Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur

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.. . . . . . Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie par Nicolas Lévy XRCC1XRCC1, un élément clef de la réparation des dommages de l'ADN couplée à la réplication Thèse soutenue publiquement le 22 novembre 2007 esbs École supérieure de biotechnologie Strasbourg CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Directeur de thèse : Dr. Gilbert de Murcia Rapporteur interne : Pr. Philippe Carbon Rapporteur externe : Dr. Janet Hall Rapporteur externe : Dr. Pablo Radicella Examinateur : Dr. Domenico Maiorano Invité : Dr. Anne Bresson Directeur de thèse : Dr. Josiane Ménissier de Murcia Travail réalisé au sein du département Intégrité Du Génome, UMR 7175 du CNRS, ESBS Bd Sébastien Brant, BP 10413, 67412 Illkirch CEDEX

  • techniques d'analyse de la réplication de l'adn dans les extraits d'œufs de xénope

  • esbs

  • département idg

  • ton calme


Publié le : jeudi 1 novembre 2007
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Thèse présentée pour obtenir le grade de.
. Docteur de l’Université Louis Pasteur
. Strasbourg I
.esbs
École supérieure
de biotechnologie Discipline : Aspects moléculaires et.Strasbourg
cellulaires de la biologie.
.CENTRE NATIONAL par Nicolas LévyDE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
XRCC1, un élément clef de laXRCC1
réparation des dommages
de l’ADN couplée à
la réplication
Travail réalisé au sein du département Intégrité Du Génome, UMR 7175 du CNRS, ESBS
Bd Sébastien Brant, BP 10413, 67412 Illkirch CEDEX
Thèse soutenue publiquement le 22 novembre 2007
Directeur de thèse : Dr. Josiane Ménissier de Murcia
Directeur de thèse : Dr. Gilbert de Murcia
Rapporteur interne : Pr. Philippe Carbon
Rapporteur externe : Dr. Janet Hall
Rapporteur externe : Dr. Pablo Radicella
Examinateur : Dr. Domenico Maiorano
Invité : Dr. Anne BressonA la mémoire de
Josiane Ménissier de Murcia Ce travail de thèse a été réalisé au sein du département Intégrité Du Génome de
l’UMR 7175 à l’ESBS, et a été pour moi une période formidable où j’ai côtoyé des personnes
de grande valeur, tant sur le plan scientifique que sur le plan humain.
Je tiens tout d’abord à remercier Gilbert et Josiane de Murcia qui m’ont accueilli
dans leur département en janvier 2004 et ont été pour moi de véritables « parents »
scientifiques. J’ai eu le plaisir d’avoir Josiane comme directrice de thèse et comme collègue
pendant 18 mois, puis malheureusement elle a été forcée de se détourner du laboratoire.
J’aurais vraiment aimé qu’elle puisse lire cette thèse, mais, à notre grand regret à tous, elle
nous a quittés trop tôt. Merci à toi, Gilbert, d’avoir dès lors supervisé mes travaux, tu as été
un chef toujours disponible et à l’écoute de mes opinions. Je te souhaite une retraite paisible
et heureuse en tant que « Papirazzi ».
Un grand merci aux Dr. Janet Hall, Pr. Philippe Carbon et Dr. Pablo Radicella qui
m’ont fait le plaisir d’accepter de juger mon travail de thèse et d’assumer la tâche de
rapporteur.
Valérie, je garderai un très bon souvenir de notre « road trip » vers la Hollande et j’ai
beaucoup apprécié le travail à tes côtés. Avec Françoise, vous êtes les deux nouvelles chefs
du labo, duo de choc et de charme qui guidera le département IDG vers de nouveaux
sommets !
Anne, merci pour tout, notre travail en commun sur XRCC1 et p58 aura été un réel
plaisir. Je te souhaite bonne chance dans tes prochains sujets de recherche et j’espère que les
purifications de protéines ne seront plus aussi laborieuses.
Jean-Christophe, mon cher voisin de bureau. Toutes nos conversations sur les
dernières technologies, et tous nos petits délires vont réellement me manquer (il faudra
vraiment mettre au point ce destructeur de mouches laser !)
Aline, notre petite souris du labo. Tu as été une voisine de bureau super ! Merci
d’avoir toujours été prête à rendre service, et merci pour tes tartes au citron !
Adeline, tu as abandonné l’ESBS voilà quelques temps déjà, mais à mon arrivée ici tu
as été, avec Aline, une des personnes qui ont fait que je me suis tout de suite senti chez moi.
Ta spontanéité et ton ouverture d’esprit ont grandement participé à la bonne ambiance de
l’époque.
Merci à toi, Delphine, ton calme, ta gentillesse et tes délicieuses crêpes vont me
manquer !
Tonie, merci d’avoir amené par ta présence un peu du soleil du Liban dans notre
bureau d’alsaciens.Elise, notre « poussin » au labo. Merci pour ta fraicheur et ton sourire. Je te promets
