REGULATION HORMONALE DE L'EXPRESSION DU PROTO-ONCOGENE C-CBL DANS LES CELLULES GERMINALES MÂLES ET RELATION AVEC LE PROCESSUS APOPTOTIQUE

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Fouziha IKHLEF Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes REGULATION HORMONALE DE L'EXPRESSION DU PROTO-ONCOGENE C-CBL DANS LES CELLULES GERMINALES MÂLES ET RELATION AVEC LE PROCESSUS APOPTOTIQUE Soutenu le 22 avril 2004 devant le jury suivant : Pr Jean-Marie EXBRAYAT?Président Dr Claire BELLATON?Rapporteur Dr Daniel REGNIER?Examinateur Dr Mohamed BENAHMED?Examinateur Dr Colette ROCHE?Examinateur aboratoire Interactions Cellulaires, Laboratoire INSERM U407 etrovirus et Cancer EPHE Communications Cellulaires en MR 754-INRA-ENV Biologie de la Reproduction niversité Claude Bernard Faculté de Médecine Lyon-Sud avenue Tony Garnier- 69366 Lyon cedex 07 BP-12 F-69921 Oullins cedex recteur : Dr Geneviève CORDIER Directeur : Dr Mohamed BENAHMED aître de Conférences : Dr Claire BELLATON Responsable Scientifique : Dr Daniel REGNIER mail Dr Bellaton : e-mail Dr Régnier : ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE REGULATION HORMONALE DE L'EXPRESSION DU PROTO-ONCOGENE C-CBL DANS LES CELLULES GERMINALES MÂLES ET RELATION AVEC LE PROCESSUS APOPTOTIQUE Fouziha IKHLEF 22 avril 2004 EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : jeudi 1 avril 2004
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE   Présenté par Fouziha IKHLEF  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes     REGULATION HORMONALE DE L’EXPRESSION DU PROTO-ONCOGENE C-CBL DANS LES CELLULES GERMINALES MÂLES ET RELATION AVEC LE PROCESSUS APOPTOTIQUE        Soutenu le 22 avril 2004 devant le jury suivant :  Pr Jean-Marie EXBRAYAT Président Dr Claire BELLATON Rapporteur Dr Daniel REGNIER Examinateur Dr Mohamed BENAHMED Examinateur Dr Colette ROCHE Examinateur    Interactions Cellulaires, Laboratoire INSERM U407 et Cancer EPHE "Communications Cellulaires en 754-INRA-ENV Biologie de la Reproduction" Claude Bernard Faculté de Médecine Lyon-Sud avenue Tony Garnier- 69366 Lyon cedex 07 BP-12 F-69921 Oullins cedex recteur : Dr Geneviève CORDIER Directeur : Dr Mohamed BENAHMED          de Conférences : Dr Claire BELLATON Responsable Scientifique : Dr Daniel REGNIER Dr Bellaton : bellaton@univ-lyon1.fr  e-mail Dr Régnier : regnier@grisn.univ-lyon1.fr  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE  REGULATION HORMONALE DE L’EXPRESSION DU PROTO-ONCOGENE C-CBL DANS LES CELLULES GERMINALES MÂLES ET RELATION AVEC LE PROCESSUS APOPTOTIQUE  Fouziha IKHLEF 22 avril 2004
 La protéine p120 cbl , produit connu du proto-oncogène c-cbl , possède une fonction E3-ligase permettant l’ubiquitination de certains récepteurs à tyrosine-kinase ainsi que d’autres fonctions reliées ou non à la première telles que son implication dans le transport du glucose, un effet positif sur la prolifération cellulaire passant par la phosphoinositol-3 kinase ou l’organisation de l’actine du cytosquelette. L’expression majeure de la p120 cbl  se situe au niveau testiculaire et thymique. La région de lecture ouverte du transcrit codant pour la p120 cbl  a été clonée et séquencée en 1992. Dans le laboratoire ont été récemment clonées et séquencées à partir d’extraits testiculaires plusieurs isoformes de c-cbl  provenant d’épissages alternatifs : les protéines p115 cbl , la p90 cbl  et la p85 cbl . Les animaux invalidés pour c-cbl ont une atteinte de la fertilité. Des travaux récents, dont ceux du laboratoire, suggèrent que c-cbl  puisse