ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université de Strasbourg ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE Doctorat de Biologie Rôle des modifications post- traductionnelles des particules virales du CABYV dans la transmission par puceron Sébastien REVOLLON Thèse dirigée par Véronique Brault, Directrice de Recherche Soutenue en février 2010 Jury : Mme Sylvie German-Retana (Chargée de Recherches) Rapporteur M. Emmanuel Jacquot (Chargé de Recherches) Rapporteur M. David Gilmer (Professeur) Rapporteur Mme Sylvie Dinant (Chargée de Recherches) Examinatrice M. Yvan Rahbé (Directeur de Recherches) Examinateur

  • chargée de recherches

  • ecole doctorale des sciences de la vie

  • interactions virus-vecteur

  • protéine de mouvement

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Publié le : lundi 1 février 2010
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 231
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Université de Strasbourg
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE
Doctorat de Biologie
Rôle des modifications post-traductionnelles des particules virales du CABYV dans la transmission par puceron
Sébastien REVOLLON
Thèse dirigée par Véronique Brault, Directrice de Recherche
Soutenue en février 2010
Jury : Mme Sylvie German-Retana (Chargée de Recherches) M. Emmanuel Jacquot (Chargé de Recherches) M. David Gilmer (Professeur) Mme Sylvie Dinant (Chargée de Recherches) M. Yvan Rahbé (Directeur de Recherches)
Rapporteur Rapporteur Rapporteur Examinatrice Examinateur
Remerciements
Par ordre d’apparition : Véronique, Sylvaine, la grande Monique, Cathy, la petite Mo-
nique, Louis, Pascale, Jean, Caroline, Bouchaïb, Baptiste, Caren.
A l’INRA et à la région Alsace qui ont financé ce projet durant ces 3 années.
Et Virginie qui a su m’encourager tout du long.
Table des matières
Introduction Générale.................................................................................................... 1I  Les Polérovirus ................................................................................................................ 2A  Généralités.................................................................................................................... 2B  Symptomatologie et épidémiologie du CABYV.......................................................... 3C  Fonctions des protéines ................................................................................................ 51) La protéine P0 : suppresseur de l’ARN «silencing » ................................................. 52) P1 et P1P2 : réplication............................................................................................. 6a) Domaine protéase............................................................................................................................. 6 b) Domaine VPg .................................................................................................................................. 6 c) Domaine polymérase ....................................................................................................................... 7 d) Domaine hélicase............................................................................................................................. 7 3) P3 : protéine majeure de capside................................................................................ 74) P4 : protéine de mouvement....................................................................................... 85) P5 : protéine de readthrough .................................................................................... 106) Autres protéines : Rap1, P6, P7 ............................................................................... 11II  Les différents modes de transmission par hémiptères chez les virus de plantes.... 12A  Les différents modes de transmission ........................................................................ 12B  Transmission non persistante ..................................................................................... 131) Bromoviridae........................................................................................................... 132) Potyviridae............................................................................................................... 15C  Transmission semipersistante ................................................................................... 161) Caulimoviridae...........................................................1..............6................................2) Closteroviridae......................................................................................................... 17D  Transmission circulante non réplicative..................................................................... 181) Luteoviridae............................................................................................................. 182) Nanoviridae....................................................................................................20..........E  Transmission circulante réplicative ............................................................................ 211) Rhabdoviridae.......................................................................................................... 21F  Protéines d’insectes impliquées dans les interactions virusvecteur .......................... 22III  Rôles des modifications posttraductionnelles chez les virus ................................. 25A  La phosphorylation..................................................................................................... 251) Rôle dans la réplication virale.................................................................................. 262) Rôle dans le mouvement .......................................................................................... 293) Formation de structures spécialisées ........................................................................ 30B  La glycosylation ......................................................................................................... 30
1) Glycosylation de protéines virales de virus enveloppés .......................................... 312) Glycosylation de protéines virales de virus nonenveloppés ................................... 32C  Autres modifications posttraductionnelles................................................................ 33a) TyrosineOsulfation...................................................................................................................... 34 b) Myristoylation et Palmitoylation ................................................................................................... 34 Objectifs de la thèse...................................................................................................... 37Résultats ....................................................................................................................... 39I  Analyse de la glycosylation des protéines de structure des polérovirus ................... 40A  Analyse in silico ......................................................................................................... 40B  Pouvoir infectieux des mutants dans les sites potentiels de Nglycosylation dans les protoplastes et dans les plantes......................................................................................... 411) Analyse de la réplication des mutants dans les protoplastes.................................... 412) Analyse du pouvoir infectieux et de la stabilité des mutants dans les plantes......... 