que j’ai enfin compris que la Normandie c’est à l’Ouest de la France (Mais avoue que ce
n’est pas logique !)
Véronique, notre saxophoniste du labo, j’espère avoir un jour le plaisir de t’entendre
jouer !
Rosy et Kuan, les deux « grandes sœurs » du labo, votre compagnie aura été un vrai
plaisir.
Merci à toi, Claude, pour ton calme, ton humour et ta gentillesse. Tu auras été un
voisin de paillasse génial, tu mérites bien ton rôle de Père Noël du labo.
Patrick, je n’oublierai pas nos conversations sur l’informatique, et nos éternels
débats, amicaux bien sûr, Mac contre PC.
Najat, tous mes meilleurs vœux à toi et à ta famille qui s’est agrandie récemment avec
l’arrivée de la petite Sirine.
Je remercie aussi tout le reste du département IDG : Marie-Pierre, Peter, Borbala,
Marc, Jérome, Sandrine, Elisabeth, Régine, Agnès, Valérie et Brigitte, ainsi que tous les
jeunes de passage sans qui ces années n’auraient pas eu la même saveur : Claire, Céline,
Aurélie, Sadan, Chloé, Dominique, Camille et tous les autres.
Un grand merci au Dr. Marcel Méchali, qui a accepté que je vienne apprendre les
techniques d’analyse de la réplication de l’ADN dans les extraits d’œufs de xénope chez lui à
l’IGH de Montpellier.
Mille mercis à toi, Domenico, pour tout le temps que tu m’as accordé, pour ta
gentillesse et pour ton sourire permanent. J’ai beaucoup appris grâce à toi.
Bénédicte, merci de m’avoir aidé dès que j’en avais besoin, ta compagnie, ton petit
accent méditerranéen chantant auront été un réel plaisir durant ces semaines à Montpellier.
Merci enfin à Etienne Weiss, qui a eu la judicieuse idée de me conseiller, voilà près de
quatre ans, d’aller toquer aux portes du quatrième étage de l’ESBS pour découvrir les
merveilles qui s’y cachent.
Et merci surtout à toute ma famille qui a toujours été là pour moi tout au long de ces
années, aux collègues de l’Addal qui m’ont beaucoup appris et à tous mes amis qui ont su me
changer les idées quand j’en avais besoin ! Table des matières
Table des matières
Tabledesmatières..............................................................................................................1
Listedesfigures..................................................................................................................7
Listedesabréviationsetacronymes...................................................................................9
INTRODUCTION ................................................................................................................ 11
I. Laréponsecellulaireauxdommagesdel’ADN.......................................................... 12
1. Lesdifférentstypesdelésionsdel’ADN.................................................................... 12
A) Leslésionsspontanéesdel’ADN..................................................................................12
B) Lesalkylationsdebase.................................................................................................14
C) Lesdommagesoxydatifs..............................................................................................14
D) Leslésionsdel’ADNphoto induites.............................................................................18
E) Lescoupuresphysiologiquesdel’ADN.........................................................................18
2. Lespointsdecontrôledel’intégritédugénome........................................................ 19
A) LesprotéineskinasesreliéesauxPI3kinases...............................................................21
1) LakinaseATM..........................................................................................................21
2) LaATR............................................................................................................22
3) LakinaseDNA PK.....................................................................................................22
B) LepointdecontrôleG1/S.............................................................................................23
C) Lepointdecontrôleintra S..........................................................................................24
D) LepointdecontrôleG2/M...........................................................................................25
E) Pointsdecontrôleducyclecellulaireetcancer............................................................26
II. Lesdifférentesvoiesderéparationdel’ADNchezleseucaryotes.............................. 27
1. Laréparationdesmésappariementsdebases........................................................... 27
