RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D'OVOCYTES DE XÉNOPES

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Julie PEREZ Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D'OVOCYTES DE XÉNOPES Soutenu le 16 décembre 2005 Devant le jury suivant : Pr. Yves BENYAMIN - Président Dr. Caroline MOYRET-LALLE - Examinatrice Dr. Anne MARCILHAC - Examinatrice Dr. Thierry LORCA - Examinateur Laboratoire : Directeur : Pr. Yves BENYAMIN EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Motilité cellulaire - UMR 5539 Université Montpellier II – Place Eugène Bataillon 34095 MONTPELLIER Cedex 05 Laboratoire : Directeur : Pr. Paul MANGEAT CNRS-CRBM FRE 2593 Tuteur : Dr. Thierry LORCA 1919 route de Mende 34095 MONTPELLIER Cedex 05 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D'OVOCYTES DE XÉNOPES RÉSUMÉ L'entrée en mitose et la progression de cette phase essentielle du cycle cellulaire des eucaryotes est sous le contrôle la protéine kinase Cdk1/Cycline B. Cette kinase hétérodimérique permet l'activation du complexe EPHE Banque de Monographies SVT 1

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  • localisation sur les kinétochores dans les conditions de mécanisme de surveillance de l'intégrité du fuseau mitotique

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Publié le : jeudi 1 décembre 2005
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 MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre  MEMOIRE présenté par  Julie PEREZ Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D’OVOCYTES DE XÉNOPES  Soutenule 16 décembre 2005  Devant le jury suivant : Pr. Yves BENYAMIN - Président Dr. Caroline MOYRET-LALLE - Examinatrice Dr. Anne MARCILHAC - Examinatrice Dr. Thierry LORCA - Examinateur    Laboratoire : Directeur : Pr. Yves BENYAMIN EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) benyamin@univ-montp2.fr Motilité cellulaire - UMR 5539 Université Montpellier II – Place Eugène Bataillon 34095 MONTPELLIER Cedex 05   Laboratoire : Directeur : Pr. Paul MANGEAT CNRS-CRBM FRE 2593 Tuteur : Dr. Thierry LORCA 1919 route de Mende lorca@crbm.cnrs-mop.fr 34095 MONTPELLIER Cedex 05     ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre  RÉGULATION DES COMPLEXES MITOTIQUES APC/CDC20 ET APC/CDH1 DANS LES EXTRAITS D’OVOCYTES DE XÉNOPES  RÉSUMÉ  L’entrée en mitose et la progression de cette phase essentielle du cycle cellulaire des eucaryotes est sous le contrôle la protéine kinase Cdk1/Cycline B. Cette kinase hétérodimérique permet l’activation du complexe
APC/Cdc20 responsable de l’ubiquitination de la Cycline B, signal nécessaire à sa dégradation par le protéasome 26S, et à l’inactivation de la kinase Cdk1. À la transition métaphase-anaphase le complexe APC est activé par un homologue de la protéine Cdc20, la protéine Cdh1. Ce complexe APC/Cdh1 est responsable de l’ubiquitination et de la dégradation de la protéine kinase Aurora-A en fin de mitose. Au cours de ce stage, je me suis intéressée à la proteine AIP (Aurora-A Interacting Protein) qui, chez l’homme, interagie avec la protéine kinase Aurora-A et induit sa dégradation. De manière à mettre en évidence un lien possible entre la protéine AIP et le complexe APC/Cdh1, tous deux responsables de l’instabilité de la protéine kinase Aurora-A, nous avons cloné l’homologue de la protéine AIP chez le xénope. Cette protéine présente 43% d’identité avec son homologue humain. Cette homologie étant surtout très forte dans la partie C-terminale de la protéine. Par la suite, nous avons sous-cloné l’ADNc codant pour la protéine AIP dans de nombreux vecteurs d’expression de manière à produire la protéine AIP sous différentes formes. L’objectif ici était de produire AIP à partir d’un système bacculovirus, bactérien etin vitrole lysat de réticulocytes. Nous avons rencontré à ce niveau undans l’extrait d’œufs de xénope ou bien problème d’expression majeur qui ne nous a pas permis d’obtenir