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Niveau: Supérieur
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur - Strasbourg I Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Clélia Orange « Un fluorophore photoactivable pour des études spatio-temporelles de la dynamique du cytosquelette d'actine ; les interactions des protéines à domaine SH3, le cas de Bzz1p. » Soutenue publiquement le vendredi 6 juillet 2007 Devant les membres du jury : Directrice de Thèse : Mme Barbara Winsor, Directeur de Recherche, Strasbourg Directeur de Thèse : M. Maurice Goeldner, Professeur, Strasbourg Rapporteur Interne : M. Serge Potier, Professeur, Strasbourg Rapporteur Externe : M. Peter Philippsen, Professeur, Bâle, Suisse Rapporteur Externe : M. Carsten Schultz, Directeur de Recherche, Heidelberg, Allemagne

  • christelle pour les analyses de spectrométrie de masse des protéines

  • réactivité des assemblages biologiques du ministère de la recherche

  • protéine

  • moment difficile

  • directeur de la recherche


Publié le : dimanche 1 juillet 2007
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur - Strasbourg I


Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie



par

Clélia Orange



« Un fluorophore photoactivable pour des études
spatio-temporelles de la dynamique du
cytosquelette d’actine ; les interactions des
protéines à domaine SH3, le cas de Bzz1p. »



Soutenue publiquement le vendredi 6 juillet 2007



Devant les membres du jury :

