Sujet du mémoire : Impact des contraintes mécaniques sur l'expression de gènes associés à la dédifférenciation et à la migration des cellules musculaires lisses vasculaires

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Christelle MONSEMPES Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Sujet du mémoire : Impact des contraintes mécaniques sur l'expression de gènes associés à la dédifférenciation et à la migration des cellules musculaires lisses vasculaires Soutenu le : 17 janvier 2007 devant le jury suivant : B. Mignotte C. Terzian M. Glorian C. Piesse O. Agbulut Laboratoire EPHE : Interactions cellulaires, retrovirus et cancer Directeur : Geneviève Cordier Université Claude Bernard 50 avenue Tony Garnier 69007 Lyon Laboratoires d'accueil : Physiologie et physiopathologie UMR 7079 Directeur : Michel Raymondjean Université Pierre et Marie Curie 7 quai St Bernard 75005 Paris Institut Fédératif de recherche IFR 83 Directeur : François Couraud Université Pierre et Marie Curie 7 quai St Bernard 75005 Paris ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Impact des contraintes mécaniques sur l'expression de gènes associés à la dédifférenciation et à la migration des cellules musculaires lisses vasculaires EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : lundi 1 janvier 2007
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE  Présenté par  Christelle MONSEMPES  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   Sujet du mémoire :   Impact des contraintes mécaniques sur l’expression de gènes associés à la dédifférenciation et à la migration des cellules musculaires lisses vasculaires     Soutenu le : 17 janvier 2007 devant le jury suivant : B. Mignotte  C. Terzian                                                                                                             M. Glorian  C. Piesse  O. gbulut A      Laboratoire EPHE : Interactions cellulaires, retrovirus et cancer Directeur : Geneviève Cordier  Université Claude Bernard  50 avenue Tony Garnier 69007 Lyon                                    Christophe.Terzian@univ-lyon1.fr  Laboratoires d’accueil : Physiologie et physiopathologie UMR 7079 Directeur : Michel Raymondjean  Université Pierre et Marie Curie  7 quai St Bernard 75005 Paris                                    Martine.Glorian@snv.jussieu.fr   Institut Fédératif de recherche IFR 83 Directeur : François Couraud  Université Pierre et Marie Curie  7 quai St Bernard 75005 Paris                                    piesse@ccr.jussieu.fr   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE   Impact des contraintes mécaniques sur l’expression de gènes associés à la dédifférenciation et à la migration des cellules musculaires lisses vasculaires
  Monsempès Christelle   Date de soutenance   RESUME   L’hypertension artérielle est reconnue comme un des principaux facteurs de risque de l’athérosclérose, maladie complexe qui peut conduire à des accidents ischémiques aigus tels que l’infarctus du myocarde e l’accident vasculaire cérébral. L’hypertension joue, en particulier, un rôle important dans la transition phénotypique des cellules musculaires lisses de la média des artères qui acquièrent la capacité de proliférer, de migrer vers l’intima et de sécréter des facteurs pro-inflammatoires et une matrice extracellulair constituant la chape fibreuse de la plaque d’athérome. Pour nous permettre d’expliquer les mécanismes sous-jacent de ces transformations phénotypiques, nous avons mis au point un modèle original d’étirement de cellules musculaires lisses d’aorte de rat qui permet de mimer les contraintes mécaniques imposées à ces cellules en cas d’hypertension artérielle. Pour mettre au point ce modèle nous avons comparé l’expression phénotypique des cellules musculaires lisses étirées par rapport aux cellules musculaires lisses de rats spontanément hypertendus. Puis, nous avons étudié l’expression, en réponse à l’étirement, de certains gènes impliqués dans la migration cellulaire (MMP, TIMP et intégrines), un des grands aspects de l’athérosclérose. Nos résultats précisent certains mécanismes moléculaires par lesquels les contraintes mécaniques liées à l’HTA favoriseraient le processus athérogénique.  