Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur

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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur, Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Présentée par : Edith Hourcade DÉGRADATION DU DICHLOROMÉTHANE ET ADAPTATION À LA PRODUCTION INTRACELLULAIRE D'ACIDE CHEZ METHYLOBACTERIUM Soutenue publiquement le 18 juillet 2007 Membres du jury: Directeur de thèse M. Stéphane Vuilleumier Professeur à l'Université Louis Pasteur, Strasbourg Examinateur M. Serge Potier Professeur à l'Université Louis Pasteur, Strasbourg Rapporteur interne M. Jean-Marc Jeltsch Professeur à l'Université Louis Pasteur, Strasbourg Rapporteur externe Mme Julia Vorholt Professeur, Institut für Mikrobiologie, ETH Zürich Rapporteur externe M. Thierry Maugard Maître de Conférences à l'Université de la Rochelle

  • adaptation à la production intracellulaire

  • strasbourg rapporteur interne

  • adaptation à la production

  • génétique moléculaire

  • résidents de la pension hinata

  • rapporteur externe

  • sciences du vivant aspects moléculaires


Publié le : dimanche 1 juillet 2007
Lecture(s) : 76
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 170
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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur
de l’Université Louis Pasteur, Strasbourg I


Discipline : Sciences du vivant
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie


Présentée par :
Edith Hourcade



DÉGRADATION DU DICHLOROMÉTHANE ET
ADAPTATION À LA PRODUCTION INTRACELLULAIRE
D'ACIDE CHEZ METHYLOBACTERIUM





Soutenue publiquement le 18 juillet 2007


Membres du jury:
Directeur de thèse M. Stéphane Vuilleumier Professeur à l’Université Louis Pasteur, Strasbourg
Examinateur M. Serge Potier Professeur à l’Université Louis Pasteur, Stra
Rapporteur interne M. Jean-Marc Jeltsch Professeur à l’Universitrasbourg
Rapporteur externe Mme Julia Vorholt Professeur, Institut für Mikrobiologie, ETH Zürich
Rterne M. Thierry Maugard Maître de Conférences à l’Université de la Rochelle
















































Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur
de l’Université Louis Pasteur, Strasbourg I


Discipline : Sciences du vivant
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie


Présentée par :
Edith Hourcade



DÉGRADATION DU DICHLOROMÉTHANE ET
ADAPTATION À LA PRODUCTION
INTRACELLULAIRE D'ACIDE CHEZ
METHYLOBACTERIUM





Soutenue publiquement le 18 juillet 2007


Membres du jury:
Directeur de thèse M. Stéphane Vuilleumier Professeur à l’Université Louis Pasteur, Strasbourg
Examinateur M. Serge Potier Professeur à l’Université Louis Pasteur, Strasbourg
Rapporteur interne M. Jean-Marc Jeltsch Professeur à l’Université Louis Pasteur, Strasbourg
Rapporteur externe Mme Julia Vorholt Professeur, Institut für Mikrobiologie, ETH Zürich
Rapporteur externe M. Thierry Maugard Maître de Conférences à l’Université de la Rochelle



















































REMERCIEMENTS
R








Ce travail de thèse a été réalisé au sein du laboratoire de " Génétique Moléculaire,
Génomique, Microbiologie " de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg (UMR 7156 /
CNRS). Je tiens à remercier Serge Potier et Stéphane Vuilleumier de m'avoir accueilli et
confié ce projet de thèse.

Je tiens à remercier Madame Julia Vorholt et Messieurs Jean-Marc Jeltsch et Thierry
Maugard d'avoir accepté de juger ce travail de thèse.

Je désire remercier tous les membres du laboratoire qui ont chacun contribué de près ou de
loin au bon déroulement de cette thèse.

Merci à tous mes amis et pairs qui ont déjà entamé l'aventure que constitue la thèse. Merci
d'avoir été à mes côtés et d'avoir partagé ces années de thèse. Et un énorme merci pour cette
merveilleuse journée à la JAPANEXPO. (¤^_^¤) Bon courage et bonne chance à tous.

Je tiens à remercier tous les étudiants et tous les post-docs qui se sont succédés et qui m'ont
aidé et soutenu au cours de ces 4 années.

Un grand merci à ma famille pour m'avoir soutenu moralement et financièrement et ainsi
avoir pu permettre la réalisation de ce doctorat.

