UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

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Niveau: Supérieur
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I Année 2004 Thèse n° THESE Présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences de l'Université Louis Pasteur Domaine : Pharmacochimie Soutenue le 28 juin Par MILANE Hadi La quercétine et ses dérivés: molécules à caractère pro- oxydant ou capteurs de radicaux libres; études et applications thérapeutiques. Jury de thèse : Professeur DANGLES OLIVIER Rapporteur externe Professeur EL BACHA RAFIC Rapporteur externe Professeur ANTON ROBERT Rapporteur interne Professeur UBEAUD- SEQUIER GENEVIEVE Directeur de thèse Docteur VANDAMME THIERRY Co-encadreur de thèse Professeur JUNG LOUIS Examinateur

  • hcl acide chlorhydrique

  • sq° radical semiquinone

  • tri-phosphate clhp

  • rafic rapporteur externe

  • flavine-adénosine-dinucléotide

  • professeur ubeaud - sequier

  • nadph nicotinamide-adenine-dinucleotide-phosphate


Publié le : mercredi 30 mai 2012
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
STRASBOURG I
Année 2004 Thèse n°
THESE
Présentée en vue de l’obtention du grade de
Docteur en Sciences
de l’Université Louis Pasteur
Domaine : Pharmacochimie
Soutenue le 28 juin
Par
MILANE Hadi
La quercØtine et ses dØrivØs: molØcules caractŁre pro-
oxydant ou capteurs de radicaux libres; Øtudes et
applications thØrapeutiques.
Jury de thèse :
Professeur DANGLES OLIVIER Rapporteur externe
Professeur EL BACHA RAFIC Rteur externe
Professeur ANTON ROBERT Rapporteur interne
Professeur UBEAUD- SEQUIER GENEVIEVE Directeur de thèse
Docteur VANDAMME THIERRY Co-encadreur de thèse
Professeur JUNG LOUIS ExaminateurJ’adresse mes plus sincères remerciements au
Professeur JUNG LOUIS pour m’avoir ouvert les portes
de son équipe et guidé durant mes années de thèse. Ce
travail témoigne de sa confiance et de son soutien
dans les moments les plus difficiles. Qu’il trouve
ici l’expression de ma reconnaissance et de mon
amitié.
Je tiens également à remercier le Professeur UBEAUD-
SEQUIER GENEVIEVE, sans qui ce travail n’aurait pas
été possible, et avec qui j’ai pu avoir de
passionnantes discussions scientifiques.
J’adresse également mes remerciements au Dr. VANDAMME
THIERRY pour ses conseils fréquents et avisés. Son
esprit de synthèse et son érudition restent pour moi
un exemple à suivre.
Je remercie les Professeurs ANTON ROBERT, DANGLES
OLIVIER et EL-BACHA RAFIC qui m’ont fait l’honneur de
juger ce travail.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance aux professeurs
KOFFEL JEAN-CLAUDE, PABST JEAN-YVES pour m’avoir
accueilli au sein de leur laboratoire.
Un grand merci au Dr ZHAO MIN-JIE pour son aide et
ses conseils, ainsi que pour le temps qu’elle m‘a
consacré dans mes travaux.
Une pensée particulière pour les Drs. INGENBLEEK
YVES, LEIBENGUTH ANTOINE et STAMBACH JEAN-FRANCOIS
pour leur bonne humeur, leur aide et leurs
encouragements.
Je n’oublie pas Monsieur RAHIM et Madame HILPERT pour
leur disponibilité au quotidien.
Je remercie tous les étudiants qui ont contribué de
près ou de loin à la réussite de ce travail en