Mots clés  : Athérosclérose, hypertension artérielle ; contraintes mécaniques, cellules musculaires lisses phénotype, migration cellulaire, PCR en temps réel, MMP, intégrines.    GLOSSAIRE  2 QUELQUES DEFINITIONS  3 1.      INTRODUCTION  5 I.       Lathérosclérose  5 A.      La paroi vasculaire  5 B.      Histoire naturelle des lésions athéromateuses  6 C.      Mécanismes impliqués dans la formation et la progression des plaques  8 D.      Les facteurs de risques de l’athérosclérose  10 II.     L’hypertension artérielle  13 A.      Généralité  13 B.      Le modèle de rat spontanément hypertendu  13 C.      Contraintes mécaniques  14 III.        Les cellules musculaires lisses vasculaires  15 A.      Caractéristiques du phénotype contractile  16 B.      Les modifications liées à la dédifférenciation  17 C.      Le rôle de la cellule musculaire lisse au sein de la plaque athéroscléreuse  19 2.      MATERIELS ET METHODES  23 A.      Isolement et culture des cellules musculaires lisses (CML)  23 B.      Etirement  24 C.      Extraction des ARN totaux  24 D.      Analyse des ARN par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)  25 E.      Immunocytochimie  26 F.      Détection de protéines secrétées  27 3.      RESULTATS  28
TABLE DES MATIERES
A.      Objectifs  28 B.      Stratégies  28 C.      Mise au point d’un modèle expérimental  30 D.      Etude du phénotype dédifférencié et migratoire  34 4.      CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES  38 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES  43 ANNEXES : PLATEAUX TECHNIQUES  47 1.      Contexte du travail  47 2.      Plate-forme de PCR en temps réel  48 I.       Généralité sur la PCR  48 II.     Présentation du service  51 III.        Fréquentation de la plate-forme en 2005 et 2006  52 IV.        Aspect financier  52 V.      Perspective  53 3.      Plate-forme d’ingéniérie des protéines et synthèse peptidique  54 I.       Présentation du service  54 II.     Synthèse de peptide  55 III.        Purification de peptide  56 IV.        Sequençage d’Edman  56 V.      Perspectives  57  GLOSSAIRE    ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire AP : Activator Protein        ARN : Acide RiboNucléique ARNm : Acide RiboNucléique messager bFGF : Basic Fibroblast Growth Factor CML : Cellule Musculaire Lisse CMLv : Cellule Musculaire Lisse vasculaire EDHF : Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor Egr : Early growth response FRCV : Facteur de Risque CardioVasculaire HDL : High Density Lipoprotein HTA : HyperTension Artérielle LDL : Low Density Lipoprotein LEE : Limitante Elastique Interne MEC : atrice Extra Cellulaire M MMP : MetalloProtéinase Matricielle NF-kappa B : Nuclear Factor-kappa B PAI1 :  Plasminogen Activator Inhibitor 1 PCR : Polymerase Chain Reaction  PDGF : Plateled-Derivated Growth Factor QPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction RT : Reverse Transcription SHR : Spontaneously Hypertensive Rat  SM-MHC :      Smooth Muscle Myosin Heavy Chains TGF-Β 1 : Transforming Growth Factor-beta 1 TIMP : Tissue Inhibitors of Metalloproteinases
tPA : Tissue Plasminogen Activator uPA : Urokinase-like Plasminogen Activator WKY : Wistar KYoto  0.          INTRODUCTION  I. L’athérosclérose      Les complications cardiovasculaires ischémiques constituent la première cause de mortalité dans les pays développés. Elles sont le plus souvent la conséquence de l’athérosclérose, processus insidieux qui est défin par l’organisation mondiale de la santé, en 1957, comme « une association variable de remaniements d l’intima des artères de grand et moyen calibre, consistant en une accumulation segmentaire de lipides, de glucides complexes, de sang et de produits sanguins, de tissu fibreux et de dépôt calciques, le tout accompagné de modifications de la média ». L’athérosclérose peut aboutir à des lésions qui vont obstruer la lumière des vaisseaux directement ou via des complications thrombiques. Cette obstruction peut provoquer des accidents vasculaires aigus et mortels (infarctus du myocarde et cérébraux). (Ross, 1999)                                            0.           