42a) Accumulation des mutants dans les plantes ................................................................................... 42 b) Test de stabilité des particules virales............................................................................................ 43 c) Analyse de la conservation des mutations introduites dans la descendance virale ........................ 45 3) Tests de transmissibilité par pucerons ..................................................................... 45C  Détection des résidus glycosylés sur les protéines de structure des polérovirus par approche biochimique ...................................................................................................... 47D  Détection des glycanes oligomannosidiques et des glycanes complexes sur les protéines de structure des polérovirus .............................................................................. 481) Détection des glycanes oligomannosidiques............................................................ 482) Immunodétection des glycanes complexes .............................................................. 49E  Détection des résidus glycosylés sur les protéines de structure des polérovirus par spectrométrie de masse..................................................................................................... 50II  Analyse de la phosphorylation des protéines de structure des polérovirus............ 52A  Analyse in silico ......................................................................................................... 52B  Détection des résidus phosphorylés sur les protéines de structure des polérovirus par approche biochimique ...................................................................................................... 53C  Détection des résidus phosphorylés sur les protéines de structure des polérovirus par spectrométrie de masse..................................................................................................... 54D  Analyse du comportement des polérovirus dans des plantes affectées dans l’expression des gènes codant pour la sous unité régulatrice de la CK2........................ 551) Evaluation de l’efficacité du VIGS .......................................................................... 562) Accumulation virale dans les plantes silencées ....................................................... 563) Analyse de la transmissibilité .................................................................................. 57III  Rôle de la P90 dans la transmission du CABYV par puceron ............................... 57A  Immunocapture des particules virales avec des anticorps dirigés contre la P90........ 58B  Effet de l’incubation des virons avec les anticorps antiP90 sur la transmission du virus par puceron .............................................................................................................. 59C  Analyse du comportement du CABYV et du TuYV dans le mutant d’insertion de la xy losidase 1 (mutant Bxl1) ........................................................................................... 601) Caractérisation du mutant Bxl1................................................................................ 60
2) Accumulation du CABYV et du TuYV dans le mutant Bxl1 et transmissibilité par puceron à partir des plantes infectées ........................................................................... 60IV  Recherche de partenaires phloémiens du CABYV : rôle des lectines dans le cycle viral et la transmission par puceron ................................................................................. 62A  Etude du comportement des polérovirus dans des mutants d’A. thaliana affectés dans l’expression du gène de l’AtPP2A1............................................................................... 631) Accumulation des virus dans les mutants d’A. thaliana.......................................... 632) Transmissibilité des virus par puceron à partir des mutants d’A. thaliana.............. 64B  Analyse de l’effet de protéines purifiées (autres que les lectines) sur la transmission du CABYV par puceron ................................................................................................... 65C  Devenir des particules virales en présence de l’AtPP2A1....................................... 651) Effet de l’addition d’AtPP2A1 sur l’internalisation des virions dans le puceron . 652) Effet de l’addition d’AtPP2A1 sur l’agrégation des virions ................................. 66V  Résultats complémentaires .......................................................................................... 67A  Mouvement à longue distance des polérovirus dans les plantes : quelle(s) forme(s) virale(s) chemine(nt) dans les tubes criblés ?................................................................... 671) Suivi de l’accumulation de mutants viraux présentant un défaut d’encapsidation .. 68Discussion, Conclusion Générale et Perspectives ...................................................... 70I  Recherche de modifications posttraductionnelles sur les protéines de structure du CABYV : résultats directs et indirects de l’étude ........................................................... 71II  Rôle des protéines de plantes dans la transmission .................................................. 76Matériel et méthodes .................................................................................................... 79I  Matériel .......................................................................................................................... 80A  Milieux de culture ...................................................................................................... 801) Milieu complet Luria Bertani (LB) .......................................................................... 802) Milieu de culture Yeast Extract Broth (YEB).......................................................... 80B  Bactéries ..................................................................................................................... 801)Escherichia coli, souche DH5................................................80................................2)Agrobacterium tumefaciens............................................................ 80, souche C58C1 C  Plasmides.................................................................................................................... 811) Plasmide Bluescript KS ........................................................................................... 812) Plasmide binaire ....................................................................................................... 81D  Virus ........................................................................................................................... 811)Cucurbit aphid borne yellows virus(CABYV) ....................................................... 812)Beet western yellows virus(BWYV) ....................................................................... 82E  Matériel végétal et inoculation des plantes par agroinfection .................................... 821) Arabidopsis thaliana................................................................................................ 822) Montia perfoliata..................................................................................................... 823) Cucumis sativus........................................................................................................ 824) Inoculation des plantes par la technique d’agroinfection......................................... 82F  Pucerons et expériences de transmission .................................................................... 83
