UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

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1 UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG THESE Présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Discipline : Sciences du Vivant Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Sandra Welsch Dérégulation de la Protéine Apparentée à l'Hormone Parathyroïde (PTHrP) et du Récepteur PTH/PTHrP (Récepteur PTH1) dans l'Hypertension Artérielle en réponse à l'Angiotensine II Laboratoire de Pharmacologie et Physiopathologie Rénales U727 INSERM-ULP (Directeur : Dr JJ. Helwig) Faculté de Médecine, Strasbourg Soutenue le 21 juin 2005 devant la commission d'examen : P. Corvol Examinateur A. Parini Rapporteur externe V. Schini-Kerth Rapporteur interne C. Silve Rapporteur externe JJ. Helwig Examinateur M. Barthelmebs Directeur de thèse

  • schini-kerth rapporteur interne

  • hypertension artérielle en réponse

  • mort des os, des glandes et du cerveau…

  • reconnaissance aux membres

  • kinase du récepteur

  • profonde reconnaissance

  • sérum albumine de bœuf


Publié le : mercredi 1 juin 2005
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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

THESE

Présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG


Discipline : Sciences du Vivant

Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

par

Sandra Welsch


Dérégulation de la Protéine Apparentée à l’Hormone
Parathyroïde (PTHrP) et du Récepteur PTH/PTHrP
(Récepteur PTH1) dans l’Hypertension Artérielle en
réponse à l’Angiotensine II



Laboratoire de Pharmacologie et Physiopathologie Rénales
U727 INSERM-ULP (Directeur : Dr JJ. Helwig)
Faculté de Médecine, Strasbourg



Soutenue le 21 juin 2005 devant la commission d’examen :

P. Corvol Examinateur A. Parini Rapporteur externe V. Schini-Kerth Rapporteur interne
C. Silve JJ. Helwig Examinateur
M. Barthelmebs Directeur de thèse
1







« Les os peuvent se briser,
Les muscles s’atrophier,
Les glandes peuvent tarir,
Le cerveau lui-même peut s’endormir
Sans mettre en danger la vie.
Mais que les reins défaillent
Et c’est la mort des os, des glandes et du cerveau… »


W. Homer Smith – Fish to Philosopher (1953)
















2




A mes grands-parents

A Eric


A mes parents


A ma sœur


A ma famille


A tous ceux qui me sont chers





Je les remercie pour leur soutien constant, leur aide et leur réconfort durant toutes ces
années, qu’ils trouvent dans ce mémoire le témoignage de toute mon affection et de ma
profonde reconnaissance.















3Remerciements


Je remercie profondément Madame le Docteur Mariette Barthelmebs, Directrice de recherche au
CNRS, qui a assuré la direction de ce travail et m’a initiée à la recherche. Je lui suis particulièrement
reconnaissante pour son accessibilité, sa disponibilité et pour tout le temps qu’elle a consacré à ma
thèse. Je la remercie de m’avoir accordé sa confiance et prodigué son aide durant mon séjour au
laboratoire.


Je remercie chaleureusement le Docteur Jean-Jacques Helwig, Directeur de recherche à l’INSERM et
Directeur du Laboratoire de Pharmacologie et Physiopathologie Rénales, pour m’avoir accueillie au sein
de son unité, pour son écoute, son appui ainsi que pour son investissement dans ce travail.


J’exprime toute ma reconnaissance envers les membres de mon jury de thèse, Mesdames le Docteur
Caroline Silve et le Professeur Valérie Schini-Kerth, Messieurs le Professeur Pierre Corvol et le
Docteur Angelo Parini qui me font l’honneur d’accepter de juger ce travail.


Je remercie également vivement le Docteur Thierry Massfelder, Chargé de recherche à l’INSERM pour
m’avoir initié à la biologie moléculaire, pour sa disponibilité, ses compétences scientifiques, ses précieux
conseils, et sa collaboration dans une ambiance toujours joyeuse et efficace.