suffisamment de protéine AIP pour pouvoir étudier le rôle de AIP et son lien potentiel avec le complexe APC/Cdh1. Nous avons donc dans un deuxième temps initié une deuxième étude sur l’étude de la protéine Cdc20 et sa localisation sur les kinétochores dans les conditions de mécanisme de surveillance de l’intégrité du fuseau mitotique actif (ou « spindle checkpoint »). Nous avons ainsi dans un premier temps amélioré les conditions de traduction des ARNm exogènes dans les extraits d’œufs de xénope arrêtés en métaphase de deuxième méiose. Ceci nous a permis de produire des quantités de protéines Cdc20 sauvage et mutantes supérieures ou égales au Cdc20 endogène.Nous avons pu mettre en évidence un rôle critique de la concentration de la protéine Cdc20 dans l’extrait et l’œuf de xénope. Dans un deuxième temps, nous avons montré que l’association à la protéine Mad2 ne semble pas requise pour la localisation de Cdc20 aux kinétochores et enfin dans un troisième temps nous avons pu déterminer que le domaine de liaison aux kinétochores pourrait se localiser au niveau des domaines WD40.  MOTS CLÉS : APC : Anaphase Promoting Complex ; Cdh1 ; Cdc20 ; Mitose ; mécanisme de surveillance ; Cdk1-Cycline B.
TABLE DES MATIÈRES
   LISTE DES ABRÉVIATIONS1  INTRODUCTION                                                                                                                                                                                 3  PARTIE 1 : LE CYCLE CELLULAIRE3 I / Les phases du cycle cellulaire3 II / Les contrôles du cycle cellulaire6 II-1 / La régulation de la succession des phases du cycle cellulaire6 II-2 / Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire7  PARTIE 2 : LA MITOSE9 I / Les acteurs de la progression mitotique9 I-1 / Le MPF9 I-2 / L’APC11 II / Le point de contrôle du fuseau mitotique14
III/ Implication des kinases Aurora dans la mitose16 III-1/ La famille des kinases mitotique Aurora16 III-2/ La kinase Aurora-B18 III-3/ La kinase Aurora-A21 III-3-a/ Régulation de l’expression d’Aurora-A21 III-3-b/ Régulation de l’activité kinasique d’Aurora-A22 III-3-c/ Rôles exercés par Aurora-A lors du cycle cellulaire25  PARTIE 3 : LA MATURATION MÉIOTIQUE DE L’OVOCYTE DE XÉNOPE27 I/ Méiose femelle27 I-1/ Arrêt physiologique des œufs de xénopes27 I-1-a/ Arrêt en prophase de première division méiotique28 I-1-b/ Reprise de la première division de méiose et arrêt en métaphase de deuxième division méiotique28 II/ Évènements biochimiques régulant la maturation méiotique29 II-1/ Voie de signalisation conduisant à l’activation du MPF29 II-2/ MPF et transition méiose I/méiose II30 III/ L’arrêt CSF31 III-1/ Mécanisme biochimique responsable de l’arrêt CSF31 III-2/ Maintenance de l’arrêt CSF32 IV/ Fécondation et sortie de CSF33  SUJET DE RECHERCHE                                                                                                                                                                34  MATÉRIELS ET MÉTHODES36  PARTIE 1 : BIOLOGIE MOLÉCULAIRE36 I/ Préparation d’ADN complémentaire de xénope par RT-PCR36 I-1/ Synthèse de l’ADNc de xénope36 I-2/ Amplification des ADNc de xénopes36 II/ Sous clonage des ADNc amplifiés dans différents vecteurs37 III/ mutagenèse dirigée38 IV/ Séquençage39 V/ Clonage et purification des vecteurs d’expression40 V-1/ Étape analytique40 V-2/ Étape préparative41 VI/ Transcription et traductionin vitro41 VI-1/ Transcriptionin vitro41 VI-2/ Traductionin vitro42  
