT-X 6 -AAATGCCA) qui fixe un homodimère de Nur77 (Philips, Lesage et al. 1997) . Elle diffère du motif NBRE liant Nur77 précédemment identifié in vitro car chacun de ses motifs palindromiques de 8 bases présente deux bases différentes par rapport à la séquence cible définie in vitro  (NBRE) liant Nur77 sous forme monomère (Figure 5). Cette séquence est beaucoup plus sensible à l’action de Nur77 in vitro  que la séquence NBRE, activant jusqu’à 50 fois la transcription de gènes rapporteurs (Philips, Lesage et al. 1997) . Ceci souligne la complexité des sites de liaison pour Nur77 in viv o et indique que des sites de liaisons différents du consensus de forte affinité doivent exister. Il a été montré que Nur77 et Nurr1 sont capables de former des hétérodimères in vitro , dans un système double hybride dans des cellules de mammifère. Ces hétérodimères se lient à une séquence de type NurRE et ont un plus fort potentiel à activer la transcription in vitro que les homodimères. Ceci pourrait expliquer pourquoi plus d’un membre de la famille est souvent induit en réponse aux différents signaux, et laisser penser à un code de combinaisons de liaisons de ces facteurs sur des séquences de type NurRE différentes (Maira, Martens et al. 1999) . Par ailleurs, Nur77 (et Nurr1 mais pas NOR-1) peut s'hétérodimériser avec "9-cis retinoic acid receptor" (RXR) et cet hétérodimère peut se lier à une classe d'éléments de réponse aux acides rétinoïques (Perlmann and Jansson 1995)  (Figure 5). Ceci implique que Nur77 peut agir en augmentant le potentiel de RXR à moduler l'expression de gènes de façon dépendante du ligand. En effet, le "9-cis retinoic acid" (9-cis-RA) bloque l'apoptose induite par l'activation via  la liaison à RXR (Iwata, Mukai et al. 1992) , indiquant une inhibition potentielle de la fonction de Nur77 par RXR, probablement par un mécanisme de compétition entre la forme monomère et la forme dimère (Iwata, Mukai et al. 1992) . Ainsi, Nur77 pourrait induire l'apoptose sous forme monomère en absence de 9-cis-RA et inhiber l'apoptose en s'hétérodimérisant avec RXR en présence de 9-cis-RA.  Ces éléments nous donnent des indications sur le type de séquence cible de Nur77 que l'on peut trouver in vivo.  Celles-ci  seront probablement différentes du consensus à 8 bases établi in vitro qui ne lie qu’une forme monomère de Nur77.
  5         R ÉGULATION  DE  L EXPRESSION  DE N UR 77  Le récepteur nucléaire Nur77 est un médiateur de la catégorie des "immediate early genes", induit très précocement lors du signal donné par le récepteur T. Le second messager Ca 2+  est un des éléments clés dans la voie de transduction via le TCR conduisant à l'expression massive et immédiate de Nur77, et à l'apoptose des thymocytes. Le signal Ca 2+  peut être converti en deux voies transcriptionnelles par des mécanismes différents, incluant l'activation de kinases et de phosphatases (Berridge, Bootman et al. 1998) . La voie de transduction du signal conduisant du TCR à la transcription de Nur77, ainsi que les éléments critiques du promoteur de Nur77 répondant au calcium commencent à être décryptés (Figure 6). Il s’agit notamment de sites de liaison pour MEF2 (Woronicz, Lina et al. 1995) , un facteur connu pour réguler l’expression de l’« atrial natriuretic factor  » ( ANF ) dans les cellules cardiaques (Morin, Charron et al. 2000) . MEF2 est lié à un co-répresseur, nommé cabin1, capable de recruter des histones deacetylases (HDAC) (Youn, Sun et al. 1999) . Une voie d’activation par le Ca2+ intracellulaire conduit à la libération du co-répresseur cabin1 et des HDAC, par liaison compétitive à la calmoduline (Youn, Chatila et al. 2000; Youn and Liu 2000) , mais la libération de MEF2 n’est pas suffisante pour l’activer. Une seconde voie dépendante du Ca 2+ relayée par la calcineurine et le facteur NFAT est également nécessaire pour activer MEF2 et la transcription de Nur77 (Woronicz, Lina et al. 1995; Youn, Sun et al. 1999) . Le complexe NFAT-MEF2 est synergique et recrute le coactivateur p300 pour la transcription de Nur77 (Youn, Chatila et al. 2000) . Ceci suggère que NFAT et la calcineurine sont impliqués non seulement dans l’activation, mais aussi dans l’apoptose des thymocytes.   6         L E  RÔLE  PHYSIOLOGIQUE  DES  RÉCEPTEURS  NUCLÉAIRES NFGI-B / N UR 77  Les membres de la sous-famille des récepteurs nucléaires NGFI-B sont exprimés dans de nombreux organes (l’hypothalamus, l’hypophyse, les surrénales, les testicules et le thymus). Leur rôle physiologique est essentiel dans les systèmes nerveux, endocrinien (dans l’axe hypothalamo-hypophysaire) et immunitaire (Maruyama, Tsukada et al. 1998) .  