être associé au phénomène d’apoptose. En effet, un signal correspondant à p90 et /ou p85 a été détecté dans le thymus de souris après induction d’apoptose. Il a été montré par ailleurs que des formes oncogéniques de c-cbl  sur-exprimées dans certaines lignées cellulaires diminuent l’apoptose induite par déplétion d’interleukine 3 nécessaire à leur survie. Des cultures primaires d’ostéoclastes en absence de facteur G-CSF nécessaire à leur survie présentent un pic d’expression du facteur pro-apoptotique Bim par arrêt de l’ubiquitination-dégradation par c-Cbl. Un modèle in vivo  mis au point dans le laboratoire consiste à induire le processus apoptotique des cellules germinales testiculaires de rats par exposition à des faibles doses au flutamide qui est un composé synthétique non-stéroïdien entrant en compétition avec la testostérone au niveau de son récepteur Sertolien. Ce produit joue ainsi le rôle d’un perturbateur endocrinien qui administré durant l’age adulte induit une apoptose transitoire des cellules postméïotiques alors que si l’exposition se situe durant la vie fœtale celle-ci entraîne leur apoptose chronique. L’étude de l’expression de la p120 cbl et de la p115 cbl  a ainsi été réalisée dans ces modèles par des approches d’hybridation in situ , de RT-PCR et de Western-blotting. L’analyse in situ  a permis d’observer la localisation germinale des protéines de c-cbl  s’exprimant en majorité au niveau des spermatocytes pachytènes, cellules en prophase méïotique, lors des stades VII et VIII androgéno-dépendants du cycle de l’épithélium séminifère. Un accroissement de l’expression des messagers et protéines de c-cbl  a été montré durant la mise en place post-natal des cellules germinales, en particulier lors de l’apparition des spermatocytes (jour 15 à 30 post-natal). L’analyse des messagers a montré une expression de p115 cbl  supérieure à celle de la p120 cbl  pendant cette période. Des expériences d’irradiation testiculaire in vivo à 10 Grays ont confirmé cette localisation. Des expériences de gavage par le flutamide à des doses faibles (10 ou 50 mg/k/j) des animaux adultes (90 jours) montrent que la diminution locale d’activité de la testostérone possède un effet significatif de la régulation négative de l’expression de la p120 cbl  et à un moindre degré de la p115 cbl , dont l’effet est maximal après 3 jours de traitement et qui se poursuit une semaine après arrêt du traitement. L’hypophysectomie chirugicale des rats avec traitements substitutifs par les gonadotrophines est compatible avec la dépendance aux androgènes de l’expression de c-Cbl. Les expériences d’exposition in utero  au flutamide n’ont pas encore apporté de réponse définitive affirmant le lien entre l’expression de c-cbl et l’initiation d’une apoptose chronique.  Mots clés Proto-oncogène c-cbl , p120 cbl , p115 cbl , cellules germinales mâles (spermatocytes pachytènes, spermatides), apoptose, irradiation, flutamide, testostérone, hypophysectomie.  Table des matières      pages  INTRODUCTION 1 A.    Situation Générale 2 B.    Principaux aspects du travail et hypothèses 8 I.          Le testicule 8 1.  Structure et cytologie de la gonade mâle 8   2.    Les cellules germinales et la spermatogenèse 8 3.    Régulation des fonctions gonadiques 9  II.         Les perturbateurs hormonaux 10 1.    Les différents groupes de perturbateurs endocriniens 10 2.    L’anti-androgène flutamide 11 3.    Mécanisme d’action des anti-androgènes bloquant l’action 12  des récepteurs aux androgènes         L’hypophysectomie 13 III.
