ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR STRASBOURG I ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ THÈSE présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Discipline : Sciences du vivant Domaine : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Sophie JAEGER Étude de la maturation de l'extrémité 3' non traduite et de la traduction de l'ARN messager codant pour l'histone H4 Soutenue le 25 Novembre 2005 devant la commission d'examen : M. Gilbert ERIANI Directeur de Thèse M. Eric WESTHOF Rapporteur interne Mme Christiane BRANLANT Rapporteur externe Mme Annie CAHOUR Rapporteur externe M Richard GIEGE Examinateur

  • préparation d'adn plasmidique de levure

  • manipulation des souches de levures et de bactéries

  • transcription par l'arn polymérase du phage t7

  • manipulation de protéines

  • histones

  • techniques générales de manipulation de l'arn

  • sondage en solution de l'arnm

  • séparation des molécules d'arn sur gel de polyacrylamide


Publié le : mardi 1 novembre 2005
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
STRASBOURG I
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ
THÈSE
présentée
pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
Discipline : Sciences du vivant
Domaine : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie
par
Sophie JAEGER
Étude de la maturation de l’extrémité 3’ non
traduite et de la traduction de l’ARN messager
codant pour l’histone H4
Soutenue le 25 Novembre 2005 devant la commission d’examen :
M. Gilbert ERIANI Directeur de Thèse
M. Eric WESTHOF Rapporteur interne
Mme Christiane BRANLANT Rapporteur externeAnnie CAHOUR
M Richard GIEGE ExaminateurAbréviations.......................................................................................................................... 7
INTRODUCTION................................................................................................................. 9
1 Les histones, des composantes essentielles du nucléosome ......................................... 11
2 Fonctions du nucléosome............................................................................................ 15
2.1 Compaction de l’ADN ............................................................................................................. 15
2.2 Régulation de l’expression du génome, information épigénétique.................................... 15
2.2.1 Ajout de modifications post-traductionnelles sur les histones............................................................16
2.2.1.1 Les différents types de modification des histones.....................................................................17
2.2.1.2 Régulation de l’ajout et du retrait des modifications touchant les histones .............................18
2.2.2 Modifications de la structure et composition du nucléosome.............................................................18
2.2.2.1 Remodelage de la structure du nucléosome dépendant de l’ATP ............................................18
2.2.2.2 Incorporation de variants d’histones..........................................................................................20
2.2.2.2.1 Caractéristiques des variants d’histones...............................................................................20
2.2.2.2.2 Fonctions des variants d’histones, quelques exemples........................................................21
2.2.2.2.3 Régulation de l’expression des variants d’histones .............................................................26
2.2.2.2.4 Incorporation des variants dans les nucléosomes ................................................................26
2.3 Transmission et modulation de l’information épigénétique............................................... 27
2.3.1 Le code histone.....................................................................................................................................27
2.3.2 Héritage de l’information épigénétique ...............................................................................................27
2.3.3 Dynamique de la chromatine ...............................................................................................................28
3 Synthèse des histones majeures et régulation de leur expression................................ 29
3.1 Nécessité d’une régulation de la production des histones................................................... 29
3.2 Régulation de la synthèse d’histones dans la levure et les plantes..................................... 31
3.3 Expression et régulation des gènes réplication-dépendants chez les métazoaires........... 33
3.3.1 Transcription.........................................................................................................................................34
3.3.2 Maturation de l’extrémité 3’ ................................................................................................................37
3.3.2.1 Les différents acteurs de la réaction de maturation...................................................................38
3.3.2.1.1 La snRNP U7.........................................................................................................................38
3.3.2.1.2 La protéine ZFP100...............................................................................................................41
3.3.2.1.3 Le complexe HBP:tige-boucle sur les ARN pré-messagers d’histones..............................41
3.3.2.1.3.1 Les partenaires ..............................................................................................................41
3.3.2.1.3.2 Rôle du complexe HBP:tige-boucle dans la maturation en 3’ ....................................44
3.3.2.1.4 Le site de coupure .................................................................................................................48
3.3.2.2 Lsm11 est-elle responsable de la coupure ? ..............................................................................49
3.3.3 Export de l’ARNm mature du noyau vers le cytoplasme ...................................................................49
13.3.4 Traduction.............................................................................................................................................51
3.3.4.1 Rôle de la protéine HBP dans la traduction...............................................................................51