La paroi vasculaire  La paroi vasculaire saine est constituée de trois couches qui sont, de l’intérieur vers l’extérieur du vaisseau l’intima, la media et l’adventice.  1. L’intima L’intima est la couche la plus interne. Elle est composée de l’endothélium formé par une monocouche de cellules endothéliales directement en contact avec le sang, et d’un tissu conjonctif fibro-élastique sous-jacent. Dans les gros vaisseaux, l’intima peut-être séparée de la média par une lame de fibres élastiques : la limitante élastique interne.            2. La média La média est la couche la plus épaisse. Elle est constituée de cellules musculaires lisses vasculaires (CMLv) disposées perpendiculairement à l’axe du vaisseau. Ces cellules sont entourées d’une matrice extracellulair constituée de collagène, d’élastine et de mucopolysaccharides. La média est très développée dans les grosses artères (jusqu’à 30 couches de CMLv), tandis qu’elle est indistincte dans les veines et les capillaires. Dans les gros vaisseaux, la média peut-être séparée de l’adventice par une lame de fibres élastiques : la limitant élastique externe.  3. L’adventice L’adventice est la couche la plus externe. Elle est composée d’un tissu conjonctif peu organisé formé d fibres élastiques et de collagène, et irrigué par des vaisseaux dans les grosses artères appelés Vasa Vasorum . Des nerfs du système nerveux autonome sont également présents dans l’adventice, ils innervent les CMLv de
la média.                                            0.           Histoire naturelle des lésions athéromateuses  
1. La strie lipidique Les lésions les plus précoces sont des dépôts lipidiques constitués de macrophages et de lymphocytes T infiltrés au sein de l’intima. Ces lésions jaunâtres, à peine surélevées, sont retrouvées au niveau des coronaires chez 5O % des enfants autopsiés pour des décès accidentels. Un régime athérogène expérimental riche en lipides saturés déclenche chez l’animal l’apparition de stries lipidiques dès les deux premiers mois essentiellement au niveau des zones où le flux sanguin est tourbillonnaire correspondant à leurs sites de prédilection. On décrit un stade intermédiaire avant la plaque fibreuse qui correspond à la plaque gélatiniforme. De dimension plus importante, centimétrique, elle commence à s’organiser et contient des mucopolysaccharides.  
2. La plaque fibreuse C’est la lésion élémentaire la plus classique. Elle est recouverte par une chape fibreuse constituée de tissu conjonctif et de CML. Au centre de la lésion se situe un noyau nécrotique mou et hétérogène constitué de cholestérol libre et estérifié, des macrophages et des CML, des lymphocytes T qui peuvent être activés, des cellules spumeuses (CML et macrophages gorgés de cholestérol). Des cellules géantes plurinuclées et de plasmocytes peuvent aussi être présents. Secondairement des dépôts de calcium et de fibrine sont observés. Le développement de la plaque affecte essentiellement l’intima. Il existe néanmoins un retentissement sur la média. Il existe fréquemment un infiltrat inflammatoire adventiciel en regard des plaques. Leur expansion s’accompagne d’une destruction des fibres élastiques de la zone interne de la média et de la limitante élastique interne. Les plaques évoluent lentement, de façon relativement synchrone et induisent une sténose qui deviendra significative au plan hémodynamique seulement lorsqu’elle dépassera 70 % du calibre artériel. Certaines plaques ont une évolution discontinue et asynchrone en progressant brutalement.  