 
 IV.      Le proto-oncogène c-cbl  16  V.       Résultats obtenus dans le laboratoire 18 1.    Etude de c-cbl  18 2.    Action sur la spermatogenèse des perturbateurs endocriniens 19  VI. Hypothèses de travail 20        ABREVIATIONS UTILISEES        ADN Acide Désoxyribonucléique. ARN Acide Ribonucléique. BET Bromure d'éthidium. CAP Cbl Associated Protein. CARP Cbl-Assciated-Protein-Apoptosis. CSF-1 Colony Stimulating Factor-1. DAB 3,3' Diaminobenzidine. dNTP désoxyribonucléotide triphosphate. DTT dithiotreitol. EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétate. EGF Epidermal Growth Factor. ß FGF Fibroblast Growth Factor. FSH Folliculo-Stimulating Hormone. GNRH Gonadotrophin Releasing Hormone. Grb2 Growth Factor protein Binding 2. KDa KiloDalton. KO Knock-Out. LH Luteinising Hormone. M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus. NLS Nuclear Localisation Signal. PCR Polymerase Chain Reaction. PDGF Platelets Derivated Growth Factor.
PI3 Phosphatidyl-Inositol 3. SDS-PAGE Sodium Dodécyl Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis. SH2 Src Homology 2 SH3 Src Homology 3. TBE Tris Buffer EDTA. TBS Tris Buffer Saline. TGF b  Transforming Growth Factor. Tm melting temperature. TNF a  Tumor Necrosis Factor. Tris Tris (hydroxyméthyl) amino méthane. Tween polyoxyethylene-sorbitan-monolaurate.                                      A. Situation générale   La spermatogenèse possède une double caractéristique, celle d’être supportée par un organe à fonction exocrine engagé dans la production continue d’un grand nombre de spermatozoïdes et également à fonction endocrine, synthétisant en particulier de la testostérone, elle-même soumise à l’influence de facteurs
INTRODUCTION
hypophysaires telles la LH (Luteïnising Hormone) et la FSH (Follicle-Stimuling Hormone).  Les cellules de la lignée germinale se mettent en place de façon séquentielle au cours de l’ontogénie. Elles se développent successivement pendant les phases mitotiques (spermatogonies), méïotiques (spermatocytes) et post-méïotiques (spermatides) et ce développement dure 53 jours chez le rat. Ce processus est très particulier aux cellules germinales, incluant méïose et recombinaisons génétiques après arrêt du cycle des mitoses, expression des gènes haploïdes avec la formation de l’acrosome et du flagelle, remodelage et condensation de la chromatine. Le devenir des cellules germinales est donc sous la dépendance d’un grand nombre de gènes et de leur régulation. L’étude de la régulation des gènes de la spermatogenèse montre que la cellule de Sertoli joue un rôle clé dans ce mécanisme, en contact direct avec des cellules germinales à différents stades de leur développement. Une régulation endocrine, essentiellement réalisée par la FSH et la testostérone, influence également l’expression génétique des cellules germinales par l’intermédiaire des cellules somatiques de Leydig et de Sertoli. La LH active la cellule de Leydig et permet la sécrétion par cette cellule de l’hormone androgène, la testostérone. La testostérone, ainsi que la FSH agissent sur la cellule de Sertoli, laquelle va soutenir les différentes étapes du développement des cellules germinales par un certain nombre de facteurs. Certains de ces facteurs ont été décrits et paraissent impliqués dans cette régulation du développement et le maintien des cellules germinales. Ainsi, les cellules de Sertoli synthétisent et sécrètent des protéines capables de reconnaître les récepteurs de l’IGF-II/M6P (Insulin-like Growth Factor II/). Ces récepteurs se localisent sur les d s sous- ns cellulaires germinales et les cellules de Sertoli sécrètent    différentes glycoprotéines se liant à ces récepteurs. Certains de ces ligands sont connus, tel que le LIF (Leukemia Inhibitory Factor) ou le TGF b (Transforming Growth Factor b ). La cellule de Sertoli produit également du SCF (Stem Cell Factor ligand) dont le récepteur se trouve à la surface des spermatogonies (récepteur kinase c-kit). Il a été montré que l’invalidation du gène du   SCF empêche le développement des cellules germinales. Des souris knock-out (KO) ciblant d’autres gènes ont permis de mettre en évidence des protéines produites par les cellules de Sertoli et jouant un rôle de régulation de la spermatogenèse, tel