Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur

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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant par Denis Filisetti Vaccination génique contre la toxoplasmose chez la souris : mise au point et validation de huit candidats vaccins Soutenue publiquement le 26 janvier 2006 Membres du jury Directeur de Thèse : Monsieur Ermanno Candolfi, PU-PH, Strasbourg Rapporteur Interne : Madame Anne-Marie Aubertin, DR INSERM, Strasbourg Rapporteur externe, Présidente du Jury : Madame Isabelle Villena, PU-PH, Reims Rapporteur externe : Monsieur Hervé Pelloux, PU-PH, Grenoble

  • préparation de l'adn de la souche rh de toxoplasma gondii

  • vaccin

  • vaccins constitués de souches vivantes

  • stratégie de mutation des gènes vaccinaux pour le ciblage des antigènes protéiques

  • analyse bioinformatique des séquences des gènes codant les protéines vaccinantes

  • interrogation de la banque de données nucléotidiques

  • vaccination avec la protéine gra2


Publié le : dimanche 1 janvier 2006
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Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur
Strasbourg I
Discipline : Sciences du vivant
par Denis Filisetti
Vaccination génique contre
la toxoplasmose chez la souris :la toxoplasmose chez la souris :
mise au point et validation
de huit candidats vaccinsde huit candidats vaccins
Soutenue publiquement le 26 janvier 2006
Membres du jury
Directeur de Thèse : Monsieur Ermanno Candolfi, PU-PH, Strasbourg
Rapporteur Interne : Madame Anne-Marie Aubertin, DR INSERM, Strasbourg
Rapporteur externe, Présidente du Jury : Madame Isabelle Villena, PU-PH, Reims
Rapporteur externe : Monsieur Hervé Pelloux, PU-PH, GrenobleDédicace
A la mémoire d’Isabelle Ruolt.
iiRemerciements
A notre directeur de thèse, Monsieur le Professeur Ermanno Candolfi.
Votre dynamisme et votre enthousiasme nous engagèrent à travailler à ce projet sous votre direction.
Les années passant, ces qualités ne vous ont pas quitté, malgré les difficultés que nous avons
rencontrées. Accompagnant nos doutes et nos questionnements, vous avez fait cheminer notre
réflexion personnelle vers des lieux riches en découvertes. Il est indéniable que cela nous aura
changé, ce qui ne constitue pas le moindre des effets de ce travail.
A notre rapporteur interne, Madame le Docteur Anne-Marie Aubertin.
Vous nous avez ouvert les portes de votre unité afin que nous puissions utiliser le matériel nécessaire
à la réalisation de ce travail. En acceptant d'être rapporteur de notre travail de thèse de doctorat en
sciences, vous nous honorez en vous y intéressant et en le jugeant.
A notre rapporteur externe et présidente du jury, Madame le Professeur Isabelle Villena.
Vous nous honorez doublement puisque non seulement vous avez accepté de considérer notre travail
et de le juger mais vous avez aussi accepté de présider ce jury.
Soyez en chaleureusement remerciée.
A notre rapporteur externe, Monsieur le Professeur Hervé Pelloux.
Dès nos premiers pas dans le domaine de la parasitologie, vous avez montré bienveillance à notre
égard et porté intérêt à notre travail. Soyez donc remercié vivement puisque vous avez aussi accepté
de juger notre travail, ce qui nous honore.
A celles et ceux sans qui ce travail n’aurait pas été possible.
iiiTable des Matières
INTRODUCTION 1
1. La toxoplasmose humaine ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1
2. Réponse immunitaire permettant de survivre à une toxoplasmose----------------------------------------------- 2
3. Présentation des antigènes au système immunitaire----------------------------------------------------------------- 3
3.1. La voie de présentation utilisant le CMH de classe I ---------------------------------------------------------- 3
3.2. La voie de présentation utilisant le CMH de classe II --------------------------------------------------------- 5
4. Vaccins à ADN -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9
4.1. Historique------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 9
4.2. Caractéristiques d’un vaccin à ADN --------------------------------------------------------------------------- 10
4.3. Avantages des vaccins à ADN----------------------------------------------------------------------------------- 11
4.4. Désavantages des vaccins à ADN ------------------------------------------------------------------------------ 12
4.5. Choix du vaccin à ADN ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
4.6. Stimulation du système immunitaire par les vaccins à ADN ------------------------------------------------ 13
5. Les vaccins développés contre la toxoplasmose--------------------------------------------------------------------- 16
5.1. Vaccins constitués de souches vivantes et atténuées de Toxoplasma gondii ------------------------------ 18
5.2. Vaccins sous-unitaires protéiques ------------------------------------------------------------------------------ 19
5.2.1. Vaccination avec la protéine SAG1 ---------------------------------------------------------------------- 19
5.2.2.vec la protéine GRA2 23
5.2.3. Vaccination avec la protéine SAG3 23
5.3. Vaccins à ADN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 24
5.3.1. Prévention de la toxoplasmose aiguë--------------------------------------------------------------------- 24