particulier Mademoiselle AGUILAR BEATRICE et Monsieur
AL-AHMAD ABRAHAM.
2Une pensée pour tous mes amis qui m’ont soutenu au
cours de ces années.
J’e remercie tout l’équipe de l’UMR 7034.
J’adresse, enfin et surtout, ma plus profonde
gratitude et tout mon amour à ma mère, mon père et
mes frères, qui ont su me faire confiance et me
soutenir en toutes circonstances au cours de ces
quatre années à l’étranger.
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN Acide dØsoxyribonuclØique
ADP AdØnosine di-phosphate
AGPI Acides gras polyinsaturØs
AMP AdØnosine mono-phosphate
AMPC AdØnosine mono-phosphate cyclique
ARN Acide ribonuclØique
ATP AdØnosine tri-phosphate
CLHP Chromatographie liquide haute performance
Cyto.C Ferricytochrome C
DIHEQ 4 -7di-(O-hydroxyØthyl) quercØtine
DiHER 4 -7di-(O-hydroxyØthyl) rutine
DMBA 7,12 dimØthylbenz(a)anthracŁne
DMSO DimØthyle sulfoxyde
DMPO 5,5-dimØthyl 1-pyroline N-oxyde
DOS? Radical daunorubicine
-e Electron
EDTA Acide EthylŁne-diamine tØtra-acØtique
FAD Flavine-AdØnosine-DinuclØotide
FADH Flavine-AdØnosine-DinuclØotide, forme rØduite
2 +Fe Ions ferreux
33 +Fe Ions ferriques
FeCl Chlorure de fer3
GSH Glutathion rØduit
GSSG Glutathion oxydØ
+H Proton
HClO Acide hypochloreux
H O Peroxyde d hydrogŁne2 2
HCl Acide chlorhydrique
HETE Acide hydroxyeicosatØtraØno que
HPETEhydroperoxyeicosatØtraØno que
HSP Heat Shock Proteins
IC Concentration 50% dinhibition?50
JDE Jonction dermo-Øpidermique
LDL Low Density Lipoprotein
LH Phospholipidemembranaire
MDA Malondialdehyde
MeOH MØthanol
MonoHEQ 7 mono(O-β-hydroxyØthyl) quercØtine
MonoHERβ-hydroxyØthyl) rutine
NADH Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide
NADPH Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide-Phosphate
NaOH Soude
NBT Bleu de nitrotØtrazolium
NMU N-nitrosomØthylurØe
1O OxygŁne singulet2
O OxygŁne molØculaire2
•−O Anion superoxyde2
•OH Radical hydroxyle
ODC Ornithine dØcarboxylase
PGG /H Prostaglandines G /H2 2 2 2
PLA Phospholipase A2 2
PMC ParamØthoxycinnamate
•ROO Radical peroxyle
4RPE RØsonance paramagnØtique Ølectronique
SQ Radical semiquinone
SOD Superoxyde dismutase
TBA Acide thiobarbiturique
TCA Acide trichloracØtique
TPA 12-0-tØtradØcanoyphorbol-13-acØtate
UV Ultraviolet
VIS Visible
X.O. Xanthine-oxydase
5SOMMAIRE
INTRODUCTION 11
PREMIERE PARTIE
CAPTURE DES RADICAUX HYDROXYLE ET SUPEROXYDE
PAR LES HYDROXYFLAVONES ET LEURS FORMES IONIQUES
CHAPITRE 1 (Rappels Bibliographiques)
Ι- RADICAUX LIBRES OXYGENES 13
I. Radicaux libres oxygØnØs (r les et moyens de dØfenses) 13
I.1. Principaux radicaux libres et leur origine 13
I.1.a Production endogŁne de radicaux libres 14
I.1.b Formation de radicaux libres par voie exogŁne 16
I.2. R le pathogŁne des ra libres 17
I.3. Les moyens de dØfense contre les radicaux libres 19
I.3.a Moyens de dØfense endogŁnes 19
I.3.b Moyens de dØfense exogŁnes : les piØgeurs 21
II. Conclusion 22
ΙΙ- LES FLAVONOˇDES : GENERALITES 23
I. DØcouverte des flavono des 23
II. DiversitØ des composØs phØnoliques 23
II.1. DØfinition 24
II.2. BiosynthŁse 25
II.3. Structure chimique et classification 28
III. Source 29
IV. PropriØtØs des flavono des 31