3. La plaque compliquée C’est la rupture des plaques qui précipite la survenue des complications ischémiques car elle met en contact le sang avec des éléments thrombogènes du coeur lipidique. Elle survient sur des plaques riches en lipides dans la zone de raccordement entre la chape fibreuse et la paroi saine. En effet, c’est dans cet angle aigu que les contraintes de cisaillement sont maximales et la présence de macrophages  surchargés en lipides constitue une zone de fragilité mécanique. La rupture de plaque peut être secondaire à des causes extrinsèques comme une poussée d’hypertension artérielle, mais elle résulte essentiellement de causes intrinsèques, appelées vulnérabilité de la plaque. Les deux facteurs principaux de cette vulnérabilité sont l’importance du cœur lipidique (taux de LDL-cholestérol) et l’inflammation au niveau de la chape fibreuse. Celle-ci est, en effet, fragilisée notamment par l’agression des macrophages (inflammation, sécrétion de métalloprotéases).  La thrombose artérielle est un phénomène inconstant mais fréquent après la rupture d’une plaqu
d’athérosclérose. Cette thrombose est d’abord plaquettaire, puis fibrino-cruorique (dépôt de fibrine dans u caillot sanguin). Les conséquences cliniques sont graves : au niveau coronaire elles sont regroupées dans l terme « syndromes coronariens aigus », en cas de thrombose complète, il s’agit de l’infarctus du myocarde. Différents facteurs peuvent favoriser la thrombose après rupture d’une plaque fracturée. On distingue d’un part les anomalies plaquettaires ou des systèmes de régulation qui sont souvent d’origine génétique et d’autre part la libération par la plaque de facteurs pro-coagulants comme les acides gras ou les facteurs tissulaires. Par ailleurs, on remarque que ces ruptures de plaque et thrombose peuvent se produire aussi bien sur des plaques « jeunes », c'est-à-dire peu sténosantes que sur des plaques anciennes. Plus de la moitié des accidents coronariens surviennent à partir de sténoses modérés (<50%). La constitution de cycles itératifs fissuration-thrombus-réparation fibreuse peut constituer un mode de progression accéléré de certaines plaques. Par contre, un traitement hypocholestérolémiant conduisant à une diminution importante du LDL-cholestérol peut induire une stabilisation des plaques en appauvrissant le noyau en cholestérol et ainsi en réduisant le réactions inflammatoires et la plasticité de la plaque, le processus de fibrose achevant de cicatriser la zone instable.                                             0.      Mécanismes impliqués dans la formation et la progression des plaques  Le processus aboutissant à la constitution de lésions évoluées et instables est lent, s’étalant sur plusieur décennies. Néanmoins dans des situations pathologiques particulières telles que les hypercholestérolémies familiales, les néphropathies, ou le diabète, il peut être beaucoup plus rapide et s’étendre seulement sur quelques années.  1. Mécanisme général De nombreuses théories ont successivement prévalu depuis les descriptions initiales. La théorie actuell consiste à considérer que l’athérosclérose correspond à une réaction de défense inflammatoire mal appropriée à une agression de l’intima. Certaines des cellules impliquées lors de cette réaction inflammatoire son alimentées en cholestérol du fait de la coexistence d’une hyperlipoprotéinémie et de modifications subtiles de la composition des lipoprotéines, ces deux points étant étroitement déterminés par l’environneme nutritionnel.  La première étape de l’athérosclérose est la pénétration passive et l’accumulation des LDL-cholestérol dans l’intima. Ce phénomène est directement en relation avec la quantité de LDL-cholestérol plasmatique. Cett infiltration est suivie d’une modification oxydative des LDL par différents mécanismes, notamment enzymatiques. La présence de ces LDL-oxydés va favoriser l’adhésion des monocytes circulants aux protéines d’adhésio sur-exprimées par les cellules endothéliales. Ces monocytes vont alors pénétrer dans l’espace sou endothélial et se transformer en macrophage sous l’influence de chémo-attractants libérés par les macrophages et les cellules endothéliales. Cette dysfonction de l’endothélium qui correspond à une altération de la production d’oxyde nitrique (NO), facteur vasorelaxant, est provoquée par de nombreux facteurs don l’hypercholestérolémie et l’hypertension artérielle. Secondairement, des macrophages en accumulant du cholestérol se transforment en cellules spumeuses. Les