Nur77 est un gène induit précocement par des signaux variés, incluant le NGF, les facteurs de croissance dans le sérum, les phorbols esters, les androgènes, des neurotransmetteurs, mais aussi par des stimuli physiques comme la dépolarisation membranaire. Il est impliqué dans le développement, la différenciation et la fonction du système nerveux, dans la régulation de la POMC, le précurseur de plusieurs molécules neuropeptidiques incluant la corticotropine (ACTH), la stéroïdogénèse, la régulation neuroendocrine, la signalisation de la vitamine A et dans le contrôle de l’équilibre apoptose/prolifération et plus particulièrement dans le contrôle de l’apoptose des thymocytes (la sélection négative thymique) et des cellules B immatures.  6.1Implication de Nur77 dans l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien  La sous famille de gènes NFGI-B est très exprimée dans l’hypothalamus, et de façon basale dans les glandes surrénales et hypophyse (Bandoh, Tsukada et al. 1997; Maruyama, Tsukada et al. 1997) . Leur expression devient plus forte dans ces organes en réponse à un stimulus externe comme un stress physique ou émotionnel (Watson and Milbrandt 1989; Davis and Lau 1994; Imaki, Shibasaki et al. 1996; Smith, Kim et al. 1997) . Nur77 active la transcription du gène codant pour la stéroïde 21-hydroxylase (P450 c21 , CYP21 ) (Wilson, Mouw et al. 1993a) , une enzyme limitante essentielle dans la synthèse des glucocorticoïdes et des minéralocorticoïdes (Simpson and Waterman 1988) . NGFI-B et Nurr-1 sont également impliqués dans l’expression du gène du facteur de relargage de la corticotropine (CRF : « corticotropin releasing factor ») et de la POMC par interaction avec une séquence spécifique en cis dans la région proximale de son promoteur ( Murphy and Conneely 1997; Philips, Lesage et al. 1997 ) . C’est l’ACTH qui induit l’expression de Nur77 par les cellules corticales surrénaliennes, qui à son tour induit la synthèse 21-O hydroxylase, puis la synthèse des stéroïdes. L’ACTH régule Nur77 de deux façons : en activant l’expression de son gène et de façon post-transcriptionnelle, en modifiant sa phosphorylation (Davis and Lau 1994) . Ces données suggèrent que la sous famille de NGFI-B joue un rôle de coordinateur dans la régulation neuro-endocrine de l’axe HPA à de multiples niveaux. Cependant aucune anomalie de fonction de l’axe HPA n’a été démontrée chez des souris déficientes pour NGFI-B, démontrant là encore l’existence d’une redondance fonctionnelle entre les gènes de la famille de NGFI-B (Crawford, Sadovsky et al. 1995) .  6.2Implication de Nur77 dans la différenciation et la fonction neuronale  NGFI-B, Nurr1 et NOR-1 ont été identifiés dans un premier temps dans le cerveau (le tissu neuronal et les cellules neuronales) où ils sont abondamment exprimés. La différenciation des cellules neuronales induite par le NGF chez le rat est accompagnée de l’expression de NGFI-B (Maruyama, Tsukada et al. 1998) . Le traitement de cultures de cellules de cerveau de rat fœtal avec un ARNm antisens de NOR-1 induit une migration cellulaire, une extension de neurites et une agrégation cellulaire. Des souris déficientes pour Nurr1 ont montré un défaut du développement des neurones dopaminergiques qui s’avère létal peu de temps après la naissance. Tout ceci semble
indiquer l’implication de la sous famille de NGFI-B dans la différenciation et le développement du système nerveux (Maruyama, Tsukada et al. 1998) . Ces récepteurs orphelins semblent jouer aussi un rôle important dans la transduction du signal dans le cerveau adulte, mais le rôle exact de la sous famille de NGFI-B dans le système nerveux reste encore à clarifier (Maruyama, Tsukada et al. 1998).  6.3Implication de Nur77 dans la sélection négative thymique  Contrairement aux signaux tels que le sérum et le NGF, qui conduisent à une expression transitoire de Nur77, la stimulation via  le récepteur T conduit à une expression forte et soutenue de Nur77 dans le thymus qui initie l’apoptose des thymocytes au cours de la sélection négative. L’apoptose relayée par le TCR est dépendante du calcium, inhibée par la Ciclosporine (CsA), et le signal emprunte la voie de la protéine kinase C (PKC) ( Jehn and Osborne 1997; Winoto 1997 ) . De nombreux arguments ont été accumulés démontrant le rôle de Nur77 dans la sélection négative des thymocytes : 1) Il y a une corrélation étroite entre une forte expression de Nur77 et l'apoptose induite via le récepteur T dans le thymus. En effet, in vitro  l'expression de Nur77 augmente fortement lors de la mort induite par activation via  le récepteur T (« Activation Induced Cell Death » ou AICD) des thymocytes immatures (Liu, Smith et al. 1994; Woronicz, Calnan et al. 1994) .  