IV.1. PropriØtØs anti-inflammatoires des flavono des 31
et effets sur le systŁme immunitaire
IV.2. PropriØtØs antivirales et antibactØriennes 31
IV.3. PropriØtØs anti-carcinogŁnes 32
IV.4. PropriØtØs antioxydantes et impact 33
sur la peroxydation lipidique
IV.5. PropriØtØs prooxydantes des flavono des 35
IV.6. BiodisponibilitØ des flavono des 36
V.6.
CHAPITRE 2 (Etudes expØrimentales)
Ι- CAPTURE DE L ANION SUPEROXYDE 37
I. Choix de la mØthode 37
•I.1. SystŁmes de production et de dØtection de l anion (O)37
2
•I.1.a Syroduction de l anion ( O8
2
6•
I.1.b SystŁme de dØtection de l anion ( O)382
I.2. Principe de production et de dØtection 40
du radical superoxyde choisis
II. MatØriels et mØthodes 41
II.1. PrØparation des diffØrentes solutions 41
II.2. Mode opØratoire 41
II.3. ValiditØ de la mØthode 42
II.4. Choix des hydroxyflavones 43
III. RØsultats et discussions 44
ΙΙ- CAPTURE DU RADICAL HYDROXYLE 46
I. Choix de la mØthode 46
I.1. Production et dØtection du radical hydroxyle 46
I.2.a Production du radical hydroxyle 46
I.2.b DØtection du radical hydroxyle 47
I.2. RØaction de Fenton choisie pour Øtudier 48
? l activitØ de capture du OH
I.2.a Production des radicaux hydroxyles 48
I.2.b Principe de dØtection du radical hydroxyle 49
II. MatØriels et mØthodes 51
II.1. MatØriels 51
II.2. PrØparation des solutions 51
II.3. Protocole expØrimental 51
II.4. MolØcule de rØfØrence 52
III. RØsultats et discussions 52
IV. Conclusion 53
ΙΙΙ- ETUDE COMPARATIVE DES DIFFERENTES
HYDROXYFLAVONES APRES DISSOLUTION
PAR LA SOUDE A PH 10 54
I. Introduction 54
II. MatØriels et mØthodes 55
II.1. PrØparation des solutions alcalines
de quercØtine et d autres flavono des 55
II.2. Etude de stabilitØ des flavono des 56
II.2.a Spectroscopie UV/Visible 57
II.2.b Chromatographie liquide 58
III. RØsultats de la capture des radicaux libres oxygØnØs
par les flavono des prØparØs pH 10. 59
III.1. RØsultats de capture de l anion superoxyde 59
III.2. RØsultats de capture du radical hydroxyles 63
IV. Discussions 64
V. Conclusion 65
DEUXIEME PARTIE
SELS SODIQUES DE QUERCETINE
7Ι- SEL MONOSODIQUE, SEL DISODIQUE,
SEL TRISODIQUE DE QUERCETINE 68
I. Introduction 68
I.1. Explication thØorique des diffØrentes 68
aciditØs de la quercØtine
I.2. Exes 70
formes ioniques de la quercØtine
II. Mise en Øvidence de 3 formes anioniques de la 70
quercØtine dans la solution prØparØ pH 10
II.1. VØrification pratique des aciditØs par pH-mŁtrie 70
II.2. Analyse de solution alcaline de quercØtine par CLHP 71
III. PrØparation et propriØtØs physicochimiques des 3 sels de quercØtine 72
III.1. PrØparation des sels de quercØtine partir
des pKas donnØes par Kadykova 72
III.2. PropriØtØs physicochimiques des diffØrents produits
prØcipitØs (sels de quercØtine) 73
III.3. Analyse par spectrophotomØtrie d Ømission 74
de Na des sels de quercØtine isolØs
1III.4. Analyse par H RMN des sels de quercØtine 75
III.5. Analyse par CLHP des sels de quercØtine isolØs
13IV.5. Analys RMN du sel disodique de quercØtine 76
IV. Conclusion 77
ΙΙ- SEL DISODIQUE DE QUERCETINE 78
I. DØtermination de l impact de la prØparation
? diffØrents pH sur la capture du radical OH 78