récepteurs « éboueurs » (Scavenger receptor) impliqués dans cette endocytose ne sont pas auto régulés par la teneur intra-cellulaire en cholestérol. Les LDL se peroxydent dans le micro environnement des CML. Leu propension à se peroxyder dépend des défenses anti-oxydantes en présence. Les LDL oxydées ont des propriétés cytotoxiques, elles induisent également la production de facteurs chimio-attractants et mitogènes qui vont provoquer un appel de CML à partir de la média vers l’intima et ainsi une réponse fibro-proliférative. Les CML produisent alors in situ  les protéines de la matrice extra cellulaire : protéoglycanes, fibre élastiques, collagène. D’autres monocytes-macrophages seront également recrutés, les CML sous l’action de facteurs de croissance vont proliférer et la réaction inflammatoire s’auto-amplifiera. La plaque mature se compose d’un centre athéromateux (lipides extra et intracellulaire) isolé de la lumièr artérielle par une chape fibreuse (CML, collagène, matrice extra-cellulaire).  La réponse inflammatoire fibro-proliférative s’inscrit dans le cadre général des processus de cicatrisation Cependant, face au processus d’agression chronique (hypercholestérolémie, tabagisme, hyperhomocystéinémie), la réponse inflammatoire est persistante et devient à terme délétère. Les cytokines libérées au sein de la plaque jouent un rôle important dans la coordination des évènements. Des modèles de souris transgéniques qui développent de l’athérome du fait d’une dyslipidémie sévère induite par l’invalidation du gène de l’Apo E ont permis de montrer, par transgénèse des différentes cytokines, que la balance entre la production de cytokines pro (TNF α , IL-2) et anti-inflammatoires (IL-6) jouait un rôle important dans le déterminisme des lésions. Le dosage sensible des concentrations plasmatiques en protéine dont l’expression est augmentée lors de syndrome inflammatoire tels que la C réactive protéine (hsCRP) et la protéine sérum amyloïde A (SAA) montre un triplement du niveau de risque vasculaire entre les sujet appartenant au quartile le plus bas et le plus élevé. Par ailleurs, la libération d’élastases et de métalloprotéases par les macrophages joue un rôle essentiel dans le déterminisme de l’instabilité des plaques en affaiblissant leur structure.  
2. Des mécanismes non univoques L’athérogénèse est un processus multifactoriel. Conjointement avec les facteurs lipidiques, d’autres processus interviennent pour déclencher ou entretenir la réaction inflammatoire pariétale. Différentes théories s’affrontent sans s’exclure obligatoirement. Le rôle de l’infection dans l’induction des lésions est suspecté devant l’identification de chlamydiae au sein des plaques, et la mise en évidence d’associations entr complications ischémiques et sérologie. Il existe un faisceau d’arguments mettant en cause cytomégalovirus, chlamydia pneumoniae  et herpesvirus. Une théorie tumorale a également été défendue. Les processus de prolifération des CML correspondent à des modifications de la régulation du cycle cellulaire qui s’apparentent à ce qui est observé lors de la tumorigénèse. L’intervention par thérapie génique sur les oncogènes impliqués est un axe de recherche prometteur dans le domaine du traitement de l’athérosclérose.                                             0.           Les facteurs de risques de l’athérosclérose  On appelle risque, la probabilité d'apparition d'un événement défavorable et facteur de risque ce qui augment
le niveau de ce risque. La notion de facteur de risque en termes épidémiologiques est apparue en 1961 avec l'étude de Framingham (Kannel et al ., 1961) qui a principalement étudié le retentissement des taux de cholestérol, de l'hypertension et du tabagisme sur une population donnée. Plusieurs facteurs de risque de l’athérosclérose ont été identifiés.