Directrice de Thèse : Mme Barbara Winsor, Directeur de Recherche, Strasbourg
Directeur de Thèse : M. Maurice Goeldner, Professeur, Strasbourg
Rapporteur Interne : M. Serge Potier, Professeur, Strasbourg Externe : M. Peter Philippsen, Professeur, Bâle, Suisse
Rapporteur Externe : M. Carsten Schultz, Directeur de Recherche, Heidelberg, Allemagne Remerciements
Le travail présenté dans cette thèse a été réalisé au laboratoire de Chimie Bioorganique
dirigé par le Professeur Maurice Goeldner et au laboratoire de Cytosquelette d’Actine et Trafic
Intracellulaire dirigé par le Docteur Barbara Winsor. Je tiens à les remercier pour m’avoir accueilli
dans leurs groupes et confié ce projet de thèse innovant à l’interface de la chimie et de la biologie,
de m’avoir soutenu tout au long de ce travail passionnant mais empli d’embûches.
Je tiens à remercier Messieurs Peter Philippsen, Serge Potier et Carsten Schultz pour
m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger ce travail de thèse.
Je désire également remercier les différentes personnes qui ont participé à ce travail :
Alexandre et Chantal qui m’ont fait découvrir l’univers des levures et du cytosquelette
d’actine au tout début de ma thèse.
Karine qui m’a initié aux joies de la synthèse organique.
Alex qui grâce à ses judicieux conseils m’a permis d’obtenir ma molécule tant désirée et
aussi un grand merci pour les corrections de ce manuscrit.
Jean-Luc Vonesch, Didier Hentsch et en particulier Pascal pour l’initiation au monde de la
microscopie confocale.
Pascale pour la spectrométrie de masse des molécules chimiques et pour son aide pour la
purification et aussi pour les moments de détente, les grandes discussions et la piscine.
Christelle pour les analyses de spectrométrie de masse des protéines.
Je remercie et je souhaite aussi bon courage à David et à Adeline qui m’ont aidé pour les
expériences au cours de ma thèse et continuent mon projet.
Je n’oublie pas non plus les stagiaires que j’ai encadrés et qui m’ont permis d’avancer plus
sereinement dans ce projet : Catherine, Cédric et Laurence.
Je voudrais bien sur remercier tous les nombreux membres de la Faculté de Pharmacie et de
l’UMR7156 avec lesquels j’ai eu des relations et des échanges très enrichissants.
Je garderai toujours un excellent souvenir de ces moments passés, en particulier les
discussions quotidiennes autour d’une tasse de thé, avec les personnes du laboratoire de Chimie
Bioorganique : Bernard, Flo, Elias, Jean-Seb, Tic, Portia, Alexandre et Anne. Merci à Elias pour
ces merveilleux repas libanais.
èmeJe tiens aussi à remercier les membres du 4 étage de l’IPCB, en particulier : Gladys et
Johan pour leurs conseils et pour les corrections du manuscrit, Sylvie pour son enthousiasme et
Vincent, Albert, Lydia pour les discussions scientifiques ou non autour de la table du midi.
Un grand merci à Cathy pour son aide dans tous les petits tracas de la vie administrative
et l’organisation des pots. Toutes les sorties culturelles, les randonnées dans les Vosges et les
piques-niques gargantuesques m’ont permis de souffler et me laissent des soucvenirs impérissables.
Sans ma famille et mes amis, ce travail n’aurait pas pu aboutir. Merci à mes parents et mes
deux sœurs Elodie et Marjorie d’avoir été là et de m’avoir soutenu dans les moments de doute et
qui m’ont permis de revoir régulièrement « mes » montagnes. Merci aussi à mes amis du
Magistère : Christelle, Jérémy, Christophe et Julien et tous les amis de Strasbourg pour avoir été à
mes côtés et avoir partagé ses années de thèse. Et bien sur, je n’oublie pas non plus mes amis de
Grenoble et d’ailleurs : Samantha, tu m’as fait rêver avec tes photos de plongée, Nadège, Olivier.
Guillaume, ton soutien et ta patience tout au long de cette thèse qui fut un moment
difficile de ma vie m’ont permis de rester optimiste. Merci pour tout.