II. Capture du radical OH par le sel disodique isolØ 79
III. DØtermination de la structure responsable de cette activitØ 79
III.1. SynthŁse de l acide 3,4-dihydroxyphØnylpyruvique 81
III.2. Identification de l acide 3,4-dihydroxyphØnylpyruvique 82
ΙΙΙ.2.a SpectrophotomØtrie d absorption dans l infrarouge 82
ΙΙΙ.2.b Spectroscopie UV / VIS 82
ΙΙΙ.2.c Spectroscopie de rØsonance magnØtique 82
1protonique ( HRMN)
III.3. Etude de la capture du OH 83
IV. Conclusion 83
ΙΙΙ- ParamŁtres physicochimiques liØe l activitØ 84
de capture du radical hydroxyle
I. DØtermination des constantes d aciditØ des molØcules 84
I.1. GØnØralitØs 85
I.2. MatØriels et mØthodes 86
Ι.2.a DØtermination des constantes daciditØ 86
des composØs solubles en milieux aqueux
8
?
? Ι.2.b Appareillage 87Ι.2.c Mode opØratoire 87
Ι.2.d PrØparation des solutions 88Ι.2.e Causes d erreurs et d imprØcision 88
Ι.2.f DØtermination des constantes d aciditØ des 88
composØs peu solubles en milieu aqueux
Ι.2.g MØthode de calcul et dØtermination des pK 89a
I.3. RØsultats 90
II. Relations entre les paramŁtres physicochimiques et 91
l activitØ de capture du radical hydroxyle des dØrivØs phØnoliques.
II.1. Relation entre le pKa et la constante de capture de OH 91
II.2. Effet de la salification sur la constante 92
de capture de radical OH
II.3. Effet de la position d un deuxiŁme groupement 93
hydroxyle phØnolique sur la constante de
capture du radical OH
II.4. Effet de la prØsence dune fonction 94
trŁs acide (carboxylique) sur la constante
de capture du radical OH
II.5. Effet de pKa sur Ks en prØsence de la fonction catØchol 94
III. Conclusion 94
TROISIEME PARTIE
APPLICATION THERAPEUTHIQUE
Ι- Application cutanØe 97
I. GØnØralitØs 98
I.1. Structure histologique de la peau 98
I.2. LØpiderme 98
Ι.2.a Les kØratinocytes de l Øpiderme 98Ι.2.b Les cellules non ØpithØliales de l Øpiderme 99
Ι.2.c Les annexes Øpidermiques 99Ι.2.d La jonction dermo-Øpidermique (JDE) 99
I.3. Le derme 100
Ι.3.a Les fibres 100Ι.3.b La substance fondamentale amorphe 100
Ι.3.c Les cellules rØsidentes du derme 100
I.4. Lhypoderme 101
I.5. Peau et filtre solaire 101
I.6. Peau et radicaux libres 102
I.7. Peau reconstituØe pour l Øtude de biodisponibilitØ cutanØe 102
II. Partie expØrimentale 103
II.1. Formulation de la crŁme 103
ΙΙ.1.a DØfinition des pommades 103ΙΙ.1.b Choix de la forme thØrapeutique 103
ΙΙ.1.c Composition de la crŁme 103ΙΙ.1.d PrØparation de la crŁme 104
9
?
?
?
? ΙΙ.1.e AmØliorations Øventuelles 104
II.2. Etude du sel disodique de quercØtine 105
comme protecteur solaire
ΙΙ.2.a PrØparation des solutions 105ΙΙ.2.b MØthode 105
ΙΙ.2.c RØsultats 105ΙΙ.2.d Conclusion 105
II.3. StabilitØ du sel disodique de quercØtine 105
ΙΙ.3.a PrØparation des solutions 105ΙΙ.3.b MØthode analytique 106
ΙΙ.3.c RØsultats 106
II.4. Validation de la mØthode de dosage selon la SFSTP 107
ΙΙ.4.a But de la validation 107
ΙΙ.4.b CritŁres et Øtude de validation 107
II.5. Etude de la pØnØtration cutanØe 114
ΙΙ.5.a Labsorption percutanØe 114ΙΙ.5.b Choix de la mØthode 116
ΙΙ.5.c Etude de la pØnØtration percutanØe 118
du sel disodique de quercØtine
III. Conclusion 125
ΙΙ- Absorption intestinale 126
I. GØnØralitØs 126
I.1. Rappels sur le tractus intestinal 126
I.2. MØcanismes de passage intestinal d une 127
substance pharmacologique
I.2.a MØcanismes de passage transcellulaire 129
I.2.b smes de passage paracellulaire 131
II. Choix de la mØthode d Øtude de l absorption 132
intestinale du sel disodique de quercØtine
II.1. Description des models expØrimentales 132
d absorption intestinale
II.1.a ModŁles in vivo / ex vivo 132
II.1.b ModŁles in vitro 133
II.2. Conclusion 133
III. Etude expØrimentale 135
III.1. MatØriels et MØthodes 135
ΙΙΙ.1.a ModŁle Caco2 135ΙΙΙ.1.b MØthodes analytiques 137
III.2. RØsultats et Discussions 140
ΙΙΙ.2.a Transport du sel disodique de quercØtine 140ΙΙΙ.2.b Comparaison de l absorption de la quercØtine 143
et du sel disodique de quercØtine
III.3. Conclusion 146
QUATRIEME PARTIE
DISCUSSION GENERALE
10
?

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