Mes remerciements très particuliers vont à Monsieur Eric Schordan, pour son aide quotidienne, son
réconfort et son soutien moral dans toutes mes démarches. Je lui suis reconnaissante de m’avoir épaulée
en toutes circonstances et supportée jour après jour durant toutes ces années. Merci à toi.


Cette thèse est l’occasion d’exprimer mes remerciements les plus chaleureux à l’ensemble des membres
du Laboratoire de Pharmacologie et Physiopathologie Rénales qui ont tous participé à la réalisation de ce
travail.

A Madame Sylvie Rothhut, pour son amitié chaleureuse, son dévouement, sa disponibilité ainsi que
pour l’intérêt qu’elle a porté à mon travail.

A Mesdames Suzanne Wendling, Virginie Roques et Danièle Kuhlwein pour leur aide technique et les
travaux de secrétariat.

A Monsieur Alain Lambert, ingénieur à l’INSERM, pour sa précieuse aide technique en physiologie.

A Madame Catherine Coquard pour sa sympathie et sa bonne humeur.

A tous mes amis du laboratoire, Mesdemoiselle Sabrina Danilin et Carole Sourbier, et Monsieur
Abdelali Agouni ainsi que Messieurs les Docteurs Benoît Escande et Samuel Fritsch, pour leur
sympathie, leur soutien et leur bonne humeur quotidienne.


Qu’ils trouvent tous ici l’expression de mon entière reconnaissance.


4Abréviations

AC : adénylate cyclase
ADN : acide désoxyribonucléique
AGT : angiotensinogene
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
Ang I : angiotensine I
Ang II : angiotensine II
ANP : peptide natriurétique atrial
ARNm : acide ribonucléique messager
ATP : adénosine triphosphate

BSA : sérum albumine de bœuf
Bmax : capacité maximale de liaison

CaR : récepteur sensible au calcium
CE : concentration efficace 50 50
CML : cellule musculaire lisse (r : rat, m : souris)
- Ao : aortique
- Rv : rénovasculaire
- V : vasculaires
CRE : élément répondant à l’AMPc

DAG : diacylglycérol
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DOCA: acétate de déoxycorticostérone

ECA: enzyme de conversion de l’angiotensine I
EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique
EGF : facteur de croissance épithélial

FBS : sérum fœtal de bœuf
FGF : facteur de croissance fibroblastique

GAPDH : glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
GC : guanylate cyclase
GMPc : guanosine monophosphate cyclique
GRKs : kinases des récepteurs couplés aux protéines G

H O : peroxyde d’hydrogène 2 2
HHM : hypercalcémie humorale maligne
HTA : hypertension artérielle
5HTLV-1 : human T cell leukemia virus de type 1

IGF : insuline growth factor
IL-1 : interleukine 1
IP-3 : inositol triphosphate
i.a. : intra-artériel
i.p. : intra-péritonéal
i.v. : intra-veineux

NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate déshydrogénase
NHERF : Na/H exchanger regulatory factor
NLS: signal de location nucléaire
NO: monoxyde d’azote
NOS : synthase du monoxyde d’azote

-O : anion superoxide 2

PBS : phosphate buffer saline
pcDNA : plasmide complementary désoxyribonucléic acid
PKA : protéine kinase A
PKC : protéine kinase C
PLC : phospholipase C
PMSF : phénylméthyl-sulfonyl fluorure
PTH : hormone parathyroïdienne
PTHrP: protéine apparentée à l’hormone parathyroïdienne

RCPG : récepteurs couplés aux protéines G
ROS : espèces réactives de l’oxygène
R-PTH1 : récepteur à l’hormone parathyroïdienne de type 1
RT-PCR : transcription réverse-réaction de polymérisation en chaine
RVR : résistance vasculaire rénale

SHR : rat spontanément hypertendu
NLS : signal de localisation nucléaire
SOD : superoxyde dismutase
SRA : système rénine-angiotensine