que le Dhh (Desert Hedgehog) ou le GDNF (Glial cell line-Derived Neurotropic Factor). Inversement, des facteurs secrétés par les cellules germinales elles-mêmes affectent les cellules de Sertoli. Ainsi, les cellules germinales méïotiques et post-méïotiques produisent le b NGF (Nerve Growth Factor), le b FGF (Fibroblast Growth Factor), le TGF b (Transforming Growth Factor) ainsi que l’IL1 (Interferon) et le TNF a (Tumor Necrosis Factor) qui ont pour cible la cellule de Sertoli. Des régulations de l’expression des gènes sertoliens ont également été rapportées. Ainsi, le récepteur de l’EGF (Epidermal Growth Factor) qui se situe à la surface de la cellule de Sertoli et possède pour ligand le TNF a  a son expression régulée par la testostérone et la FSH. La régulation de la transcription de certains gènes a été également décrite : la différenciation des cellules de Sertoli est régulée par la FSH au niveau des
promoteurs des gènes de la transferrine, de c-fos  et du gène CREB (Cyclic adenosine 3’, 5’-monophosphate Response Element-Binding protein). Un travail récent réalisé sur la régulation de l’expression de la transcription du gène homeobox Pem a montré que ce gène avait une transcription régulée par la testostérone au niveau de la cellule de Sertoli durant les stades IV à VIII du cycle de l’épithélium séminifère. Il ressort donc de ces études que les gènes impliqués dans la spermatogenèse sont régulés au niveau local par des produits qui sont eux-mêmes soumis à une régulation hormonale systémique. Il apparaît cependant qu’un modèle dynamique d’activation/ répression in vivo  fait souvent défaut dans ces analyses. Ce modèle pourrait ainsi permettre d’apprécier l’implication de certains gènes dans des voies de signalisation particulière de la spermatogenèse. Dans le laboratoire, un modèle expérimental a été mis au point et utilisé pour permettre l’analyse de certains gènes d’intérêt de la spermatogenèse sous dépendance hormonale. Il consiste à traiter des animaux pendant leur vie fœtale ou à l’âge adulte pendant un temps déterminé par un modèle de perturbateur endocrinien utilisé comme un anti-androgène, le flutamide. Le flutamide et son métabolite actif l’hydroxyflutamide est un anti-testostérone agissant par compétition sur le récepteur de la testostérone. L’intérêt de ce modèle est qu’il reproduit une situation usuellement rencontrée, celle d’un environnement alimentaire dans lequel les perturbateurs hormonaux sont présents (en particulier les pesticides). Ce modèle a permis de montrer sur des animaux ayant subi le traitement durant la période de croissance embryonnaire l’apparition d’une diminution de la fertilité qui s’installe au moment de la puberté de manière irréversible et dont la sévérité dépend de la dose de l’anti-androgène administrée. Par contre, cette diminution de fertilité ou la stérilité obtenue chez des animaux traités à l’âge adulte est transitoire. Il a été montré dans le laboratoire que cet effet sur la fécondité animale était lié à l’apparition d’une apoptose chronique ou au contraire transitoire, en fonction de la période à laquelle le traitement avait été institué ( in utero  ou à l’âge adulte), affectant essentiellement les cellules méïotiques et post-méïotiques. Ces expériences suggèrent que les cellules de Sertoli, qui sont les cibles de la testostérone, mais qui ne subissent pas d’apoptose en l’absence de testostérone, sont les cellules qui vont permettre, sous la dépendance de la testostérone, la survie des populations cellulaires germinales méïotiques et post-méïotiques. Ces cellules sont affectées durablement dans leur fonction de maintien de l’homéostasie germinale par l’absence de testostérone survenant uniquement durant le développement embryonnaire alors qu’elles ne le sont que de façon transitoire et réversible en cas d’absence de l’hormone androgène pendant la vie adulte. L’intérêt de ce modèle est qu’aux doses de flutamide utilisées (inférieures ou égales à 50 mg/kg/j), il n’est pas observé de diminution de la viabilité des cellules germinales mais une augmentation de l’expression de certains gènes impliqués dans l’apoptose (en particulier les caspases 3 et 6). Ainsi ce modèle présente un grand intérêt dans l’analyse des gènes qui pourraient être affectés par les modalités de ce traitement. Dans ce travail, nos efforts ont porté sur le proto-oncogène c-cbl . Les raisons pour lesquelles nous avons porté notre choix sur ce gène est que le laboratoire a montré que les animaux Knock Out pour c-cbl présentent une diminution de leur fertilité et que l’expression de ce gène est majoritaire au niveau thymique et testiculaire. En particulier deux ARNm sont décrits: l’un de 10,5 Kb surtout prédominant dans le thymus, l’autre de 3,5 Kb majoritaire dans le testicule. La protéine cytoplasmique p120 cbl est capable de se lier à de nombreux
