Thèse présentée pour obtenir le grade de

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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline: Sciences du Vivant Spécialité: Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Bastien FRICKER Utilisation de la lignée de souris transgéniques Cycline D1-Luciférase pour l'analyse de mécanismes de dégénérescence du système nerveux Soutenue publiquement le 9 Novembre 2007 Commission d'Examen: Docteur Fréderique RENE directeur de thèse Professeur Guy MENSAH-NYAGAN rapporteur interne Docteur Daniel HANTAI rapporteur externe Docteur Christophe EGLES rapporteur externe Docteur Pierre-François PRADAT examinateur

  • neuropathie au cis-platine chez l'homme

  • cnd1-luc

  • indice de fonctionnalité du nerf sciatique

  • compression nerveuse

  • cycline d1

  • entrée en apoptose des neurones post-mitotiques

  • cycle cellulaire

  • dosage de l'activité luciférase


Publié le : jeudi 1 novembre 2007
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur
Strasbourg I
Discipline: Sciences du Vivant
Spécialité: Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie
par Bastien FRICKER
Utilisation de la lignée de souris transgéniques
Cycline D1-Luciférase pour l’analyse de mécanismes de
dégénérescence du système nerveux
Soutenue publiquement le 9 Novembre 2007
Commission d’Examen:
Docteur Fréderique RENE directeur de thèse
Professeur Guy MENSAH-NYAGAN rapporteur interne
Docteur Daniel HANTAI rapporteur externe
Docteur Christophe EGLES
Docteur Pierre-François PRADAT examinateurJe remercie :
Monsieur Guy MENSAH-NYAGAN,
Monsieur Daniel HANTAI,
Monsieur Christophe EGLES,
Monsieur Pierre-François PRADAT,
d’avoir accepté d’évaluer ce travail.Sommaire
SOMMAIRE
ABREVIATION6
INTRODUCTION7
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES10
Le système nerveux périphérique et ses nerfs

10
Généralités sur le système nerveux périphérique10
Architecture des nerfs périphériques10
Histologie du nerf12
L’unité fonctionnelle du nerf périphérique: la fibre nerveuse12
Les neurones des nerfs périphériques

15
Généralités sur les neurones15
Spécificités et architecture fonctionnelle15
Spécificités des neurones 15
Architecture fonctionnelle des neurones 16
Cytosquelette, moteurs moléculaires et pathologies associées17
Cytosquelette et transport axonal 18
Pathologies associées au cytosquelette et au transport axonal 19
Origine et organisation anatomique des neurones du système nerveux périphérique
20
Les motoneurones20
Les motoneurones et leur afférences centrales 21
Les motoneurones dans la moelle épinière 22
Atteintes du motoneurone-α 24
Les neurones sensoriels24
Généralités sur les neurones sensoriels primaires 24
Les afférences primaires 24
Les cellules de Schwann et la gaine de myéline

25
Origine des cellules de Schwann et gliogenèse26
Marqueurs de la lignée gliale et réversibilité phénotypique26
Molécules contrôlant la gliogenèse dans la crête neurale26
Déterminisme des cellules de Schwann immatures28
La gaine de myéline et sa formation28
Organisation de la gaine de myéline29
La région nodale 29
2Sommaire
La région paranodale 29
La spécialisation juxtaparanodale 30
L’internode 30
Mécanismes d’engainage de l’axone32
Sélection des axones et initiation des premiers contacts 32
Croissance des prolongements de la myéline 33
Premiers contacts et formation des noeuds de Ranvier 33
Régulation de l’épaisseur et allongement de la myéline 33
Protéines des cellules de Schwann et pathologies associées34
Pathologies des nerfs périphériques : compression, chimiothérapie et diabète

35
La compression nerveuse transitoire35
Modifications comportementales36
Changements structuraux et électrophysiologiques36
Réponse cellulaire37
Neuropathie induite par le cis-platine38
Neuropathie au cis-platine chez l’homme38
Modèles murins des neuropathies au cis-platine39
Neuropathie expérimentale au cis-platine 39
Neurotoxicité du cis-platine 39
Les neuropathies diabétiques40
Les neuropathies diabétiques chez l’homme et physiopathologie40
Modèle murin de diabète de type I induit par la streptozotocine41
Cycline D1 dans le système nerveux