1. Facteurs non modifiables - Age L’age constitue un des facteurs de risque cardio-vasculaire (FRCV) les plus important. Il est, en effet, indéniable que la dégénérescence naturelle de la paroi artérielle a un impact direct, indépendamment de autres FRCV, sur la survenue des accidents cardiovasculaires. - Sexe En France 70 à 80% des patients hospitalisés pour infarctus du myocarde sont des hommes. -Antécédents familiaux et personnels         Les sujets ayant des antécédents familiaux de maladies coronaires prématurée (avant l’âge de 55 ans) ont un risque d’infarctus de deux à cinq fois plus important que ceux qui n’ont pas de tels antécédents.
2. Facteurs modifiables - Cholestérol sanguin Le lien entre le taux sanguin de cholestérol total et surtout de LDL-cholestérol et l’incidence de la maladi coronaire est l’un des plus fort, des plus constants et des plus précocement établi. Il s’agit d’une relation de type linéaire. A chaque accroissement de 1% du taux de LDL-cholestérol correspond une augmentation de 2 à 3 % du risque d’accident coronarien. Un taux bas de HDL (High density lipoprotein) entraîne un excès de risque alors qu’un taux élevé est un facteur protecteur. - Hypertension artérielle (HTA) Comme l’hypercholestérolémie, l’HTA est l’un des FRCV les mieux étudié et la relation entre le nivea tensionnel et la mortalité cardiovasculaire est quasi superposable à celle observée avec l’hypercholestérolémie. Ainsi la mortalité cardiovasculaire est multipliée par trois lorsque la pressio systolique est supérieure à 160 mm Hg. L’élévation de la pression diastolique est également corrélée au risque cardiovasculaire (surtout d’infarctus du myocarde et d’accident vasculaire cérébral). Plus récemment, il a été établi un lien entre la pression pulsée, qui représente la différence entre la systolique et la diastolique, et le risque cardiovasculaire. La pression pulsée est le reflet de la rigidité artérielle. Dans les artères rigides, l’augmentation de la pression concerne d’avantage la systolique (car l’onde de la pression est moins amortie par la paroi) ce qui entraîne une augmentation de la différentielle donc de la pression pulsée. La pression pulsée apparaît comme un facteur particulièrement discriminant chez les sujets agés ou d’âge moyen. L’effet bénéfique de l’abaissement des chiffres tensionnel par le traitement est indiscutable quel que soit l’âge. Il est plus marqué concernant le risque d’accident vasculaire cérébral (baisse de 40% en moyenne) que d’infarctus du myocarde (abaissé d’environ 16%).  
 - Tabagisme Le rôle néfaste de la consommation de tabac sur l’incidence des complications cardiovasculaires est également bien établi. Le risque relatif de survenue d’incidents majeurs est proportionnel au nombre de cigarettes consommées et atteint plus de cinq pour les très gros fumeurs (plus d’un paquet par jour). Le tabac semble agir principalement comme un facteur thrombogène. L’arrêt du tabagisme s’accompagne d’un diminution précoce du risque vasculaire qui rejoint au bout de quelques années celui du non-fumeur. - Diabète Qu’il s’agisse d’un type 1 ou 2, le diabète est un FRCV majeur. Le sujet diabétique est en effet deux à trois fois plus exposé que le non-diabétique aux complications cardiovasculaires. L’hétérogénéité de la maladie, sa sévérité, et sa fréquente association à d’autre FRCV (HTA, dyslépidémie, obésité) expliquent la difficulté de l’étude de sa relation directe avec l’athérosclérose. Aucune étude d’envergure n’a à ce jour étudié de faço spécifique le rôle du contrôle glycémique sur l’athérosclérose, mais il existe des arguments en faveur d bénéfice potentiel d’une prise en charge combinée de l’hyperglycémie et des anomalies qui s’y associent.