acteurs de la cascade enzymatique de la transmission du signal. Il a aussi été montré qu’elle possède un rôle d’ubiquitination de certains récepteurs de facteurs de croissance à tyrosine kinase, permettant ainsi leur dégradation. D’autres fonctions de régulation exercées par ce gène ont été récemment rapportées, en particulier l’organisation de l’activité du cytosquelette, le transport du glucose, la prolifération et la survie des cellules. Elle est en effet largement phosphorylée après de nombreux types d’activation cellulaire et les nombreuses liaisons moléculaires spécifiques laissent supposer qu’elle pourrait jouer un rôle de protéine multi-adaptatrice. Comme nous l’avons vu plus haut en raison de l’hormono-dépendance étroite du développement et du maintien des cellules germinales, la question qui se posait était de savoir si le niveau d’expression du gène de régulation c-cbl était lui-même sous contrôle hormonal. Ainsi, la comparaison des résultats obtenus par traitements des animaux avec l’anti-androgène à l’âge adulte avec ceux obtenus à partir d’un modèle d’hypophysectomie d’animaux (supprimant tout apport hormonal) au même âge a d’abord été réalisé dans ce travail. La quantité de testostérone synthétisée et secrétée par les cellules de Leydig est sous la dépendance de la LH, la cellule de Leydig non stimulée par la LH ayant un très faible taux basal de sécrétion. L’hypophysectomie supprime tout apport de LH et possède donc un effet sur la testostérone qui peut être comparé à celui du traitement par le flutamide. Par ailleurs, l’hypophysectomie supprime également l’apport de FSH qui semble, chez l’animal adulte, avoir un effet sur les dernières étapes du cycle cellulaire affectant les spermatogonies, sur les spermatocytes ainsi que sur le maintien de la viabilité des cellules germinales en association avec la testostérone. Le traitement substitutif des animaux hypophysectomisés par la LH, la FSH ou par les deux hormones administrées en même temps en comparaison avec ceux non traités permet d’observer le niveau d’expression de c-cbl  dans tous ces cas de figure et ainsi d’apporter de nouveaux éléments sur sa régulation. Ainsi, l’hypophysectomie est un modèle in vivo  qui à été très utilisé depuis de nombreuses années et a permis l’observation des effets des hormones gonadotrophiques sur le développement testiculaire et sur le maintien de l’homéostasie de la spermatogenèse. Cependant il ne peut être envisagé ici que comme une expérience d’appoint, car, contrairement au traitement par le flutamide, la viabilité cellulaire ne peut pas être contrôlée. Des expériences d’exposition au flutamide durant la période fœtale (flutamide in utero ) permettant d’analyser l’expression de c-cbl dans le contexte d’une apoptose définitivement acquise, observable lors de la mise en place de l’ensemble des cellules germinales pendant la période pubère, seront réalisées en complément des expériences de traitement au flutamide durant l’âge adulte qui analysent l’expression de c-cbl en relation avec l’apparition d’une apoptose transitoire. Enfin, des expériences sur des testicules irradiés viendront en complément de l’analyse par immunohistochimie dans le but de confirmer la localisation de l’expression du ou des produits de c-cbl dans les différentes populations de cellules germinales. En effet, certaines populations seules de spermatogonies sont radiosensibles et leur élimination entraîne progressivement celle des autres sous-populations de cellules germinales (spermatocytes puis spermatides). L’analyse de l’expression à différents temps après irradiation permet alors de situer l’expression d’un gène dans telle ou telle sous-population cellulaire encore présente. Les techniques que nous avons utilisées sont d’analyser l’expression de c-Cbl en terme de niveau