42
Cycle cellulaire et cycline D142
Les phases du cycle cellulaire43
Le contrôle du cycle cellulaire par les complexes cycline/Cdk45
Les complexes cycline/Cdk au cours du cycle cellulaire 45
La cycline D1 45
Prolifération des cellules de Schwann46
Prolifération des cellules de Schwann in vitro 46
Prolifération des cellules de Schwann in vivo 50
Hypothèse d’un lien entre cycle cellulaire et apoptose50
L’entrée en apoptose des neurones post-mitotiques: une tentative avortée d’initier le cycle
cellulaire51
Arguments expérimentaux51
Arguments in vitro 51
Arguments in vivo 54
MATERIEL & METHODES56
Animaux et expérimentation animale56
Génération des souris transgéniques CnD1-Luc56
Expérimentation animale56
Compression du nerf sciatique 56
3Sommaire
Induction des neuropathies au cis-platine et carboplatine 56
Induction du diabète et traitement neuroprotecteur 57
Prélèvements57
Evaluation fonctionnelle57
Mesure da la force musculaire 58
Indice de fonctionnalité du nerf sciatique 58
Examen électrophysiologique58
Enregistrement des activités spontanées de dénervation 58
Enregistrement de potentiel d’action musculaire composé 61
Vitesse de conduction du nerf caudal 61
Culture primaire de fibroblastes61
Transcription inverse et PCR semi-quantitatives62
Extraction d’ARN totaux62
Transcription inverse et PCR semi-quantitative62
Western-blot62
Dosage de l’activité luciférase63
Immunomarquages63
Immunofluorescence63
Révélation à la peroxydase de raifort64
Comptage de motoneurones64
Analyses statistiques65
RESULTATS66
Cycline D1 et neuropathies périphériques

66
Prolifération des cellules de Schwann: un dénominateur commun des neuropathies
périphériques?66
Contexte de travail et objectif de l’étude 66
Résultats - Discussion 68
Publication n°1 - Evaluation Tools & Animal Models of Peripheral Neuropathies72
Etude spatio-temporelle de l’expression de la cycline D1 dans les cellules de Schwann
après une compression nerveuse110
Contexte de travail et objectifs de l’étude110
Résultats110
Récupération fonctionnelle après une compression nerveuse 110
Modifications électrophysiologiques 111
Dosage global de l’activité luciférase du nerf sciatique après compression nerveuse 114
Analyse spatio-temporelle de l’activation transcriptionnelle de la CnD1 dans le nerf sciatique après
compression nerveuse 114
Localisation cellulaire de la CnD1 dans les phases précoces de la dégénérescence Wallérienne 118
Discussion118
Utilisation de la lignée cycline D1-luciférase pour l’évaluation de propriétés
neuroprotectrices dans un modèle de neuropathie diabétique121
Contexte de travail et objectifs de l’étude121
Résultats122
Cinétique d’induction de l’activité luciférase. 122
4Sommaire
Effet d’un traitement chronique de C1 sur l’activité luciférase et la vitesse de conduction nerveuse de
souris diabétiques 122
Effet du C1 sur la perte de poids et la glycémie de souris diabétiques 125
Effet d’une semaine de traitement de C1 sur l’augmentation d’activité luciférase associée à la
compression nerveuse 125
Discussion125
Expression de la cycline D1 dans les motoneurones adultes & apoptose
neuronale

130
Publication n°2 - Cyclin D1 expression is not sufficient to induce motor neuron death
in adult mice after a sciatic nerve crush133
Aperçu des collaborations à d’autres projets

148
Publication n°3 - Mouse models with motor neurone defects as a tool for deciphering
ALS : applications, limits and future challanges148
Publication n°4 - Increased peripheral lipid clearance in an animal model of
amyotrophic lateral sclerosis150
DISCUSSION & PERSPECTIVES152
Expression de la CnD1 et prolifération des cellules de Schwann : un
dénominateur commun aux neuropathies expérimentales