3. Autres facteurs ou marqueurs de risque L’obésité, la sédentarité, la consommation d’alcool, le stress, l’hypertriglycéridémie, l’élévation de la lipoprotéine(a) ou de l’homocystéinémie entre autre sont également souvent mentionné mais ces paramètres ne peuvent pour l’heure être considéré comme des FRCV majeurs, soit parce que ce lien est inconstant dans la littérature, soit parce que la force de l’association est modérée, soit encore parce qu’il n’existe pas d certitude quand à leur caractère indépendant d’autre FRCV.        II. L’hypertension artérielle                                            0.           Généralité  L’hypertension artérielle (HTA) est un problème majeur de santé publique puisqu’elle touche environ millions de Français, soit 10 à 15% de la population. C’est un des motifs les plus fréquents de consultation en médecine générale et en cardiologie. Elle est définie par une pression systolique supérieur à 130mmHg qui reflète la contraction du ventricule gauche et une pression diastolique supérieur à 85mmHg représentant la pression lors du repos du ventricule. Comme nous l’avons vu, l’HTA constitue l’un des principaux facteurs de risques cardiovasculaire. Les effets de la pression artérielle sur la paroi vasculaire sont complexes. L’augmentation des forces de cisaillement favorise l’adhésion des monocytes à l’endothélium. L’angiotensine II, octapeptide hypertenseur, agit en provoquant une vasoconstriction des cellules musculaires lisses vasculaires et favorise la réponse
inflammatoire dans la paroi artérielle par l’activation de la voie de NF-kapaB (Hernandez-Presa M et al ., 1997). L’hypertension favorise également la production de la matrice extracellulaire et induit le processus inflammatoire essentiellement par la formation de peroxyde d’hydrogène et de radicaux libres. C’est une maladie polygénique mais des facteurs environnementaux interviennent également : la consommation excessive d’alcool, le surpoids, la consommation excessive de sel, le stress et des facteur socioprofessionnels.                                            0.           Le modèle de rat spontanément hypertendu
1. Origine Le rat spontanément hypertendu (SHR) représente un modèle bien accepté de l’hypertension artérielle, et été utilisé à maintes reprises par de nombreux laboratoires afin de caractériser certains aspects de cett pathologie chez l’homme. Le SHR développe une HTA qui évolue graduellement avec l’âge et qui es d’origine génétique. Cette souche de rat a été développée à l’Université de Kyoto à partir de rat issus de la souche Wistar. Okamoto et Aoki ont isolé certains rats qui développaient spontanément de l’hypertensio artérielle ainsi que leurs contrôles normotendus appelé le rat Wistar-Kyoto (WKY) (Okamoto et al ., 1963). Ces deux souches sont fréquemment utilisées pour l’étude de l’HTA et de toutes les pathologies qui s’y rattachent. Le SHR est aussi reconnu comme étant un modèle de résistance à l’insuline, de dysfonction endothéliale et de stress oxydatif (Pître et al . 1996 ; Chamiot-Clerc et al . 2001 ; Nakazono et al . 1991).  