3.3.4.2 Des études très controversées.....................................................................................................54
3.3.5 Stabilité des ARNm d’histones............................................................................................................55
4 Article 1....................................................................................................................... 57
AVANT-PROPOS DE LA THÈSE ..................................................................................... 67
CHAPITRE 1...................................................................................................................... 71
1 Introduction ................................................................................................................ 73
2 La méthode du triple hybride ...................................................................................... 74
3 Résultats...................................................................................................................... 75
4 Discussion ................................................................................................................... 76
5 Article 2....................................................................................................................... 78
6 Article 3....................................................................................................................... 86
CHAPITRE 2...................................................................................................................... 95
1 Introduction ................................................................................................................ 97
2 Résultats...................................................................................................................... 98
3 Discussion ................................................................................................................. 105
4 Article 4..................................................................................................................... 107
CHAPITRE 3.................................................................................................................... 129
1 Introduction .............................................................................................................. 131
2 Résultats.................................................................................................................... 133
2.1 L’ARNm de l’histone H4 présente un mécanisme de traduction original...................... 133
2.2 Étude de la structure secondaire de l’ARNm de l’histone H4 ......................................... 135
2.3 Identification des éléments structuraux de l’ARNm impliqués dans la traduction ...... 138
2.4 Sondage de l’ARNm en présence de petits ARNs anti-sens.............................................. 139
2.5 Identification de nucléotides impliqués dans la traduction par mutagenèse dirigée .... 140
2.6 Sondage de la structure des ARNm mutés ......................................................................... 141
2.7 Recrutement du ribosome..................................................................................................... 141
22.8 Recrutement de deux ribosomes, cartographie du deuxième site de recrutement........ 142
3 Discussion ................................................................................................................. 144
4 Article 5..................................................................................................................... 149
CONCLUSION ET PERSPECTIVES .............................................................................. 187
MATÉRIEL ET MÉTHODES.......................................................................................... 193
1 Organismes et vecteurs utilisés.................................................................................. 193
1.1 Souche de Saccharomyces cerevisiae.................................................................................... 193
1.2 Souche d’Escherichia coli...................................................................................................... 193
1.3 Vecteurs................................................................................................................................... 193
2 Culture, transformation et manipulation des souches de levures et de bactéries ...... 195
2.1 Culture des cellules ................................................................................................................ 195
2.2 Transformation d’E. coli par électroporation.................................................................... 197
2.3 Transformation de S. cerevisiae ........................................................................................... 197
2.3.1 Transformation à l’acétate de lithium................................................................................................197
2.3.2 Transformation à haute efficacité ......................................................................................................197
2.4 Utilisation du triple hybride ................................................................................................. 198
2.5 Τest en gouttes ........................................................................................................................ 199
3 Tampons et solutions couramment utilisés ............................................................... 199
4 Méthodes relatives à l’étude de l’ADN ...................................................................... 200
4.1 Techniques générales de manipulation de l’ADN.............................................................. 200
4.1.1 Détermination de la concentration de l’ADN....................................................................................200
4.1.2 Précipitation de l’ADN.......................................................................................................................200
4.1.3 Extraction des protéines au phénol ....................................................................................................200
4.1.4 Digestion et modification enzymatique de l’ADN............................................................................200
4.1.4.1 Hydrolyse par les enzymes de restriction ................................................................................200