Cette expression est corrélée à l'apoptose, maintenue pendant le processus apoptotique et spécifique des thymocytes en apoptose. En effet Nur77 est fortement exprimé dans les thymocytes en apoptose mais pas dans des cellules T matures en prolifération ni dans des splénocytes stimulés. De plus, l'injection à des souris d’un anticorps anti-CD3 (associé au récepteur T) induit une apoptose des thymocytes corrélée à l'expression de Nur77 ( Woronicz, Calnan et al. 1994 ) . La sélection négative chez des souris transgéniques pour le récepteur T traitées par un peptide spécifique de ce récepteur est en relation avec l'activité apoptotique et l'expression des ARNm de Nur77 ( Xue, Chomez et al. 1997 ) .  Enfin, Nur77 est exprimé dans la médulla thymique où se passe la sélection négative ( Lee, Wesselschmidt et al. 1995 ) . 2)  Nur77 est nécessaire à la mort induite par activation. Le blocage de Nur77 par expression stable d'un mutant dominant négatif (mutant capable de se lier à l'ADN mais dépourvu de fonction de transactivation) ou par l'expression transitoire d'un ARN antisens inhibe l'AICD (Liu, Smith et al. 1994; Woronicz, Calnan et al. 1994) . 3) Des souris transgéniques exprimant le mutant Nur77 dominant négatif présentent une inhibition de la sélection négative des thymocytes, ainsi qu'une perturbation du développement des cellules T qui se traduit par une augmentation de thymocytes matures CD4+CD8-(Calnan, Szychowski et al. 1995) . 4)  L’expression constitutive de Nur77 dans les thymocytes en développement induit l'apoptose et entraîne une diminution du nombre des thymocytes et des cellules T matures (Calnan, Szychowski et al. 1995) .  Bien que l’on connaisse le rôle de Nur77 dans la sélection négative intrathymique, aucun gène régulé par Nur77 n’est encore identifié dans le thymus.   7         I DENTIFICATION  DES  GÈNES  CIBLES  DE N UR 77  7.1Situation du sujet  Pour identifier les gènes cibles de Nur77, l’équipe du docteur Sylvia Cohen-Kaminsky a adapté, une technique mise au point pour des facteurs de transcription hématopoïétiques (Deveaux, Cohen-Kaminsky et al. 1997; Cohen-Kaminsky, Maouche-Chretien et al. 1998) .  Cette technique qu'elle a nommée : TFChIP (Transcription Factor Chromatin Immunoprecipitation) permet de capturer, in vivo  dans la chromatine native, les complexes ADN-protéines contenant un facteur de transcription défini, à l’aide d’un anticorps dirigé contre ce facteur de transcription (Figure 7). Les fragments d’ADN purifiés ainsi obtenus, représentent des régions régulatrices de gènes auxquelles était fixé le facteur de transcription in vivo. Cet ADN, cloné dans un plasmide, permet de générer une banque de régions génomiques cibles potentielles pour le facteur (10000 à 20000 clones). L’ADN est ensuite séquencé et l’analyse des clones permet d’une part d’identifier les séquences cibles in vivo  du facteur de transcription et d’autre part de retrouver, les gènes associés à ces régions régulatrices et donc d’identifier les gènes cibles du facteur de transcription d’intérêt.  Cette stratégie nommée TFChIP se distingue de ChIP qui est utilisée pour analyser les modifications de la chromatine (notamment l’ouverture de la chromatine par l’acétylation) associées à l’activation des gènes. ChIP est une méthode en 3 étapes (fixation, sonication, immunoprécipitation) pour isoler des fragments de chromatine liée à une protéine (histones acétylées ou protéine du complexe de transcription basal par exemple), suivie d’une quantification relative par PCR pour rechercher des fragments prédéfinis dans l’immunoprécipité (en général des promoteurs ou autres régions régulatrices). TFChIP est une procédure qui comporte bien plus d’étapes (voir plus loin), qui sont nécessaires lorsque l’on cible dans la chromatine des protéines peu représentées comme les facteurs de transcription. La différence fondamentale avec ChIP est sans doute que l’on aboutit avec TFChIP, à une banque de clones issus du matériel immunosélectionné et que l’on n’a pas d’idée préconçue des cibles recherchées (sauf si une cible est déjà connue, ce qui permet de valider l’expérience en retrouvant le clone correspondant dans la banque). De plus les fragments de chromatine capturés par TFChIP qui représentent des régions génomiques ré de aussi bien des d’une ré éloi en 5’