Je remercie finalement le programme ACI – Dynamique et Réactivité des assemblages
biologiques du Ministère de la Recherche, la Ligue contre le Cancer, l’Université Louis Pasteur et
le CNRS qui ont financé ces travaux. Table des matières
LISTE DES ILLUSTRATIONS 7
ABREVIATIONS 10
LISTE DES PROTEINES DE LEVURE ET DE LEURS FONCTIONS MENTIONNEES AU COURS
DE CE TRAVAIL 12
AVANT PROPOS 14
PARTIE 1. DEVELOPPEMENT D’UN FLUOROPHORE PHOTOACTIVABLE 16
CHAPITRE 1. FLUOROPHORES PHOTOACTIVABLES ET ETIQUETTES CHIMIQUES DE PROTEINES 17
I. PRINCIPE DE LA FLUORESCENCE 17
II. EXCITATION A DEUX PHOTONS 19
III. FLUOROPHORES PHOTOACTIVABLES 21
A. Critères d’un fluorophore photoactivable efficace 22
B. Stratégie générale 24
IV. GROUPEMENTS PHOTOLABILES 26
A. Groupements o-nitrobenzyles 26
B. s o-nitrophénéthyles 27
V. MARQUAGE SPECIFIQUE DE PROTEINES 29
A. Marqueurs protéiques 29
1) Protéines fluorescentes 29
2) uorescentes photoactivables 31
B. Marqueurs chimiques 33
1) Petites sondes utilisant le ciblage d’une séquence protéique 33
2) ee peptidique 37
3) Incorporation d’acides aminés non naturels 39
VI. OBJECTIFS 42
CHAPITRE 2. RESULTATS ET DISCUSSION 43
I. STRATEGIE REASH-EDT CAGE 2
A. Principe 43
B. Synthèses 44
II. STRATEGIE COUMARINE-NTA CAGEE 46
A. Principe 46
B. Synthèses 47
1) Le fluorophore 47
2) Le motif NTA 49 a) Cbz/SEM 49
b) Alloc/PMB 51
c) Cbz/tBu 53
3) Les cages 53
C. Propriétés photochimiques 54
1) Propriétés photophysiques 54
2) Réaction de photofragmentation 54
D. Tests cellulaires 58
1) Entrée cellulaire 58
2) Toxicité cellulaire 62
CHAPITRE 3. PERSPECTIVES 63
CHAPITRE 4. PARTIE EXPERIMENTALE 67
I. SYNTHESES 67
A. 1-(3,4-diméthoxyphényl)-2,2,2-trifluoro-éthanone (1) 67
B. 1-(2-nitro-4,5-diméthoxy-phényl)-2,2,2-trifluoro-éthanone (2) 68
C. 1-(2-nitro-4,y-phényl)-2,ro-éthanol (3) 68
D. 1-(2-nitro-4,5-diméthoxy-phényl)-2,2,2-trifluoro-chloroéthane (4) 69
E. Résorufine-4,5-bis(mercurique trifluoroacétate) (5) 69
F. 2,4-Dihydroxy-5-chloro-benzaldéhyde (6) 70
G. Acide 6-chloro-7-hydroxy-coumarine-3-carboxylique ou « coumarine » (7) 70
H. N,N-Bis(carboxyméthyl)-N-(carboxybenzyl)-L-lysine (8) 71
I. [Triméthylsilyl(éthoxy)]méthyl-N,N-bis{[2-triméthyl silyl(éthoxy)méthoxy]
carbonyl}-(carboxybenzyl)-L-lysine (9) 71
J. [Triméthylsilyl(éthoxy)]méthyl-N,N-bis{[2-triméthylsilyl(éthoxy)méthoxy]
carbonyl}-L-lysine ou « Lysine- NTA-SEM » (10) 72 3
K. « Coumarine-Lysine-NTA-SEM » (11) 73 3
L. « Ac-Coumarine-Lysine-NTA-SEM » (12) 73 3
M. « Cage-coumarine-Lysine-NTA-SEM » (13) 74 3
N. (tert-Butoxy)-N,N-bis(2-tert-butoxycarbonylméthy)l-Nε-carboxybenzyl-L-lysine
(14) 75
O. (tert-Butoxy)-N,N-bis(2-tert-butoxycarbonylméthyl)-L-lysine (15) 76
P. « Coumarine-Lysine-NTA-tBu » (16) 76 3
Q. « Cage-Coumarine-Lysine-NTA-tBu » (17) 77 3
R. « Cage-Couysine-NTA » (18) 78
S. « Ac-Coumarine-Lysine-NTA-tBu » (19) 78 3
T. ine-NTA » (20) 79 II. CULTURE DES CELLULES HELA 79
III. INCUBATION AVEC LES DIFFERENTS DERIVES DE LA COUMARINE 80
PARTIE 2. DYNAMIQUE ET RECHERCHE DE NOUVEAUX PARTENAIRES DE BZZ1P,
MEMBRE DE LA FAMILLE PCH 81
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 82
I. LE CYTOSQUELETTE D’ACTINE
A. Fonctions du cytosquelette d’actine 82
B. Dynamique de la polymérisation 83
C. Nucléation érisation de l’actine 86
1) Le complexe Arp2/3 86
2) Les protéines de la famille WASP/Scar 90
a) Structure 90
b) Régulation 92
D. de la polymérisation de l’actine chez les mammifères 95
II. LE CYTOSQUELETTE D’ACTINE CHEZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE 97
A. Le cycle de vie de la levure 97
B. Organisation et fonctions du cytosquelette d’actine chez la levure 99
1) Organisation du cytosquelette d’actine au cours du cycle cellulaire 99
2) Fonctions de l’actine chez la levure 100
3) Assemblage de l’actine dans les différentes structures 102
a) Les taches corticales d’actine : le complexe Arp2/3 102
b) Les câbles d’actines : les formines 105
C. Taches corticales d’actine et endocytose 107