5.3.1.1. Prévention de la toxoplasmose aiguë létale-------------------------------------------------------- 27
5.3.1.2. Prévention de la toxoplasmose aiguë sub-létale--------------------------------------------------- 29
5.3.2. Prévention de la toxoplasmose chronique --------------------------------------------------------------- 30
iv5.3.3. Prévention de la toxoplasmose congénitale-------------------------------------------------------------- 34
5.4. Comparaison des vaccins à ADN et protéiques dans la prévention de la toxoplasmose ---------------- 34
6. Projet de travail : construction de vaccins à ADN contre la toxoplasmose en fonction de la présentation
au CMH et mesure de l’efficacité vaccinale ---------------------------------------------------------------------------- 35
6.1. SAG1---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36
6.2. GRA2 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
6.3. SAG3 40
6.4. SAG1, GRA2 et SAG3 sont trois protéines possédant un peptide signal C-terminal--------------------- 42
6.5. SAG1 et SAG3 sont deux protéines ayant un ancrage GPI-------------------------------------------------- 44
6.6. Stratégie de mutation des gènes vaccinaux pour le ciblage des antigènes protéiques vaccinaux dirigé
vers une voie de présentation aux lymphocytes T par le CMH------------------------------------------------------- 45
MATERIEL ET METHODES 48
1. Analyse bioinformatique des séquences des gènes codant les protéines vaccinantes SAG1, GRA2 et
SAG3--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48
1.1. Interrogation de la banque de données nucléotidiques GenBank à la recherche des séquences
contenant les gènes SAG1, GRA2 et SAG3 ----------------------------------------------------------------------------- 48
1.2. Téléchargement des séquences nucléotidiques contenant les gènes SAG1, GRA2 et SAG3------------- 48
1.3. Comparaison des séquences nucléotidiques contenant les gènes SAG1, GRA2 et SAG3---------------- 49
1.4. Détermination du signal d’ancrage GPI dans les séquences nucléotidiques de SAG1 et SAG3-------- 49
1.5. Analyse du biais d’usage des codons chez Toxoplasma gondii, Mus musculus et Homo sapiens ------ 50
2. Synthèse des séquences d’ADN des gènes SAG1, GRA2 et SAG3 sauvages et mutées---------------------- 51
2.1. Définition des amorces------------------------------------------------------------------------------------------- 51
2.2. Préparation de l’ADN de la souche RH de Toxoplasma gondii -------------------------------------------- 52
2.3. Synthèse des gènes par PCR haute fidélité -------------------------------------------------------------------- 52
2.4. Electrophorèse analytique --------------------------------------------------------------------------------------- 53
2.5. Purification des gènes synthétisés ------------------------------------------------------------------------------ 54
v3. Clonage des gènes synthétisés dans pGEM-T----------------------------------------------------------------------- 54
3.1. Ajout de désoxyadénosine à l’extrémité 3’ des gènes synthétisés------------------------------------------- 55
3.2. Quantification de l’ADN des gènes synthétisés --------------------------------------------------------------- 55
3.3. Insertion des gènes synthétisés dans le vecteur de clonage pGEM-T -------------------------------------- 55
3.4. Transformation de bactéries compétentes par les constructions plasmidiques --------------------------- 56
3.5. Sélection des bactéries transformées --------------------------------------------------------------------------- 57
3.6. Vérification de l’insertion des gènes synthétisés dans pGEM-T -------------------------------------------- 58
3.7. Culture des bactéries transformées avec le vecteur pGEM-T ayant intégré le gène synthétisé--------- 60
3.8. Purification du vecteur pGEM-T-------------------------------------------------------------------------------- 60
3.9. Vérification de la séquence des gènes insérés dans pGEM-T ----------------------------------------------- 60
3.10. Vérification de l’identité des gènes synthétisés avec leur séquence de référence --------------------- 60
4. Sous-clonage des gènes de pGEM-T dans pVAX1 ----------------------------------------------------------------- 62
4.1. Préparation du vecteur pVAX1---------------------------------------------------------------------------------- 62
4.2. Double digestion enzymatique des gènes synthétisés insérés dans pGEM-T------------------------------ 64
4.2.1. Préparation des vecteurs pGEM-T contenant les gènes synthétisés vérifiés ------------------------ 64
4.2.2. Transformation des construction pGEM-T contenant les gènes synthétisés dans des bactéries
E. coli déficientes en méthylases-------------------------------------------------------------------------------------- 64
4.3. Insertion des gènes synthétisés dans le vecteur vaccinant pVAX1------------------------------------------ 65
4.4. Vérification de la séquence des gènes insérés dans pVAX1 ------------------------------------------------- 65
5. Production vaccinale en cultures bactériennes --------------------------------------------------------------------- 66
5.1. Cultures bactériennes (E. coli)---------------------------------------------------------------------------------- 67