ou en 3’, ou encore d’un intron du gène cible et parfois même se situer dans 3’UTR (3’ non traduit).  TFChIP est la seule approche qui combine les points clefs suivants :  - l’identification de gènes cibles directes pour le facteur de transcription d’intérêt, contrairement aux approches différentielles comme les banques soustractives, l’hybridation différentielle ou le « differential display » (affichage différentiel des ARNm) qui identifient aussi des cibles indirectes impliquées dans des cascades de régulation. - l’identification de cibles qui reflètent l’activité de liaison in vivo  du facteur à sa cible et sont des cibles réellement occupées in vivo. - la possibilité de caractériser des sites de faible affinité, difficiles à détecter par d’autres approches. En effet les cibles identifiées in vivo  par TFChIP sont le plus souvent de faible affinité par rapport au consensus de liaison établi in vitro. - l’identification d’un ensemble de gènes, régulés in vivo dans un processus biologique ou pathologique donné et l’assurance de pouvoir lier : i) le facteur de transcription, ii) sa capacité à se lier à un motif présent dans une région régulatrice génomique authentique et iii) une fonction biologique ou une situation pathologique définie.  7.2Construction d’une banque de cible de Nur77 par immunoprécipitation de la chromatine (TFChIP)  Une banque de séquences cibles de Nur77 au cours de la sélection négative thymique a ainsi été construite à partir de lymphocytes T thymiques de souris transgéniques pour un récepteur T défini. L’utilisation de ces souris permet l’amplification et la synchronisation de la sélection thymique après une seule injection par voie intra-veineuse du peptide reconnu par le TCR transgénique. Cette banque comprend environ 10000 clones, dont un échantillon de 300 clones a été séquencés parmi lequel 288 sont exploitables. La recherche dans cette banque des séquences contenant les sites de fixation potentiels de Nur77 et plus particulièrement des séquences proches ou adjacentes de ces sites pourra permettre d’identifier des gènes régulés par Nur77.  7.3Objectifs  A partir de cette banque, mes objectifs étaient de mettre au point une méthode de criblage des gènes cibles de Nur77.  Une première approche a été l’analyse de la fixation de Nur77 sur ses cibles, dans la mesure où le site consensus admis pour Nur77 avait été défini dans des cellules non lymphocytaires et par une approche in vitro dite de « Casting ». De plus les études réalisées portaient uniquement sur des protéines traduites in vitro qui ne reflètent pas nécessairement la situation in vivo qui pourrait être plus complexe et faire intervenir des co-facteurs pour la fixation de Nur77 à ses cibles. C’est pourquoi nous avons entrepris de rechercher quelles sont les bases importantes du site consensus défini in vitro  pour la fixation de Nur77 en utilisant des oligonucléotides synthétiques, différents du consensus par une substitution par les trois autres bases à chacune des positions. Nous avons utilisé deux types d’extraits protéiques : d’une part, Nur77 traduit in vitro  et d’autre part, des extraits de thymocytes stimulés pour l’induction de Nur77 et l’engagement dans la voie d’apoptose. Nous avons dans un premier temps mis au point la production d’extraits nucléaires en utilisant comme témoin positif Nur77 traduit in vitro et le site consensus de liaison de Nur77. Ces extraits nucléaires ont été produits à partir de thymocytes stimulés dans la voie d’apoptose et j’ai vérifié que Nur77 produit in vivo était bien exprimé et fonctionnel pour la fixation sur le site consensus.  Une deuxième approche a été de valider ces cibles par une méthode qui reflète de façon plus fiable la situation physiologique de liaison de Nur77 à ses cibles in vivo  dans un contexte chromatinien. Il s’agit d’immunoprécipitation de la chromatine suivie de PCR avec quantification relative des produits pour attester la présence des cibles d’intérêt dans le matériel immunoprécipité. Enfin, j’ai abordé l’étude fonctionnelle de deux clones particuliers correspondant à des gènes pertinents pour le processus d’apoptose au cours la sélection thymique en étudiant leur expression au niveau des messagers et de la protéine en corrélation avec l’expression de Nur77.         
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