153
CnD1 et dégénérescence Wallérienne associée à la compression nerveuse153
La lignée de souris transgéniques CnD1-Luc : un outil d’évaluation des neuropathies
périphériques155
Actualisation du lien entre la cycline D1 et l’apoptose neuronale

158
Conclusion et perspectives

159
REFERENCES162
5Abréviations
ABREVIATION
ADN: acide désoxyribonucléique
ADNc: ADN complémentaire
ARNm: acide ribonucléique messager
ASD: activité électrique spontanée caractéristique de la dénervation
bHLH: motif “hélice-boucle-hélice” basique
BMP: protéine morphogénique osseuse
C1: 2,4,4-triméthyl-3-(15-hydroxypentadécyl)-2-cyclohexe-1-one
CAM: molécule d’adhésion cellulaire
CCN: cellules de la crête neurale
ChAT: choline acétyl-transférase
CMT: syndrome de Charcot-Marie-Tooth
CnD1: cycline D1
Cdk: kinase dépendante des cyclines
CKI: inhibiteur des Cdk
CMAP: potentiel d’action musculaire composé
CS: cellule de Schwann
CSP: cellule de Schwann précurseur
Cx: connéxine
dNTP: désoxynucléotides triphosphate
EGF: facteur de croissance de l’épiderme
EMG: électromyographie
FCS: sérum de veau foetal
i.p.: intrapéritonéale
IFS: indice de fonctionnalité du nerf sciatique
+K : ion potassium
MAP: protéine associée aux microtubules
MBP: protéine basique de la myéline
MMLV: virus de la leucémie murine de Moloney
MN: motoneurone
MPZ: protéine zéro de la myéline
NCAM: molécule d’adhésion cellulaire neuronale
PBS: tampon phosphate salin
PCR: réaction de polymérisation en chaine
PFA: paraformaldéhyde
PMP22: protéine de la myéline périphérique 22KDa
RT: transcription inverse
Shh: Sonic hedghog
SNC: système nerveux central
SNCV: vitesse de conduction des nerfs sensoriels
SNP: système nerveux périphérique
Sox10: SRY (sex determining region Y) box-10
SPG: paraplégie spastique
STZ: streptozotocine
6*/530%6$5*0/Introduction
INTRODUCTION
Dans le domaine de la recherche neurologique, les mécanismes responsables de la dégénérescence
axonale et la réponse des cellules gliales qui contribuent au remodelage neveux ont longtemps été
négligés au profit d’études se focalisant sur le corps cellulaire des neurones. Pourtant, la
compréhension de ces mécanismes pourrait avoir des retombées majeures pour le traitement des
maladies neurodégénératives, des neuropathies périphériques et dans la reconstruction nerveuse.
Sous le terme de neuropathies périphériques les neurologues regroupent toutes pathologies
caractérisées par une altération de la structure ou de la fonction des nerfs périphériques moteurs,
sensoriels, mixtes ou du système nerveux autonome. D’étiologies très diverses, les mécanismes
initiateurs peuvent prendre place dans l’axone lui-même, le corps cellulaire ou bien au sein de cellules
de Schwann (CS). Ces pathologies incapacitantes constituent un véritable enjeu de santé publique
comme l’atteste, pour ne citer que celui ci, le nombre de cas de neuropathies associées au diabète
(une projection estime à 333 millions le nombre de diabétiques en 2025, dont 33% développeront une
neuropathie), à l’infection par VIH ou par le bacille de la Lèpre (environs 550 000 cas enregistrés en
2003).
Lors de mon arrivée au laboratoire, une lignée de souris transgéniques avait été générée : les souris
cyclineD1-Luciférase (CnD1-Luc) qui expriment la luciférase sous contrôle du promoteur de la cycline
D1 (CnD1). L’intérêt de cette lignée était double:
i.) La CnD1 est une molécule clé du cycle cellulaire puisqu’elle permet la transition de la
phase G1 à la phase S. A l’aide de ce modèle transgénique, on peut aisément évaluer la
régulation transcriptionnelle de ce gène, reflétant la réponse proliférative des cellules dans un
tissu cible, par exemple celle des CS dans les nerfs périphériques.
ii.) D’autre part, de nombreuses études portant sur l’apoptose neuronale et les maladies