PARTIE 2 : BIOCHIMIE43 I/ Production des protéines d’intérêts à partir d’un système procaryote (E.coli)43 I-1/ Transformation bactérienne43 I-2/ Expression analytique des protéines43 I-3/ Expression préparative des protéines45  II/ Purification des protéines exprimées45 II-1/ La fraction soluble45 II-2/ La fraction insoluble46 II-2-a/ Purification des corps d’inclusion46 II-2-b/ Électroélution de notre protéine présente dans les corps d’inclusion47 III/ Préparation d’une phase Sépharose-CNBr-GST-AIP et purification des anticorps par affinité.47 III-1/ Préparation d’une phase d’affinité Sépharose-CNBr-GST-AIP47 III-2/ Purification par affinité des anticorps présents dans le sérum48 IV/ Réalisation des extraits d’ovocytes de xénope49 IV-1/ Préparation de la ponte de xénope49 IV-2/ Préparation d’extraits CSF et interphasique d’ovocytes de xénope49 IV-3/ Test rapide de l’extrait CSF50 V/ Traduction dans les extraits d’ovocytes de xénope51  PARTIE 3 : BIOLOGIE CELLULAIRE52 I/ Immunoprécipitation52 II/ Le Western blot53 III/ Activité histone H1 kinase54 IV/ Immunofluorescence55 V/ Cinétique de dégradation de la protéine cycline B endogène56  RÉSULTATS                                                                                                                                                                                 57  PARTIE 1 : Etude de la protéolyse de la protéine kinase Aurora-A par la protéine AIP57 I/ Sous clonage de AIP dans différents vecteurs58 II/ Production de la protéine AIP fusionnée à la GST61 III/ Identification de la protéine produite et caractérisation des anticorps obtenus62 IV/ Expression protéique en cellules d’insectes64 V/ Transcription et traduction de la protéine AIPin vitro                                                                                                          64  PARTIE 2 : Caractérisation de la protéine Cdc2066 I/ Caractérisation du domaine de Cdc20 requit pour sa localisation aux kinétochores66 I-1/ Présentation des différents domaines de la protéine Cdc20 sauvage et des protéines mutantes obtenues66 I-2/ Production des ADNc et ARNm codant pour nos protéines mutantes.67 I-3/ Localisation aux kinétochores et immunofluorescence.70
II/ Evaluation de la capacité de chaque mutant à activer l’APC en mesurant la protéolyse de la Cycline B76 III/ Détermination de l’effet dominant négatif des mutants Cdc20 sur leur capacité à inhiber la dégradation de la Cycline B83   DISCUSSION ET PERSPECTIVES86 I/ Discussion86 II/ Perspectives96  BIBLIOGRAPHIE98  ANNEXES  ANNEXE 1 : Composition des milieux, colorants, tampons et solution utilisées107 ANNEXE 2 : Carte de restriction du vecteur pBKs110 ANNEXE 3 : Carte de restriction du vecteur pCS2111 ANNEXE 4 : Carte de restriction du vecteur pGex112 ANNEXE 5 : Carte de restriction du vecteur pMal113 ANNEXE 6 : Séquence primaire de l’ADNc codant pour Cdc20 deXenopus Laevis              114 ANNEXE 7 : Sites de restriction uniques et absents de la séquence primaire de Cdc20 deXenopus Laevis                                               115 ANNEXE 8 : Mise en évidence des mutations ponctuelles du mutant M-NP de Cdc20116 ANNEXE 9 : Séquence primaire de l’ADNc codant pour AIP deXenopus Laevis              117 ANNEXE 10:Sites de restriction uniques et absents de la séquence primaire de Cdc20 deXenopus Laevis                                               118                
LISTE DES ABREVIATION     
  ADN Acide DésoxyriboNucléique  ADNc Acide DésoxyriboNucléique complémentaire  AIP Aurora Interacting Protein  APC Anaphase Promoting Complexe  ARN Acide RiboNucléique  ATP Adénosine TriPhosphate  BSA Bovine Serum Albumine  CIP Calf Intestinal Phosphatase  Cdc Cell Division Cycle  Cdk Cyclin dependent kinase  CNBr Bromure de cyanogène  CPM Coup Par Minute  CSF CytoStatic Factor  DAPI Di Amino Phenyl Indol  dNTP désoxyriboNucléosides Triphosphate  ddNTP didésoxyriboNucléosides Triphosphate  DTT DiThioTréitol  DO Densité Optique                                     / Délété Déplété  GST Glutathion S-Transferase  GVBD Germinal Vesicle BreakDown  HCG Hormon Chorionic Gonatropin  HRP Horse Rodish Peroxidase  IPTG Isopropyl b D-thiogalactopyranoside  l Longeur d’onde  M mol/L  MBP Maltose Binding Protein  MPF M-Promotor Factor  MTOC Microtubule Organizing Center  PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis  PCR Polymerase Chain Reaction  SDS Sodium Dodécyl Sulfate  TM Temperature Melting  TEMED Tétramethyl-Ethylènediamine  u unité  ub Ubiquitine  WT Wild Type        