1) Myzus persicae......................................................................................................... 832) Aphis gossypii.......................................................................................................... 833) Expériences de transmission par puceron ................................................................ 83a) À partir de plantes agroinfectées.................................................................................................... 83 b) À partir de virus purifié ................................................................................................................. 83 II  Méthodes ....................................................................................................................... 84A  Biologie Moléculaire.................................................................................................. 841) Mutagenèse dirigée sur des fragments d’ADN par la technique de PCR et clonage du fragment mutagénisé dans un vecteur ..................................................................... 84a) PCR................................................................................................................................................ 84 b) Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose .......................................................................... 84 c) Digestion par des enzymes de restriction....................................................................................... 84 d) Purification des fragments d’ADN ................................................................................................ 85 e) Ligation .......................................................................................................................................... 85 f) Transformation de bactéries ........................................................................................................... 85 g) Extraction des plasmides des bactéries recombinantes .................................................................. 85 h) Construction des mutants du CABYV ........................................................................................... 86 B  Protéines ..................................................................................................................... 861) Détection des virus par la technique ELISA ............................................................ 862) Purification de virus à partir de plantes agroinfectées ............................................. 873) Préparation des échantillons de protéines ................................................................ 88a) À partir de protoplastes .................................................................................................................. 88 b) À partir de plantes.......................................................................................................................... 88 4) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDSPAGE) ...................................................................................................................................... 885) Coloration au bleu de Coomassie............................................................................. 886) Western blot ............................................................................................................. 88C  Analyse des acides nucléiques ................................................................................... 891) Extraction d’ARN à partir de protoplastes ou de plants de M. perfoliata................ 892) Extraction d’ARN à partir de concombre ................................................................ 893) Préparation de sondes à ARN marquées à la digoxygénine..................................... 894) Northern blot ............................................................................................................ 905) Test de sensibilité aux RNases................................................................................. 90a) Extraction des ARN totaux ............................................................................................................ 90 b) Extraction des ARN encapsidés..................................................................................................... 91 6) Analyse de la descendance virale par RTPCR ....................................................... 917) qRTPCR.................................................................................................................. 91D  Analyse de la glycosylation ....................................................................................... 921) Par l’utilisation du kit ProQ Emerald....................................................................... 92E  Divers.......................................................................................................................... 921) Analysein silicodes protéines................................................................................. 928) Immunoprécipitation ................................................................................................ 929) ICRTPCR .............................................................................................................. 93
Références .................................................................................................................... 94Annexes ...................................................................................................................... 107I  Article 1 : Phloem protein partners ofCurcurbit aphid borne yellows virus: possible involvement of phloem proteins in virus transmission by aphids (en revision MPMI) ............................................................................................................................................ 108B. Bencharki, S. Boissinot, S. Revollon, V. ZieglerGraff, M. Erdinger, L. Wiss, S. Dinant, D. Renard, M. Beuve , C. LemaitreGuillier, et V. BraultII  Article 2 : A reinvestigation provides no evidence for sugar residues on structural proteins of poleroviruses and argues against a role for glycosylation of virus structural proteins in aphid transmission (soumis Virology)....................................... 108S. Revollon, J.M. Strub, AC. Fitchette, L. Wiss, V. Gomord, A. Van Dorsselaer et V. Brault
Abréviations
ARN : acide ribonucléique ADN : acide désoxyribonucléique BET : bromure d’éthidium BSA : bovine serum albumine CP : protéine de capside DAS: double antibody sandwich dNTP : désoxyribonucléotide triphosphate DRT : domaine de readthrough DO : densité optique DTT : dithiothréitol EC : écart-type EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay g : gramme GSA : glandes salivaires accessoires GFP : green fluorescent protein kb : kilobase kDa : kilodalton KO : knock-out M : molaire MES : acide morpholino-éthane-sulfonique MET : microscopie électronique à transmission MP : protéine de mouvement Min : minute NLS : nuclear localization signal nt : nucléotides ORF : open reading frame, phase ouverte de lecture PAGE : électrophorèse sur gel de polyacrylamide Pb : paires de bases pBin : plasmide binaire PCR : polymerase chain reaction PEG : polyéthylène glycol RNP : ribonucléoprotéique Rpm : rotation par minute RT : protéine de readthrough SDS : sodium dodecyl sulfate Sec : secondes SSC : saline sodium citrate UV : ultraviolet VIGS : virus induced gene silencing V : volt Vol : volume VPg : viral protein genome linked
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