d’expression des protéines et de leur localisation cellulaire (expériences de Western Blotting et d’Immunohistochimie) et en celui de niveau d’expression des ARN messagers (RT-PCR en coamplification) après traitement des animaux (rats) par l’anti-androgène flutamide (doses inférieures ou égales à 50 mg/ kg/ j). Mais allons maintenant étudier plus en détail les différents aspects qui viennent d’être exposés.                  
 B. Principaux aspects du travail et hypothèses I.               Le testicule  1. Structure et cytologie de la gonade mâle. Le testicule est revêtu d’une capsule fibreuse, l'albuginée qui s'enfonce dans la profondeur du testicule pour constituer le corps de Highmore. Entre les deux se trouvent des cloisons délimitant des lobules testiculaires contenant 1 à 4 tubes séminifères. Le testicule est constitué de 2 compartiments : ·     Le compartiment tubulaire comportant l'ensemble des tubes séminifères qui assurent la spermatogenèse.    Les tubes séminifères sont délimités à l'extérieur par l'association de cellules myoïdes (péritubulaires) contractiles et de fibres de collagène. Ils contiennent les cellules de la lignée germinale (spermatogonies, spermatocytes, spermatides) ainsi que des cellules somatiques : les cellules de Sertoli. Ces 2 types de cellules (germinales et somatiques) constituent l'épithélium séminal. ·        Le compartiment interstitiel comportant plusieurs types de cellules dont les cellules de Leydig qui assurent la fonction endocrine du testicule (stéroïdogenèse). Il comporte un tissu conjonctif riche en macrophages, en vaisseaux sanguins et lymphatiques (Dadoune et Demoulin, 1991).
 2. Les cellules germinales et la spermatogenèse. La spermatogenèse a lieu au niveau des tubes séminifères. Elle permet la synthèse des spermatozoïdes. Trois classes de cellules germinales sont impliquées dans la spermatogenèse: les spermatogonies, les spermatocytes (cellules méÏotiques), et les spermatides (cellules post-méÏotiques). Le développement des cellules germinales mâles commence à partir des cellules non différenciées: les spermatogonies. Chez l'homme plusieurs types de spermatogonies ont été mis en évidence: les spermatogonies A sombres (A dark), les A pâles (A pale) et les spermatogonies B. D'abord, les spermatogonies non différenciées prolifèrent et donnent des spermatogonies différenciées (spermatogonie B) ainsi qu'une nouvelle génération de spermatogonies non différenciées (A). Puis les spermatogonies différenciées (B) donnent des spermatocytes. À ce stade, il y arrêt de la prolifération. Les spermatocytes primaires I subissent alors une différenciation méïotique (prophase méïotique) avec doublement du matériel génétique qui donneront ensuite des cellules post-méïotiques ou spermatides (haploïdes). Cinq stades successifs se présentent lors de la prophase méiotique (spermatocytes) : spermatocytes leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, et diacinèse. Après les deux divisions méiotiques permettant d'isoler des cellules possédant n chromosomes autosomaux et un chromosome sexuel, les spermatocytes donnent naissance aux spermatides qui vont subir un phénomène de différenciation important (spermiogenèse). Ils acquièrent un flagelle et forment l'acrosome à partir de l'appareil de Golgi.  Les spermatides vont ainsi se transformer en spermatozoïdes matures  (Dadoune et Demoulin, 2001).  3. Régulation desfonctions gonadiques. Les deux fonctions testiculaires, spermatogenèse et stéroïdogenèse dépendent de la stimulation par les gonadotrophines hypophysaires la FSH et la LH dont la sécrétion est stimulée localement par le GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone). La testostérone qui est essentielle pour l'initiation et la maintenance de la spermatogenèse est secrétée par les cellules de Leydig dont le niveau basal de sécrétion est amplifié par la LH. La testostérone agit via des récepteurs nucléaires androgènes situés dans les cellules de Sertoli, et également dans les cellules de Leydig et les cellules peritubulaires. Il a été montré que la testostérone est nécessaire