                                PARTIE 1 : LE CYCLE CELLULAIRE  « Tous les êtres vivants sont formés d’un ensemble d’unités de construction de même type, les cellules. ». C’est au milieu du XIXiéme siècle, que le docteur Théodore Schwann (1810-1882) propose cette notion : La cellule comme constituant de base de l’organisme vivant.   Le cycle cellulaire est le processus biologique fondamental permettant à une cellule de se reproduire à l’identique. Chez les vertébrés, une seule cellule, la cellule mère, donnera après division, deux cellules filles parfaitement identiques entre elles et à la cellule dont-elles sont issues. Le patrimoine génétique est conservé entre la cellule mère et les cellules filles. Grâce à ce processus de division cellulaire, les cellules vont se multiplier, permettant à l’embryon de se développer à partir d’une cellule œuf unique, à l’organisme de grandir et de régénérer les tissus endommagés pendant la vie adulte.  Chez l’être humain, une cellule œuf fertilisée va donner, par divisions successives, les 100 000 milliards de cellules qui composent le corps humain à l’âge adulte. À l’extrême, certains êtres vivants microscopiques sont formés d’une seule cellule (levures, amibes). Chez ces êtres unicellulaires, la division cellulaire permet la production d’un organisme supplémentaire et identique au précédent.  D’une façon générale, les cellules se reproduisent en dupliquant leurs composants, en le répartissant équitablement en deux et en se divisant. Cette série d’évènements doit être parfaitement
INTRODUCTION
régulée, afin d’éviter l’apparition de tumeur. Tout au long du cycle cellulaire, des points de contrôle permettent à la cellule de vérifier le bon déroulement des différentes étapes. Dans le cas ou un problème surviendrait, la cellule est capable d’arrêter le cycle de division, et de le reprendre une fois le problème réglé. Si le problème est irréparable, La cellule induit ça propre mort afin de protéger l’organisme.  I / Les phases du cycle cellulaire   Le cycle cellulaire est constitué principalement de deux phases : une phase de division, la mitose et une phase de croissance, l’interphase, qui sépare deux divisions.  Certaines cellules suivent le cycle cellulaire de façon continue, d’autres, quittent le cycle temporairement pour entrer enphase G0. Cette phase correspond à une phase de quiescence pendant laquelle les cellules ne se divisent pas, c’est sous l’effet de signaux mitogènes qu’elles entameront un nouveau cycle de division. Une partie des cellules quitte le cycle cellulaire définitivement et entre dans une voie apoptotique. Ces cellules ne participent pas à une nouvelle division, elles meurent.   L’interphase se cellules vont correspond à une période de croissance pendant laquelle les préparer à la mitose. Les cellules seront prêtes à entrer en mitose, lorsqu’elles auront la taille et l’équipement en organite favorable à la viabilité des cellules filles, et lorsque leur ADN et le centrosome seront répliqués. L’interphase est subdivisée en trois phases : une phase de croissance initiale, laphase G1. Pendant laquelle la cellule croît et devient plus large, c’est une phase de mise en route du mécanisme biochimique de réplication (synthèse d’ARNs, de protéines et d’enzymes). Lorsqu’elle atteint une certaine taille, la cellule entre dans la phase suivante, laphase S. Cette phase correspond à une étape de synthèse, durant laquelle il y a réplication de l’ADN. Enfin, une seconde phase de croissance, laphase G2.C’est un intervalle entre la phase S et M, durant lequel il y a synthèse protéique dont une partie est nécessaire à l’édification du fuseau cellulaire.  Les phases G1 et G2 (G pour « GAP », intervalle) ont deux rôles essentiels : d’une part préparer la cellule à entrer dans la phase suivante (phase S ou M), et d’autre part vérifier le bon déroulement de la phase précédente.   