TIP 39: peptide tubéroinfundibulaire de 39 acides aminés
TGF-β: facteur de croissance tumoral
TNF-α: facteur de nécrose tumorale

WKY : Wistar Kyoto
6Sommaire

Abréviations ……………………………………………………………………………………5
Préface………………………………………………………………………………………….12
CHAPITRE I : Introduction Bibliographique……………………… 13
La Protéine Apparentée à l’Hormone Parathyroidienne ….…………………………..14
De l’hypercalcémie maligne à la PTHrP……………………………………………………………14
L’HHM, une vieille histoire………………………………………………………………………………..14
Caractérisation et isolement de la PTHrP ………………………….…..15
PTHrP et HHM……………………………………………………………………………………………..15
Structure du gène ……………………………………………………………………………………..16
Région promotrice………………………………………………………………………………………...17 codante……………………………………………………………………………………………18 3’…………………………………………………………………...19
La PTHrP, une famille de peptides………………………………………………………………… 19
Séquence signal prépro…………………………………………………………………………………. 20
Le fragment N-terminal : PTHrP(1-36)……………………….21
Les fragments intermédiaires……………………………………………………………………………21
Le fragment C-te(107-139)……………………………..22 rminal extrême : PTHrP(141-173)…………………………………………………..22
Autres traitements post-traductionnels…………………………………23
Variations dans les fragments de la PTHrP……………………………………………………………23
Modes d’action de la PTHrP………………………………………………………………………….24
Mode de sécrétion……………………………………………………………………………………….. 24
Action endocrine, paracrine ou autocrine……………………………………………………………... 24
Action intracrine………………………………………………………………………………………….. 25
Régulation de l’expression de la PTHrP…………………………………………………………...26
L’AMPc……………………………………………………………………………………………………. 28
Les facteurs de croissance et les cytokines……………………………………………………………28
Vasoconstricteurs et PKC………………………………………………. 28
Les hormones stéroïdes……………………………………………………………………… 28
Le calcium……………………………………………………….29
Conditions physiologiques et pathologiques…………………………………………………………...29
Principaux effets biologiques de la PTHrP………………………………………………………..30
PTHrP et carcinome………………………………………………………………………………………30
Développement du fœtus………………………………………………………………………………...31
Glande mammaire et lactation…………………………………………………………………………...32
La peau : épiderme, derme et follicule pileux…………………………………………………………..32
Le squelette………………………………………………………………..32
Le système nerveux central……………………………………………………………………………...33
Le foie……………………………………………………………………………………………………....33
Les poumons………………………………………………………………………………………………33
Le système endocrine…………………………………………………………………………………….34
Le muscle lisse……………………………………….34
Conclusions………………………………………………………………………………………………..35
Le Récepteur PTH/PTHrP ou R-PTH1 et les autres Récepteurs de la PTH ou PTHrP ….36
Structure du gène …………………………………………………………………………………….38
7Relations structure activité………………………………………………………………………….41
Domaine N-terminal extra-cellulaire……………………………………….……………………………41
Région juxtamembranaire……………………………….…………...….41
Dimérisation………………………………………………………………………….……………………43
Résidus cystéine extra-cellulaires………………………………………43
Sites de N-glycosylation……………………………………………………………………………........43
Activation du récepteur, signalisation intracellulaire…………………………………………..44
Interaction du R-PTH1 avec NHERF………………………………………………………………..45
Désensibilisation et internalisation du R-PTH1…………………………………………………..45
Régulation de l’expression du R-PTH1…………………………………………………………….47
R-PTH1 et désordres génétiques……………………………………………………………………48
La chondrodysplasie de Jansen……………………………………………….……………………......48 splasie de Blomstrand…………………………………………………….……………...49
Le Récepteur PTH-2 ou R-PTH2……………………………………………………………………. 49
Structure du R-PTH2 …………………………………..……………………………………………...…50
Profil pharmacologique………….…………………………………………………………………...…..50
Voies de signalisation………………………….…………………………51