Je remercie N. Uzumaki et les habitants de Konoha, J.K.R., Mister Q, les résidents de la
pension Hinata, les frères Elric et tous les autres qui m'ont accompagné pendant toute cette
période (@^0^@)
1 TABLE DES MATIÈRES

TABLE DES MATIÈRES T



INTRODUCTION

1. Le dichlorométhane 14
2. Les bactéries méthylotrophes 18
2.1. Définition générale
2.2. Les bactéries méthanotrophes 19
2.3. Les bactéries méthylotrophes n'utilisant pas le méthane 20
2.4. Le genre Methylobacterium 20
2.5. Métabolisme des bactéries méthylotrophes non-méthanotrophes 22
3. Dégradation microbienne du dichlorométhane 25
3.1. Micro-organismes dégradant le dichlorométhane 25
3.2. Voies métaboliques de transformation et de toxication
du ichlorméthane 28
4. Réponse au stress acide chez les bactéries 30
4.1. Adaptation et acido-tolérance
4.2. Mécanismes de résistance 32
4.2.1. Modification de la membrane 33
4.2.2. Production de composés alcins 35
4.2.3. Homéostasie du pH interne 36
4.2.3.1. Perturbation du pH 37 i
4.2.3.2. Régulation du pH 38 i
Système AR1 39
Système AR2 41
2 TABLE DES MATIÈRES

Régulation du système AR2 42
Système AR3 45
Rôle des canaux à chlorure dans AR2 et AR3 45
Capacité tampon du cytoplasme 47
4.2.4. Protection et réparation des protéines et de l’ADN 49
Protection et réparation des protéines 49
Système de réparation de l’ADN 50
4.25. Régulation 51
Systèmes à deux composants 51
Système de quorum sensing 52
4.2.6. Systèmes d'acido-tolérance en phase exponentielle 52
5. Sujet de thèse 54


MATÉRIEL ET MÉTHODES

1. Souches bactériennes 56
2. Milieux et conditions de cultures 57
2.1. Eschericha coli 57
2.2. Methylobacterium 58
2.2.1. Milieux de culture 58
2.2.2. Conditions de cultures 60
2.3. Contrôle de pureté des souches et conservation 60
2.4. Antibiotiques 60
3. Suivi temporel de la croissance bactérienne 61
4. Suivi de la déchloration bactérienne 61
5. Traitement à l’acide 62
6. Mesure de la viabilité cellulaire 62
3 TABLE DES MATIÈRES

7. Mesure de la fluorescence de la GFP 62
8. Méthodes de biologie moléculaire 63
8.1. Extraction plasmidique
8.2. d'ADN génomique 63
8.2.1. Préparation rapide d'ADN génomique 63
8.2.2. Préparation d'ADN génomique 64
8.3. Electrophorèse
8.4. Précipitation alcoolique de l'ADN 65
8.5. Purification d'ADN par gel 65
8.6. Détermination de la concentration d'ADN 65
8.7. Digestion enzymatique 65
8.8. Déphosphorylation 66
8.9. Polymérisation 66
8.10. Ligation de molécules d'ADN 66
8.11. Transformation 66
8.12. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 67
8.13. Hybridation ADN/ADN 69
8.13.1. Préparation de l’ADN 70
8.13.2. Transfert
8.13.3. Préparation des sondes froides 70
8.13.4. Préhybridation et hybridation 71
8.13.5. Détection par colorimétrie 71
8.14. Détermination de la séquence d'un fragment d'ADN 72
9. Mutagenèse par transposition aléatoire 72
10. Criblage des mutants / détermination des phénotypes 74
11. Analyse du site d'insertion du mini-transposon 74
1. PCR invers 74
11.2. Amplification des gènes comportant le
4 TABLE DES MATIÈRES

mini-transposon (linker Y) 75
11.2.1. Préparation du linker Y et de l'ADN génomique 76
11.2.2. Amplification par PCR 76


CHAPITRE 1 : RÉSISTANCE À L’ACIDE CHEZ METHYLOBACTERIUM

Introduction 78
1. Tolérance de M. dichloromethanicum DM4 selon
la nature de l’acide 80
2. Effet des ions chlorure sur l'acido-tolérance de la souche DM4 82
3. Effet du surnageant de culture sur la tolérance à l'acide 84
4. Effet de différentes fractions de surnageant sur
la tolérance à l'acide 86
5. Acido-tolérance de la souche CM4 exprimant
la dichlorométhane déshalogénase de la souche DM4 88
6. Tolérance de Methylobacterium chloromethanicum CM4 à l'acide 90
7. Mesure de l'intensité de fluorescence de la GFP 92


CHAPITRE 2 : CRIBLAGE DE MUTANTS ET TECHNIQUES DE
CARACTÉRISATION

Introduction 95
1. Obtention des mutants 96
2. Criblage des mutants / détermination des phénotypes 98
3. Reconstruction in silico de la séquence du mini-transposon
délivré par le plasmide pAG408 101
4. Analyse des sites d'insertion du mini-transposon 104

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