5.2. Purification de l’ADN vaccinal --------------------------------------------------------------------------------- 67
5.2.1. Purification avec le système Endofree Plasmid Maxi Kit---------------------------------------------- 67
5.2.2. Purification avec le système GenElute Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit -------------------- 68
5.2.3. Purification avec le système Endotoxin-free Plasmid DNA------------------------------------------- 69
5.2.3.1. Système NucleoBond PC 500 EF ------------------------------------------------------------------- 69
5.2.3.2. Système NucleoBond PC 10 000 EF --------------------------------------------------------------- 70
6. Vérification de la production des protéines vaccinantes in vitro ------------------------------------------------ 71
6.1. Cultures cellulaires HeLa---------------------------------------------------------------------------------------- 71
vi6.2. Transfection des vaccins pVAX1-------------------------------------------------------------------------------- 71
6.3. Extraction et dosage des protéines produites ----------------------------------------------------------------- 72
6.4. Electrophorèse des protéines------------------------------------------------------------------------------------ 72
6.5. Immunoblot -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 72
7. Mesure de l’efficacité vaccinale dans des modèles de toxoplasmose chez la souris-------------------------- 74
7.1. Elevage de souris ------------------------------------------------------------------------------------------------- 74
7.2. Culture in vivo des souches RH et Me49 de Toxoplasma gondii ------------------------------------------- 74
7.3. Détermination de la dose infectieuse RH et Me49 chez les souris BALB/c-------------------------------- 75
7.4. Protocole de vaccination et d’infection ------------------------------------------------------------------------ 77
7.5. Mesure des anticorps anti-Toxoplasma chez la souris------------------------------------------------------- 81
7.5.1. Immunofluorescence indirecte ---------------------------------------------------------------------------- 82
7.5.2. ELISA -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 82
7.5.2.1. Détection des anticorps anti-SAG1 ----------------------------------------------------------------- 82
7.5.2.2. Détection des anticorps anti-Toxoplasma ---------------------------------------------------------- 83
- Préparation des antigènes totaux de Toxoplasma gondii-------------------------------------------- 83
- Détection des anticorps à l’aide de l’AST ------------------------------------------------------------ 84
7.6. Dosage de l’interféron-gamma---------------------------------------------------------------------------------- 85
7.7. Mesure de la parasitémie par PCR quantitative -------------------------------------------------------------- 85
7.8. Modèle de toxoplasmose aiguë létale -------------------------------------------------------------------------- 87
7.8.1. Mesure de la survie et tests statistiques ------------------------------------------------------------------ 87
7.8.2. Mesures des anticorps anti-Toxoplasma ----------------------------------------------------------------- 87
7.9. Modèle de toxoplasmose chronique ---------------------------------------------------------------------------- 88
7.9.1. Mesure des kystes intra-cérébraux pour la détermination de la dose infectieuse ------------------- 88
7.9.2. Mesure des bradyzoïtes intra-cérébraux par PCR quantitative---------------------------------------- 88
7.9.3. Mesure des anticorps anti-Toxoplasma 89
7.9.4. Analyse de corrélation « anticorps – efficacité vaccinale » ------------------------------------------- 89
viiRESULTATS 91
1. Analyse bioinformatique des séquences des gènes codant les protéines vaccinantes SAG1, GRA2 et
SAG3--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 91
1.1. La comparaison des séquences du gène SAG1 révèle une identité nucléotidique complète chez la
souche RH ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 91
1.2. La comparaison des séquences du gène GRA2 dans la souche RH révèle une différence dans la partie
non codante----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 96
1.3. Il n’existe qu’une seule séquence décrite du gène SAG3 pour la souche RH ----------------------------- 99
2. Analyse du biais d’usage des codons chez Toxoplasma gondii, Mus musculus et Homo sapiens --------- 101
3. Synthèse des séquences d’ADN des gènes SAG1, GRA2 et SAG3 sauvages et mutées--------------------- 104
3.1. Positionnement des amorces nucléotidiques en vue de la synthèse par PCR des gènes SAG1, GRA2 et
SAG3 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 104
3.2. Synthèse des gènes SAG1, GRA2 et SAG3 par amplification PCR ---------------------------------------- 113
4. Insertion des gènes synthétisés dans le vecteur de clonage pGEM-T------------------------------------------ 115
5. Vérification des gènes synthétisés par séquençage---------------------------------------------------------------- 115
5.1. La comparaison des gènes synthétisés « SAG1 » révèle des différences avec la séquence de référence -
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 115