Distribution tissulaire et fonctions……….……………………………………………………………....51
Le Récepteur PTH-3 ou R-PTH3…………………………..52
Les Récepteurs hypothétiques pour des fragments de la PTHrP…………………………….53
Le couple PTHrP / R-PTH1 dans le système cardiovasculaire……………………….53
Expression dans le cœur…………………………………………………….……………………….53
Fonctions cardiaques………………………………………………………………….……………...54
Expression dans les vaisseaux………………………………………………………………...…...55
Effets sur la pression artérielle……………………………………………………………………...56
Effets vasorelaxants…………………………………………………………………………………..58
La voie de l’AC/PKA……………………………………………………………………………………....58
La voie PLC/PKC et le calcium intracellulaire…………………………..……………………………...58
La voie NOS/guanylate soluble………………………………………………………………………….59
Effets trophiques de la PTHrP……………………………………………………………………….59
Inhibition autocrine/paracrine de la prolifération des CMLV…………………………………...……..59
Stimulation intracrine de la prolifération des CMLV : ciblage vers le noyau / NLS…………………60
Le système PTHrP / R-PTH1 dans le rein………………………………………….……..61
Expression dans la PTHrP……………………………………………………………………………61
Effets tubulaires …….…………………………………………………………..……………………..61
Effets vasculaires et glomérulaires.……………………………………………………..………....62
Système rénine-angiotensine………………………………………………………………………..64
Le système PTHrP / R-PTH1 en physiopathologie (autre que HTA)………………...65
Insuffisance rénale chronique……………………………………………………………………….65
Insuffisance rénale aigüe…………………………………………………………..……………...…66
Ischémie………………………………………………………………………………………………....66
8Resténose artérielle et athérosclérose…………………………………………………………….66
Pathologies inflammatoires……………………………………………………………………….....67
Régime alimentaire………………………………………….67
Age………………………………………………………………………………..…67
Le système PTHrP / R-PTH1 dans l’HTA…………………………………………..……..71
Le rein dans l’hypertension artérielle………………………………………………………………71
Le rein et la régulation physiologique de la pression artérielle……………………………………….71
Les expériences de transplantations rénales croisées…………………………..71
Le rein, coupable et victime………………………………………………………………………………72
Modèles animaux d’HTA…………………………………………………………………………...…72
Rats spontanéments hypertendus (SHR)…………………………………………………………...….73
Rats DOCA-sel…………………………………………………………………………………………….74
Les altérations hémodynamiques rénales dans l’HTA………………………………………….74
Augmentation de la RVR……………………………………………………………………………...….74
Altération de la natriurèse de pression……………………………………………………………..…..75
Augmentation du rétrocontrôle tubuloglomérulaire………………………………75
Réponse aux vasoconstricteurs et vasodilatateurs : rôle des protéines G et de
l’endothélium………………………………………………………………………………………………76
Hypertrophie / hyperplasie des parois vasculaires rénales…………………………………………..76
Réponse exagérée aux agents mitogènes………………………………………..76
HTA et stress oxydatif……………………………………………………………………...…………78
Origine des ROS vasculaires…………………………………………….79
Régulation des NADPH oxydases par l’Ang II……………………………………………………...….79
Stress oxydatif et Ang II chez le SHR………………………………………………………………...…81
Système rénine-angiotensine rénal chez le SHR…………………...…82
PTH, PTHrP et R-PTH1 dans l’HTA………………………………………………………………….83
Hyperparathyroïdisme primaire et HTA……………………….…………………………………...……83
Parathyroïde et HTA………………………………………...…………….84
Surexpression vasculaire de la PTHrP : Ang II et stretch………………………………………...…..84
Surexpression vasculaire de la PTHrP chez le SHR……………………………………………...…..85
Dérégulation du R-PTH1 chez le SHR……………………………………………………………….…85
PTHrP et prolifération des CMLRv du SHR………………………………………………….…………85
Transfert in vivo du gène du R-PTH1 chez le SHR………………………………86
Objectifs de cette thèse……………………………………………………………….…..…87