A) Reconnaissancedumésappariement...........................................................................27
B) Ciblagedubrinnéo synthétisé.....................................................................................30
C) Réparationdumésappariement..................................................................................30
2. Laréparationparexcisiondenucléotide................................................................... 31
A) LemécanismeduNER..................................................................................................31
1) Lareconnaissancedelalésion.................................................................................33
2) Ladélimitationdelalésion......................................................................................33
1
rrrrTable des matières
3) Incisiondubrind’ADNportantlalésion..................................................................34
4) Eliminationdel’oligonucléotidecontenantlalésion...............................................34
5) Synthèsed’ADN,remplissagedelabrèche..............................................................34
B) LespathologiesliéesàundéfautduNER.....................................................................34
1) Xerodermapigmentosum........................................................................................35
2) LesyndromedeCockayne36
3) Latrichothiodystrophie............................................................................................36
3. Laréparationdescassuresdouble brindel’ADN ...................................................... 37
A) Larecombinaisonhomologue......................................................................................39
B) Lanonhomologue...............................................................................40
1) LemécanismedebaseduNHEJ42
2) Lasous unitécatalytiquedeDNA PK.......................................................................43
a) LesrôlesmultiplesdeDNA PKcs...................................................................................43
b) SéquenceetstructuredeDNA PKcs.............................................................................43
c) LesciblesdeDNA PKcs.................................................................................................45
3) Lesvoiesalternativesderecombinaisonnonhomologue.......................................46
a) L’ADN ligaseIII.............................................................................................................47
b) Lapoly(ADP ribose)polymérase1...............................................................................47
c) XRCC1...........................................................................................................................48
d) Lapolynucléotidekinase..............................................................................................48
4. Laréparationdescassuressimple brindel’ADN,laréparationparexcisiondebase 49
A) Lemécanismederéparationdescassuressimple brindel’ADN.................................51
1) Détectiondelalésion–BER.....................................................................................51
2)delalésion SSBR....................................................................................52
3) Traitementdesextrémitésdelacassure.................................................................53
4) Remplissagedelabrèche.........................................................................................54
5) Ligationdesdeuxextrémitésdelalésion................................................................56
B) LaprotéineXRCC1........................................................................................................57
1) Lesdomainesstructurauxetfonctionnels deXRCC1..............................................59
a) LedomaineN terminal.................................................................................................59
b) LeBRCT1(BRCA1C Terminaldomain1)........................................................62
c) Ledomaineintermédiaire«linker».............................................................................63
d) LeBRCT2........................................................................................................64
2) LeslignéescellulairesdéficientesenXRCC1............................................................65
a) Hypersensibilitéauxagentsgénotoxiques...................................................................66
b) Déficiencedanslaréparationdescassuressimple brin...............................................66
2
rrrrrrrrrrrrr