au maintien de l'homéostasie de la spermatogenèse. La FSH contrairement à la LH, agit directement via des récepteurs couplés aux protéines G situés sur les cellules de Sertoli. La FSH joue un rôle important dans le développement des testicules immatures particulièrement en contrôlant la prolifération des cellules de Sertoli, mais aussi en permettant en synergie avec la LH de maintenir un niveau normal de synthèse de spermatozoïdes (McLachan R.I. et al, 2002). Une boucle de rétro-contrôle existe entre les gonades et l'axe hypothalamo-hypophysaire. Ainsi les stéroïdes (testostérone, oestradiol), l'inhibine et la follistatine (peptides secrétés par les cellules somatiques du testicule) diminuent la sécrétion de LH et de GnRH, alors que l'activine l'augmente. À ce contrôle neuro-endocrinien s'ajoute un système de contrôle local qui fait intervenir de nombreux facteurs que nous avons évoqués plus haut (Dadoune et Demoulin, 2001).  
 II.             Les perturbateurs hormonaux  1. Les différentsgroupes de perturbateurs endocriniens Un perturbateur endocrinien est une substance chimique ou naturelle qui a une structure proche des hormones endogènes. Ces substances peuvent entrer en compétition avec les hormones endogènes au niveau de ses récepteurs et par la suite induire une perturbation du système endocrinien (Sharpe et al; 1998). Quatre classes de perturbateurs endocriniens ont été décrites. Il s'agit des substances ayant une action oestrogènique, antioestrogènique, antiprogestative ou antiandrogénique. Ces substances sont présentes dans l'environnement sous forme de pesticides, herbicides, certains insecticides et fongicides, d'où l'importance qui leur est actuellement accordée (Cheek et Mclachan, 1998).  L’exposition durant la vie fœtale à certains composés chimiques de l’environnement (comme par exemple les xenohormones, la dioxine, les éthers de glycols) induit un très large spectre d’anomalies testiculaires externes et une infertilité (Cheek et al, 1998, Massaad et al 2002). Il a été montré que ces produits interfèrent avec le développement et la fonction des gonades mâles (Colborn et al, 1993) et que ces effets étaient dus à une inhibition des récepteurs des hormones androgènes durant la vie fœtale (Jost et al, 1973; Gray et al, 1994; Sharpe et al, 1998). Ceci avait été établi avec l’administration expérimentale d’anti-androgènes environnementaux tels que le fongicide vinclozolin (Gray et al, 1994) ou bien plus tard avec des pesticides anti-androgéniques tel que le procymidone, le linuron, l’iprodione, le chlozolinate, le pp’-DDE et le ketoconazole (Gray et al, 1999). L’exposition in  utero  à ces composés anti-androgéniques est à l’origine de nombreuses malformations testiculaires telles que la formation de petits testicules, une cryptorchidie et des anomalies morphologiques sexuelles secondaires (Sharpe et al, 1998; Kelce et Wilson, 1998; Jost et al, 1973; Gray et al, 1999).               2. L’anti-androgène flutamide Le flutamide (4’-nitro-trifluorométhyl-isobutyranilide), drogue largement utilisée dans le traitement des cancers hormono-dépendants de la prostate, et son métabolite actif l’hydroxyflutamide sont des produits non stéroïdiens capables d’inhiber l’action de la testostérone au niveau de son récepteur cellulaire (Dorfman, 1970). Le traitement de rates gestantes par le flutamide provoque des altérations des caractères sexuels secondaires tels que des anomalies de distance ano-génitale ou une rétention des mamelons, une cryptorchidie et des anomalies du développement testiculaire des animaux mâles de la portée. Le modèle d'exposition in utero au flutamide a été utilisé pour déterminer les effets de l'absence ou de la diminution de la testostérone au niveau du développement des cellules germinales. Les effets de cette exposition in utero  se traduisent, en ce qui concerne les anomalies testiculaires, chez l’animal adulte, par une diminution du poids des testicules et une réduction de la moyenne du diamètre des tubes séminifères associées à une hypospermatogenèse plus ou moins sévère et à une diminution ou un arrêt de la maturation cellulaire germinale (Peets et al, 1974; Imperato-McGinley et al, 1992; Kelce et Wilson, 1998; Kassim et al 1997; McIntyre et al,2001).