5.2. La comparaison des gènes synthétisés « GRA2 » révèle une délétion dans l’intron par rapport à la
séquence de référence ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 123
5.3. La comparaison des gènes synthétisés « SAG3 » montre une identité parfaite avec la séquence de
référence ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 127
6. Transfert des gènes synthétisés de pGEM-T dans pVAX1------------------------------------------------------ 133
7. La production de quantités suffisantes des vaccins à ADN pVAX1 a demandé l’utilisation de plusieurs
types de réactifs------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 134
7.1. Production avec le système Endofree Plasmid Maxi Kit---------------------------------------------------- 134
7.2. Production avec le système GenElute Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit -------------------------- 135
7.3. Production avec le système Endotoxin-free Plasmid DNA ------------------------------------------------- 136
viii8. La production in vitro des protéines vaccinantes SAG1, GRA2 et SAG3 sauvages et mutées n’est pas
détectable -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 137
9. Efficacité des vaccins à ADN dans les modèles de toxoplasmose chez la souris ----------------------------- 139
9.1. Détermination de la parasitémie dans le modèle de toxoplasmose aiguë létale------------------------- 139
9.2. Détermination de paramètres dans le modèle de toxoplasmose chronique ------------------------------ 140
9.2.1. Détermination de la quantité de kystes intra-cérébraux ----------------------------------------------- 140
9.2.2. Détermination de la parasitémie 5 jours après l’infection -------------------------------------------- 140
9.3. Les vaccins à ADN ne protègent pas les souris vaccinées d’une toxoplasmose aiguë létale----------- 141
9.3.1. Modèle de toxoplasmose aiguë létale et de dose vaccinale à 3 x 10 µg----------------------------- 141
9.3.2.toxoplasmode dose 3 x 50 µg 143
9.4. Les vaccins à ADN réduisent la quantité de bradyzoïtes intra-cérébraux chez les souris vaccinées dans
le modèle de toxoplasmose chronique---------------------------------------------------------------------------------- 145
9.4.1. Modèle de toxoplasmose chronique et de dose vaccinale à 3 x 10 µg ------------------------------ 145
9.4.1.1. Mesure des anticorps anti-Toxoplasma------------------------------------------------------------ 145
9.4.1.2. Mesure de la quantité de bradyzoïtes intra-cérébraux ------------------------------------------- 145
9.4.2. Modèle de toxoplasmose chronique et de dose vaccinale à 3 x 50 µg ------------------------------ 150
9.4.2.1. Mesure des anticorps anti-Toxoplasma 150
9.4.2.2. Mesure de la quantité de bradyzoïtes intra-cérébraux 150
9.4.2.3. Corrélation entre la présence d’anticorps anti-Toxoplasma et efficacité vaccinale---------- 160
9.5. La quantité d’interféron-gamma n’est pas différente entre les souris vaccinées et les souris contrôles -
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 160
DISCUSSION 163
1. Définir avec précision l’organisation des gènes de référence SAG1, GRA2 et SAG3 pour permettre la
synthèse appropriée des protéines d’intérêt vaccinal---------------------------------------------------------------- 163
1.1. Le gène SAG1 est polymorphe ------------------------------------------------------------------------------------- 163
1.1.1. Considérations sur la séquence d’initiation de la traduction du gène SAG1 ----------------------- 163
1.1.2. Considérations sur la limite C-terminale du peptide signal de SAG1 ------------------------------- 164
1.1.3. Considérations sur le signal d’ancrage GPI de SAG1------------------------------------------------- 165
1.2. Le gène GRA2 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 169
1.3. Le gène SAG3 est polymorphe --------------------------------------------------------------------------------- 170
1.3.1. Considérations sur la séquence d’initiation de la traduction du gène SAG3 ----------------------- 170
1.3.2. Considérations sur le signal d’ancrage GPI de SAG3 170
ix2. Comparaison de notre approche vaccinale et les gènes utilisés dans les autres vaccins à ADN contre la
toxoplasmose ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 173
3. De la difficulté de la préparation des vaccins à ADN------------------------------------------------------------- 175
4. Le biais d’utilisation des codons entre la souris, l’être humain et Toxoplasma gondii n’est pas nul ---- 176
5. Des modèles d’infection toxoplasmique chez la souris utilisés-------------------------------------------------- 177
6. Des tests statistiques ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 179
7. Points particuliers concernant les vaccins à ADN dans la toxoplasmose ------------------------------------- 180
8. De l’efficacité de nos vaccins à ADN--------------------------------------------------------------------------------- 183
8.1. Toxoplasmose aiguë létale-------------------------------------------------------------------------------------- 183
8.2. Toxoplasmose chronique---------------------------------------------------------------------------------------- 184
9. Perspectives--------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 188
CONCLUSION 190
BIBLIOGRAPHIE 193
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