neurodégénératives avaient mis en évidence que la reprise du cycle cellulaire, médiée par la
CnD1, était interprétée comme une information conflictuelle par ces cellules post-
mitotiques, conduisant à l’initiation de l’apoptose.
Les objectifs de mon travail de thèse consistaient dans un premier temps à caractériser cette lignée
CnD1-Luc, puis à l’appliquer à l’étude des neuropathies périphériques et de l’apoptose neuronale par
l’utilisation de différents modèles animaux.
7Introduction
L’analyse intensive de la bibliographie relative aux neuropathies périphériques a rapidement révélé
que la prolifération des CS est une constante des pathologies du système nerveux périphérique. Il
ressortait également de cette étude que la prolifération des CS chez l’animal adulte est strictement
dépendante de la CnD1. Ces observations nous ont conduit à tester trois modèles de neuropathies
périphériques dans le but de vérifier que les souris CnD1-Luc pourraient être utilisées pour l’étude de
ces pathologies. Les résultats obtenus, rapportés dans la publication n°1, montrent que les souris
CnD1-Luc répondent à un large spectre de neuropathies : mononeuropathie induite par compression
nerveuse, polyneuropathie sensorielle axonale provoquée par administration de composés platinés et
polyneuropathie sensorielle démyélinisante associée au diabète.
La compression nerveuse est le paradigme expérimental qui permet l’étude du remodelage des nerfs
périphériques. Les modifications comportementales, électrophysiologiques et structurales sont
réversibles, contrairement au modèle d’axotomie où la régénération est faible voir inexistante. D’un
point de vue cellulaire, une partie des axones dégénère de manière rétrograde du côté distal à la
lésion. La régénération axonale est tributaire d’un guide physique que constitue la gaine de myéline,
mais également de molécules de guidage et de facteurs trophiques délivrés par les CS. Ainsi, ce type
de lésion s’accompagne d’une prolifération active des CS, dépendante de la CnD1. Si le sens de la
dégénérescence axonale a récemment été élucidé, l’intensité, la direction et la chronologie de la
réponse proliférative des CS restent inconnus. En débutant cette étude, les objectifs étaient (i.) de
valider la fonctionnalité de la lignée CnD1-Luc, puis (ii.) d’établir le schéma spatial et temporel précis
de la prolifération des CS jusqu’alors inconnu. Les résultats obtenus sont présentés dans le premier
paragraphe du chapitre “La lignée de souris transgéniques CnD1-Luc : un outil d’étude des
neuropathies périphériques”.
Nous avons ensuite souhaité conforter l’applicabilité de ce modèle à l’ensemble des neuropathies
périphériques mais aussi le développer pour des études de criblage d’agents neuroprotecteurs. Pour
cela nous avons choisi de comparer la réponse de souris diabétiques à des souris, également
diabétiques, mais traitées de manière chronique avec un composé potentiellement neuroprotecteur, le
2,4,4-trimethyl-3-(15-hydroxypentadecyl)-2-cyclohexe-1-one aussi appelé C1. Ces travaux, rapportés
dans le deuxième chapitre de la section “Résultats” , confortent l’utilisation de cette lignée pour le
criblage de drogues à pouvoir thérapeutique.
La dernière partie de mes travaux s'intéresse à la régulation des voies apoptotiques après
compression nerveuse. Chez le nouveau-né cette lésion induit l’apoptose des motoneurones (MN), a
contrario, les mêmes neurones sont résistants à ce type de stress chez l’animal adulte. Basée sur des
observations surprenantes initialement obtenues sur les souris CnD1-Luc qui suggéraient l’activation
de la CnD1 dans la moelle épinière, nous avons entrepris une étude des régulateurs de la phase G1
8

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