1) Ultrastructure 107
2) Modèle pour le développement des taches corticales d’actine et leur fonction 109
3) La famille PCH 111
a) Généralités 111
b) Les protéines PCH dans la dynamique membranaire 114
c) s PCH dans la régulation du cytosquelette 114
d) Le cas de Bzz1p 116
III. OBJECTIFS 116
CHAPITRE 2. RESULTATS 118
I. RECHERCHE DES INTERACTIONS DES DOMAINES SH3
II. CRIBLE DE SURPRODUCTION DE BZZ1P 120
III. INTERACTIONS PROTEINE-PROTEINES DE BZZ1P 122
TMA. Principe du «ProtoArray» 122 B. Analyse de la liste des candidats potentiels obtenus. 125
1) Aip1p 129
2) Ast2p 129
3) Ypt32p 130
4) Protéines non caractérisées 130
C. Etude phénotypique des souches dépourvues des gènes codants pour les candidats
retenus 130
1) Croissance des mutants à différentes températures et sur différents milieux 132
a) Croissance à différentes températures 132
b) Croissance sur milieux hyper-osmotiques 132
c) sur une source carbonée non fermentable 134
d) Croissance en présence de bénomyl 134
2) Recherche d’un effet des différentes délétions surle profil de bourgeonnement, le
cytosquelette d’actine et l’endocytose en phase fluide. 134
a) Profil de bourgeonnement 134
b) Organisation du cytosquelette d’actine 136
c) Observation de l’endocytose en phase fluide 138
3) Localisation de Bzz1p-GFP 140
D. Recherche d’une interaction génétique entre Bzz1p et certains de ses partenaires
cellulaires potentiels 140
IV. INTERACTIONS DOMAINE-SPECIFIQUE DE BZZ1P 143
V. INTERACTIONS PROTEINE - LIPIDES DE BZZ1P
A. Rôle du domaine F-BAR 143
B. Localisation de Bzz1-GFP et les phosphoinositides 147
CHAPITRE 3. DISCUSSION ET PERSPECTIVES SUR BZZ1P. 148
I. CRIBLE DE SURPRODUCTION 148
II. INTERACTIONS PROTEINE-PROTEINES
III. SPECTROMETRIE DE MASSE 151
IV. I-LIPIDES 152
CHAPITRE 4. MATERIELS ET METHODES 154
I. BACTERIES 154
A. Souches utilisées et génotypes 154
B. Conditions et milieux de culture et conservation 154
C. Transformation et isolation de l’ADN Plasmidique 155
1) Transformation 155
a) Méthode chimique 155 b) Electroporation 155
2) Préparation d'ADN 156
II. LEVURES 156
A. Souches utilisées et génotype 156
B. Conditions et milieux de culture et conservation 157
C. Transformation et isolement de l’ADN Génomique 157
1) Transformation 157
2) Préparation d'ADN à partir de cellules de levure 158
a) Méthode mécanique 158
b) Méthode enzymatique 158
D. Techniques génétiques 159
1) Conjugaison 159
2) Sporulation 159
3) Dissection des tétrades 159
III. VECTEURS DE CLONAGE 160
A. Plasmides spécifiques à E. coli 160
B. s navettes E. coli / S. cerevisiae 160
IV. MANIPULATIONS CONCERNANT L'ADN
A. Détermination de la concentration en ADN 160
B. Digestion par les enzymes de restriction 161
C. Séparation électrophorétique des fragments d'ADN 161
D. Séquençage de l'ADN 161
E. Amplification enzymatique de l'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) 161
V. MANIPULATIONS CONCERNANT LES PROTEINES 162
A. Préparation d'extraits protéiques bruts 162
1) Extraits protéiques de Saccharomyces cerevisiae 162
2) Extraits protéiques d'Escherichia coli 162
B. Expression, purification et utilisation d’une protéine fusionnée à 6xHistidines 163
1) La protéine est soluble 163
2) est insoluble 163
C. Conservation des extraits protéiques 164
D. Détermination de la concentration en protéines 164
E. Séparation électrophorétique des protéines 164
F. Coloration des protéines dans un gel de polyacrylamide-SDS 165
G. Western blotting 165
TMH. « Protoarray » (Invitrogen) 166 I. PIP Strip Membrane 166
VI. METHODES CYTOLOGIQUES APPLIQUEES A LA LEVURE 167
A. Fixation des cellules 167
B. Marquage par des colorants 167
1) Phalloïdine couplée au TRITC 167
2) Lucifer Yellow CH 167
3) Calcofluor White 168
C. Microscopie : acquisition et traitement des images 168
CONCLUSION 171
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 172
ANNEXES 191

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