Lamitose est une phase de division cellulaire. Au cours de l’interphase, il y a eu duplication des chromosomes et du matériel cytoplasmique de la cellule, la mitose va désormais permettre la répartition en deux lots équitables du matériel génétique et la séparation en deux cellules fille. La mitose est classiquement découpée en cinq phases :  Laprophase Les deux, qui se caractérise d’une part par la condensation chromosomique. chromatides de chaque chromosome sont alors bien définies, elles sont reliées au niveau des kinétochores centromériques. D’autre part, le fuseau mitotique se met en place à l’extérieur du noyau par séparation des deux centrosomes, aussi appelés centre organisateur des microtubules (MTOC pour microtubule organizing center). Les centrosomes se disposent autour du noyau de façon diamétralement opposé et forme les pôles du fuseau mitotique. À laprométaphase, l’enveloppe nucléaire se rompt et disparaît permettant aux microtubules du fuseau de capturer les chromosomes au niveau de leurs kinétochores. Une fois l’attachement bipolaire acquis, les chromosomes s’alignent sur la plaque équatoriale du fuseau. La métaphaseoù la totalité des chromosomes sont alignés. Ils sont maintenus au moment  sous correspond tension par les kinétochores et les microtubules associés attachés aux pôles opposés du fuseau. Lorsque
tous les chromosomes sont parfaitement alignés, la cellule peut alors passer en anaphase. L’anaphase correspond au moment où les chromatides sœurs se séparent, chacune migre vers un pôle du fuseau pour former deux lots identiques. En anaphase A, les microtubules kinétochoriens se dépolymérisent donc se raccourcissent et tractent les chromatides vers un pôle du fuseau. En anaphases B, les microtubules polaires s’allongent par polymérisation et éloignent les deux pôles du fuseau. Enfin, latélophase à la correspond formation d’une enveloppe nucléaire autour de chaque lot chromosomique, dans laquelle les chromatides se décondensent. Parallèlement, il y a invagination de la membrane plasmique et formation d’un anneau contractile permettant la séparation des deux cellules filles, c’est lacytokinèse. Une fois la division cellulaire achevée, le cycle cellulaire est bouclé, les cellules nouvellement formées peuvent entrer en phase G1 et démarrer un nouveau cycle de division ou entrer en phase G0 (pour revue, voir Meijer, 2003).  La succession précise des phases G1, S, G2 et M, constitue un cycle de division. La durée de ce cycle varie considérablement en fonction des types cellulaires. Chez la plupart des cellules de mammifère, il dure entre10 et 30 heures. Plus particulièrement chez l’homme, le cycle cellulaire dure environ 24 heures. Un temps défini est attribué à chaque phase du cycle, pour les cellules humaines, elles ont approximativement les durées suivantes : la phase la plus longue est la phase G1 qui dure 11 heures, ensuite la phase S : 8 heures, la phase G2 : 4 heures et la phase M qui ne dure qu’une heure. La durée de  chacune des phases du cycle est variable selon les espèces. Mais la phase la plus variable est la phase G1 qui peut durer de 6 à 12 heures, la phase M en revanche à une durée relativement stable. Paradoxalement, la phase M est la plus courte alors qu’elle regroupe de nombreux évènements complexes.  D’autres cycles cellulaires sont beaucoup plus courts. C’est le cas notamment des cycles   embryonnaires précoces qui se produisent, chez certaines espèces animales (dont le xénope), immédiatement après la fécondation. Ces cycles, d’une durée comprise entre 8 et 60 minutes selon les espèces, permettent de diviser rapidement la cellule œuf. Ils ne comportent pas de croissance cellulaire, pas de phase G1 ni G2, et se caractérisent par une succession rapide de phases S et M.  