Les altérations de ce type dans les testicules adultes dépendent de la dose de flutamide reçue pendant la vie fœtale selon des protocoles mis au point dans le laboratoire. Des études réalisées récemment montrent que cet arrêt de la maturation cellulaire germinale se situe au niveau des spermatides (Ommezine et al, 2003). Ainsi une décroissance significative du poids testiculaire, résultant d’une perte des cellules germinales a été observée au-delà de la dose de 50 mg par kilogramme et par jour de flutamide ingéré par la femelle en cours de gestation. Des lésions histologiques caractérisées par un rétrécissement modéré variable des tubes séminifères dues à une diminution du nombre des cellules germinales sont visibles (McIntyre et al, 2001). En dessous de cette dose, le poids des testicules n’est pas significativement altéré et les lésions histologiques pratiquement inexistantes. Il est important de noter que l'absence de testostérone durant la vie fœtale induit un arrêt irréversible de la spermatogenèse. Par contre, l'administration de flutamide à l'âge adulte entraîne les mêmes anomalies mais dans ce cas elles sont réversibles après arrêt de l'administration de flutamide.   3. Mécanisme d’action des anti-androgènes bloquant l’action des récepteurs aux androgènes. Les principaux ligands endogènes des récepteurs aux androgènes sont la testostérone et son métabolite la DHT (5-dihydrotestostérone). La DHT est le produit de l’action de la 5 a -réductase microsomale sur la testostérone. La DHT est plus active dans certains tissus androgéno-dépendant comme la prostate. L’interaction des androgènes avec leur récepteur induit un changement de conformation de ce dernier, nécessaire à sa stabilisation contre la dégradation protéolytique, à sa dimérisation et à son activation transcriptionnelle. L’interaction avec un anti-androgène comme par exemple l’hydroxyflutamide, induit une conformation différente du récepteur entraînant sa déstabilisation; ainsi l’anti-androgène inhibe la transcription en empêchant l’androgène de se fixer au récepteur.   III.           L’hypophysectomie  Des expériences d’hypophysectomie réalisées depuis de nombreuses années ont permis de cerner le rôle des hormones gonadotrophines (FSH, LH) dans le développement testiculaire et particulièrement sur les différentes étapes de la spermatogenèse. L’hypophysectomie permet de réduire à des valeurs sériques nulles la concentration de FSH. La LH n’est également plus produite, entraînant l’effondrement de la concentration de la testostérone testiculaire interstitielle à des valeurs réduites de près de 90% (Ganguly et al, 1994). Toutes les études faites avec ce modèle ont porté, pour ce qui nous intéresse, sur l’analyse du poids des testicules, la production journalière de sperme (DSP), le volume et/ ou le diamètre des tubes séminifères, le taux des cellules en voie de dégénérescence ou en apoptose de différentes populations de cellules germinales et de ces mêmes populations en fonction de leur cycle mitotique ou méïotique. Certaines études ont porté sur le taux
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