CHAPITRE II : Matériel et Méthodes……………………………... 89
Les animaux…………………………………………………………………………………...90
Approches expérimentales in vitro………………………………………………………..90
Le rein isolé perfusé………………………………………………………………………………...…….90
Le lit vasculaire mésentérique isolé perfusé…………………………………………………………...92 in vivo………………………………………………………...93
Hémodynamique rénale et mésentérique : débimétrie électromagnétique……………………...….93
Traitement des SHR par le losartan…………………………………………………………..95
Induction d’une hypertension artérielle DOCA-sel……………………………..…95
Mesure de la pression artérielle par méthode sphygmomanométrique……………….….96
Cultures cellulaires……………………………………………………………….................96
Mise en culture de cellules musculaires lisses rénovasculaires (CMLRv)………………………….96
culturres lisses aortiques (CMLAo)…………………..…..97
9 Protocole de stretch mécanique des cellules…………………………………………………………..97
Effets de l’ANG II et/ou du losartan sur l’expression du R-PTH1……………….97
Stabilité de l’ARNm du R-PTH1…………………………………………………..……………………..98
Transfection des cellules par des constructions P1-luciférase et P2-luciférase…………98
Mesure de l’activité transcriptionnelle des promoteurs P1 et P2………………………………...…..99
Transfection des cellules de souris par la Cre-recombinase………………………………………..100
Techniques biochimiques et biomoléculaires…………………………………….…...100
Isolement des vaisseaux et autres organes…………………………………………………………..100
Evaluation de l’expression de l’ARNm par RT-PCR……………………………………………..…..101
Evaluation de l’expression de la protéine du R-PTH1 par Western blot………………………...…103
Expression des Résultats………………………………………………………………….104

CHAPITRE III : La dérégulation du R-PTH1 : une spécificité
rénale chez le
SHR ?.....................................................................105

Introduction…………………………………………………………………………………..106
Résultats………………………………………………………………………………………107
La diminution, chez le SHR adulte, de la vasodilatation rénale induite par la PTHrP(1-36)
est aussi une réalité in vivo ……………………………………………………..………………..……107
La vasodilatation induite par la PTHrP(1-36) sur le lit vasculaire mésentérique n’est pas
altérée chez le SHR adulte…………………………………………………………………...………..108
La baisse de l’expression du R-PTH1 chez le SHR adulte est une particularité réno-vasculaire108
L’hyporéactivité vasculaire à la PTHrP chez le SHR diffère de celle à l’isoprotérénol…………..109
La réponse vasodilatatrice rénale et l’expression du R-PTH1 ne sont pas modifiés chez le
SHR de 4 semaines………..……………………………………………………………………………110
SHR traitement losartan………………………………………………………………………………...110
Rats DOCA-sel……………………………………..110
Surexpression de la PTHrP……………………………………………………………………………..111
Discussion……………………………………………………………………………………121
Publication (soumise à Hypertension)…………………………………………………….123
« Downregulation of type 1 PTH/PTHrP receptor is not a general feature in the cardiovascular
system in hypertensive rats »

CHAPITRE IV : Mécanismes d’action de l’Ang II dans la
dérégulation du R-PTH1………………………...140

Introduction………………………………………………………………………………......141
Résultats………………………………………………………………………………………142
L’Ang II, via l’activation du récepteur AT1, diminue l’expression du R-PTH1 sur les CMLRv
et les CMLAo…………………………………………………………………………………….……….142
L’Ang II n’affecte pas l’activité des promoteurs P1 et P2 contrôlant la transcription du gène
du R-PTH1 mais diminue la stabilité de son ARNm……………………..…………………………..143

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