rTable des matières
c) Déficiencedanslaréparationdescassuresdouble brin..............................................67
d) Perturbationdelaréplicationdel’ADN.......................................................................68
3) LepolymorphismegénétiquedeXRCC1..................................................................70
a) LeSNPR194W..............................................................................................................70
b) LeSNPR280H...............................................................................................................71
c) LeSNPR399Q72
d) LesmutationsponctuellesdeXRCC1............................................................................73
C) Lapoly(ADP ribose)polymérase 1..............................................................................76
1) LasuperfamillePARP................................................................................................76
a) PARP 1..........................................................................................................................78
b) PARP 278
c) Lestankyrases..............................................................................................................79
d) LesCCCH PARP.............................................................................................................79
e) Lesmacro PARP............................................................................................................80
f) LesautresPARP80
2) Laréactiondepoly(ADP ribosyl)ation.....................................................................81
3) Lesrôlesphysiologiquesdelapoly(ADP ribosyl)ation............................................82
a) Réparationdescassuresdel’ADNetsurviecellulaire..................................................82
b) Plasticitédelachromatine, régulationdelatranscriptionetdelaréplication..........83
4) LecatabolismeduPAR,lapoly(ADP ribose)glycohydrolase....................................85
III. Laréplicationdel’ADNchezleseucaryotes............................................................... 87
1. Lemécanismedelaréplication................................................................................. 87
A) L’initiationdela..........................................................................................87
1) Lesoriginesderéplication........................................................................................89
2) Lareconnaissancedesoriginesderéplication.........................................................89
3) Lecomplexedepré réplication................................................................................89
4) L’activationdesoriginesderéplication....................................................................90
B) LecomplexeADNpolymérase primase.....................................................................91
1) Structureetfonctiondelaprimase.........................................................................91
2) LespartenairesducomplexePol primase............................................................94
3) Lerôledelaprimasedanslaréparationdel’ADNetlespointsdecontrôleducycle
cellulaire...........................................................................................................................94
C) L’élongationdesbrinsd’ADN.......................................................................................96
1) L’échanged’ADNpolymérase..................................................................................96
2) Lamaturationdesfragmentsd’Okazaki..................................................................98
3) L’hélicaseréplicative................................................................................................99
3
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Table des matières
1) Laréplicationtranslésionnelle..................................................................................101
A) Lespolymérasestranslésionnelles..............................................................................101
B) Lerecrutementdespolymérasestranslésionnelles....................................................103
IV. Objectifsdemontravaildethèse.............................................................................104
RESULTATS.......................................................................................................................106
ère
1 PARTIE107
XRCC1estphosphoryléparDNA PKenréponseauxdommagesdel’ADN.......................107
I. Introduction.............................................................................................................108
II. Publicationn°1:......................................................................................................110
III. Discussion................................................................................................................121
A) XRCC1estassociéàDNA PKinvitro..........................................................................121
B) LedomaineBRCT1deXRCC1estphosphoryléinvivosursasérine371parDNA PKen
réponseauxrayonnementsionisants.................................................................................121
C) Laphosphorylationdelasérine371parDNA PKcontrôlelatransitionentreuneforme
dimèreetuneformemonomèredeXRCC1........................................................................124
D) XRCC1stimulel’activitédeDNA PKin vitro...............................................................125
E) Laphosphorylationdelasérine371deXRCC1estrequisepourlaréparationefficace
descassuresdouble brindel’ADN.....................................................................................126
F) XRCC1constitueunrelaismoléculaireentrelesvoiesdeSSBRetDSBR....................127
è
2 PARTIE.........................................................................................................................129
XRCC1interagitavecp58pourrégulerl’avancementdelafourchederéplicationsurun
ADNendommagé.............................................................................................................129
I. Introduction130
II. Publicationn°2:......................................................................................................132
III. Discussion................................................................................................................161
A) XRCC1interagitaveclasousunitép58ducomplexeADNpolymérase primase...161
B) Laliaisondupoly(ADP ribose)parp58inhibefortementl’activitédel’ADNprimase
p48 p58..............................................................................................................................161
C) LescellulessurexprimantledomaineBRCT1deXRCC1présententuneactivitéPARP
élevée..................................................................................................................................162
4
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