2. Les cellules musculaires lisses des rats SHR De nombreuses études ont été réalisées sur les cellules musculaires lisses (CML) issues d’aortes de rats SHR, et ont souvent porté sur l’angiotensine. L’équipe de Fukada et Hu (1999, 2002) ont réalisé un travail original sur le changement phénotypique des CML, ils ont en particulier montré que les rats SHR présentaient une croissance accélérée des CML vasculaire associé à un phénotype sécrétoire. Grâce à des expériences de microarrays, ces chercheurs ont pu étudier la différence d’expression génique et protéique entre les CML des SHR et les CML des WKY. Ils montrent que l’expression de l’alpha-actine, protéine contractile du cytosquelette est diminuée, alors que les facteurs de croissance Transforming Growth Factor-beta 1 (TGF β -1), plateled-derivated growth factor A-chain (PDGF) et basic fibroblast growth factor (bFGF) ont leur niveau d’expression génique augmenté chez les SHR. L’ostéopontine, protéine multifonctionnelle sécrétée, jouan entre autre un rôle dans l’adhésion des CML et marqueur du phénotype sécrétoire a un niveau d’expressio plus important chez les SHR par rapport au WKY. Ces résultats nous permettent de déduire que les CML lors d’HTA présentes un phénotype dédifférencié. Cette donnée nous servira de support physiologique pour notre étude.                                            0.          Contraintes mécaniques  Les vaisseaux sont en permanence soumis à des contraintes mécaniques associées à la pression artérielle e au flux sanguin. On décrit trois types de contraintes mécaniques : celles dues aux forces de pression (perpendiculaires a vaisseau), celles dues aux forces de cisaillement (ou « shear stress, cyclic strain ») et celles, aux effets moins
bien connus, dues à l'étirement de la membrane basale. Les forces de cisaillement modulent considérablement la morphologie des cellules vasculaires et leur fonctions. Les mécanismes par lesquels les cellules vasculaires reçoivent et interprètent les signaux mécaniques extérieurs à l’intérieur des noyaux cellulaires commencent juste à être mis à jour. Actuellement, il est reconnu que les intégrines, les canaux ioniques, PDGF, et les proteines G sont mécano-sensibles, et donc capable de convertir le stimulus mécanique en signaux chimiques. L’activation de voies de signalisations, comme la voie des mitogen-activated protein kinases (MAP-K), des proteines kinase C (PK-C), semble augmenter l’activité de facteurs de transcription : activator protein-1 et 2 (AP-1,-2), cAMP-responsive element (CRE), early growth response-1 (Egr-1), et nuclear factor-kappa B (NF κ B). Lorsque ces facteurs se lient à l’ADN, de nombreux gènes sont activés, régulant la prolifération cellulaire, l’apoptose, la différentiation, la migration et la sécrétion. La compréhension de ces phénomènes ouvrira de nouvelle perspectives dans l’étude des maladies cardiovasculaires et dans leurs traitements.  Le stress mécanique a surtout été étudié dans les cellules endothéliales, et en particulier au niveau de l sécrétion de substances actives sur les CML essentiellement vasodilatatrices, monoxyde d’azote, prostacycline, endothelium-derived hyperpolarizing factor  (EDHF) mais aussi des facteurs vasoconstricteurs comme l’endothéline.  L’effet des forces de cisaillement, exercées lors de l’HTA, sur les CML, et en particulier l’acquisition d’u phénotype migratoire par les CML qui serait dû uniquement au stress mécanique a très peu été étudié et reste encore à définir.   III. Les cellules musculaires lisses vasculaires  Les CML sont des cellules différenciées issues du mésoderme comme le sont les autres types de cellule musculaires (hormis les cellules myoépithéliales). Ce sont des cellules allongées de 2-5 µm de diamètre pour une longueur très variable selon le tissu (de 15 µm pour les plus petites à 500 µm pour les CML utérines). Elles sont généralement fusiformes avec des extrémités pointues et parfois bifides. Chaque cellule possède un seul noyau (contrairement aux cellules musculaires squelettiques qui sont multinuclées). Les cellules in vivo sont organisées en feuillet et sont parallèles les unes aux autres, et les cellules en culture primaire retrouvent souvent cette même organisation spatiale. Elles sont associées entre elles par une charpente de tissu conjonctif renfermant essentiellement du collagène et de l’élastine. Elles ont un mode de contraction relativement différent des cellules musculaires cardiaques et squelettiques. En effet les contractions sont non volontaires, contrôlées par le système nerveux autonome et par le système hormonal par modification du taux de calcium intracellulaire.  es CML vasculaires participent au maintien structural des vaisseaux en sécrétant du collagène, de l’élastine L et d’autres constituants de la matrice extracellulaire. Elles sont également responsables du maintien fonctionnel des vaisseaux par leur rôle contractile en réponse aux facteurs sécrétés par l’endothélium.  Les CML peuvent être présentes dans la média des artères sous deux phénotypes : un phénotype contractile et quiescent que l’on retrouve majoritairement dans les parois adultes saines et un phénotype sécrétoire,

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