II / Les contrôles du cycle cellulaire    Chez les eucaryotes supérieurs, le cycle cellulaire se compose de quatre phases bien définies, qui se succèdent dans un ordre précis et invariable : phase G1, S, G2 et M. Il est indispensable pour le bon développement et la survie des organismes que les différentes phases du cycle cellulaire s’enchaînent de façon coordonnée. Chaque phase ne devant démarrer que lorsque la précédente s’est déroulée et terminée correctement. Des erreurs de coordinations du cycle cellulaire peuvent conduire à des altérations chromosomiques, comme la mutation ou perte d’un chromosome, ou encore la distribution inéquitable des chromosomes entre les cellules fille, ce qui entraînerait des problèmes d’aneuploïdie. Ces phénomènes sont souvent observés chez les cellules cancéreuses, d’où l’importance accordée au processus de contrôle du cycle cellulaire.  Pour assurer, d’une part, l’enchaînement correct des quatre phases du cycle, et d’autre part,         l’obtention de deux cellules filles parfaitement identiques, la cellule dispose de systèmes de régulation très pointilleux. La régulation de la succession des phases du cycle cellulaire s’effectue essentiellement par l’intervention de kinases cyclines-dépendantes (Cdkcyclin-dependent kinase) et de leurs cyclines associées. À celapour s’ajoute des mécanismes de surveillance du cycle, qui font intervenir d’autres molécules pour inhiber ces Cdk et bloquer la progression du cycle lorsqu’ils détectent une anomalie (étape précédente non terminée,
réparation de l’ADN nécessaire...).  II-1 / La régulation de la succession des phases du cycle cellulaire  Les trois lauréats du prix Nobel de Physiologie & Médecine en 2001 ont permis d’éclaircir les mécanismes de contrôle cellulaire, en identifiant les molécules régulatrices du cycle cellulaire chez tous les organismes eucaryotes. Leland Hartwell fut récompensé pour avoir mit en évidence une classe de gènes impliquée spécifiquement dans le contrôle du cycle cellulaire : ces gènes sont appelésCDC Cell (pour Division Cycle). Son travail sur Saccarymyces cerevisiae, lui permis d’identifier un gèneCDCqui contrôle la première étape de progression vers la phase G1, c’est le gèneCDC28aussi nommé gène « start ». Paul Nurse identifia à son tour chez la levure un gène équivalent au gène « start », qui contrôle en revanche plusieurs phases du cycle cellulaire. En 1987, il découvre son équivalent humain, qu’il nommeCDK1pour Cyclin Dependant Kinase 1 (aussi connue sous le nom de Cdc2). Chez l’homme, ce sont le produit des gènesCDK contrôlent les différents passages du cycle cellulaire, leur concentration ne qui varie pas au cours du cycle. C’est Timothy Hunt qui au début des années 80, découvre les premières molécules de cycline. Les cyclines sont des protéines dont la concentration varie périodiquement au cours du cycle cellulaire, elles sont synthétisées et dégradées de façon cyclique, d’où leur appellation. Les cyclines, comme les CDK ont été conservées chez toutes les espèces au cours de l’évolution (pour revue, voir Morgan, 1997).   Les kinases cyclines dépendantes : les CDK sont des sérine-thréonine kinases, dont l’activité catalytique consiste à phosphoryler des protéines cibles intervenant dans les événements du cycle cellulaire ou dans la progression du cycle. Cependant pour être fonctionnelles ces CDK doivent s’associer à une cycline. Les CDK constituent la sous-unité catalytique, et les cyclines la sous-unité régulatrice ou activatrice. Les cyclines sont nécessaires à l’activation des CDK par formation d’un complexe hétérodimérique et régulent leur activité enzymatique tout au long du cycle de division.  Le cycle cellulaire est contrôlé par l’intervention successive de six complexes CDK/Cycline   différents. Chaque complexe rentre en jeu à des moments précis du cycle cellulaire et possède une fonction et des substrats bien définis (pour revue, voir Meijer, 2003). L’ordre d’intervention des CDK est déterminé par l’ordre de transcription/traduction des cyclines.   Les systèmes de contrôle du cycle cellulaire repose sur les phénomènes d’activation et                d’inhibition des kinases cyclines-dépendantes. Ces CDKs peuvent être régulées à plusieurs niveaux : - Par l’assemblage transitoire des complexes CDK/Cycline, comme décris précédemment. - Par des modifications post-traductionnelles, essentiellement des phosphorylations ou déphosphorylations, qui peuvent être activatrices ou inhibitrices. - Par association transitoire avec des protéines inhibitrices, les CKI (CDK Inhibitor), qui ne régulent que négativement.  II-2 / Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire  Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire appelés points de contrôle ou « checkpoints » permettent à la cellule de détecter des anomalies, et de provoquer l’arrêt du cycle si des anomalies sont constatées. Ces points de contrôle sont des voies biochimiques qui régulent les transitions du cycle en réponse à des facteurs externes et internes. Tout au long de la progression du cycle cellulaire, il
y a quatre points de contrôle majeurs, tous intervenant dans un même but : faire que les deux cellules fille héritent exactement du même génome à la fin de la division cellulaire.  -Le point de restriction de la phase G1 point de :fin de phase G1 et constitue un il intervient en décision majeur du cycle cellulaire. À partir de là, la cellule entre définitivement ou n’entre pas dans un nouveau cycle de division. Ce point de restriction contrôle la taille et l’état physiologique de la cellule. Il surveille l’environnement extérieur afin d’y détecter des nutriments disponibles ou des facteurs de prolifération provenant d’autres cellules ou de la matrice extra-cellulaire. Si les stimuli de croissance ne sont pas appropriés ou sont insuffisants, le cycle s’arrête en attendant des conditions cellulaires adéquates ou lance un programme d’apoptose.  -Le point de contrôle du dommage à l’ADNétat de l’ADN tout au long des phases G1, : il vérifie le bon S et G2. Lorsque des lésions de l’ADN sont détectées, les transitions G1-S ou G2-M sont bloquées. Ces arrêts du cycle sont dus, d’une part, à la dégradation de l’activateur (CDC25A) des complexes CDK4/Cycline D et CDK2/Cycline E et A par la voie ATM-Chk2 (Busino et al., 2003) et d’autre part, à l’accumulation dans la cellule de p53 qui induit l’expression de p21. La protéine p21 est une CKI qui inhibe les complexes CDK2/Cycline E et A et CDK1/Cycline B.  - Le point de contrôle de la réplication de l’ADN: il contrôle si la réplication de l’ADN est correcte et totale. Si une anomalie de réplication est détectée, il bloque le cycle en phase S ou G2 et empêche l’entrée en mitose. Il y a phosphorylation de la phosphatase activatrice (CDC25C) du complexe CDK1/Cycline B, laquelle entraîne sa séquestration dans le cytoplasme via son interaction avec la protéine 14.3.3 (Forrest et Gabrielli, 2001). Le complexe reste alors inactif. Ce point de contrôle fait aussi intervenir la protéine p53, qui est un facteur de transcription de la protéine p21 et d’enzymes de réparation de l’ADN.  -           Le point de contrôle du fuseau mitotique: il surveille l’attachement correct des chromosomes métaphasiques aux microtubules du fuseau. Ce point de contrôle ne s’exerce qu’un court instant de la métaphase jusqu’à ce que tous les chromosomes soient alignés en plaque métaphasique (pour revue, voir Castro et al., 2003). Ce point de surveillance sera décrit plus en détail dans une seconde partie.     PARTIE 2 : LA MITOSE   I / Les acteurs de la progression mitotique  I-1 / Le MPF  LeMPF (M-phase Promoting Factor) est l’inducteur d’entrée en phase M (Méiose ou mitose). Ce facteur a été mis en évidence pour la première fois dans les ovocytes deRana pipiens(Masui et Markert, 1971). Il est présent chez tous les eucaryotes (Doree, 1990). Le MPF correspond à un
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