4.1.4.2 Déphosphorylation des extrémités 5’ des vecteurs linéarisés.................................................201
4.1.4.3 Ligation de fragments d’ADN .................................................................................................201
4.1.5 Séparation et purification de fragments d’ADN................................................................................201
4.1.5.1 Séparation sur gel d’agarose ....................................................................................................201
4.1.5.2 Élution des fragments d’ADN séparés sur gel d’agarose........................................................201
4.1.6 Séquençage automatique ....................................................................................................................202
34.2 Extraction et purification de l’ADN .................................................................................... 202
4.2.1 Minipréparation d’ADN plasmidique par la méthode de la lyse alcaline ........................................202
4.2.2 Préparation à grande échelle d’ADN plasmidique............................................................................202
4.2.3 Préparation d’ADN plasmidique de levure .......................................................................................202
4.2.4 Mutagenèse aléatoire de l’ADN par traitement à l’hydroxylamine..................................................203
5 Méthodes relatives à l’étude de l’ARN ...................................................................... 203
5.1 Techniques générales de manipulation de l’ARN.............................................................. 203
5.1.1 Détermination de la concentration de l’ARN....................................................................................203
5.1.2 Précipitation de l’ARN.......................................................................................................................203
5.2 Séparation des molécules d’ARN sur gel de polyacrylamide dénaturant ...................... 203
5.3 Préparation des molécules d’ARN par transcription in vitro .......................................... 204
5.3.1 Préparation de l’ADN matrice pour la transcription par l’ARN polymérase du phage T7 .............204
5.3.1.1 Clonage d’une matrice par assemblage d’oligonucléotides....................................................205
5.3.1.2 Préparation d’une matrice constituée d’oligonucléotides .......................................................206
5.3.1.3 Obtention d’une matrice à transcrire par amplification par PCR ...........................................206
5.3.2 Transcription par la T7 ARN polymérase .........................................................................................207
5.3.3 Purification des transcrits...................................................................................................................207
5.4 Marquage radioactif de l’ARN ............................................................................................ 207
5.4.1 Marquage de l’extrémité 5’................................................................................................................207
5.4.1.1 Déphosphorylation des extrémités 5’ des transcrits par la BAP.............................................208
5.4.1.2 Marquage de l’extrémité 5’ par la T4 polynucléotide kinase .................................................208
5.4.2 Marquage de l’extrémité 3’ par la T4 ARN ligase............................................................................208
5.5 Purification des transcrits marqués .................................................................................... 209
6 Méthodes relatives à la manipulation de protéines.................................................... 209
6.1.1 Concentration des protéines ...............................................................................................................209
6.1.2 Gels de retardement............................................................................................................................210
7 Méthodes relatives à l’étude de la structure en solution des ARNs et de l’empreinte de
la protéine HBP ................................................................................................................ 211
7.1 Principe ................................................................................................................................... 211
7.2 Les différents sondages.......................................................................................................... 212
7.2.1 Sondage enzymatique.........................................................................................................................212
7.2.2 Sondage au plomb ..............................................................................................................................212
7.2.3 Sondage chimique...............................................................................................................................213
7.2.4 Empreinte en solution de la protéine HBP sur les molécules d’ARN..............................................215
7.2.5 Sondage en solution de l’ARNm bloqué par des ARNs anti-sens....................................................215
47.2.6 Digestion à la RNase H des duplexes ARNm-ARN anti-sens..........................................................215
7.3 Détection des coupures ou modifications obtenues au cours des sondages en solution 216
7.3.1 Détection directe des coupures sur un ARN radioactif.....................................................................216
7.3.2 Détection indirecte des coupures ou modifications par transcription inverse d’un ARN non marqué......217
7.3.2.1 Marquage de l’oligonucléotide amorce pour la détection indirecte218
7.3.2.2 Élongation de l’amorce marquée par transcription inverse ....................................................219
7.3.2.3 Séquençage par transcription inverse ......................................................................................219
7.3.2.4 Hydrolyse alcaline de l’ARN matrice......................................................................................220
Références......................................................................................................................... 221
56Abréviations
3’ UTR : « 3’ UnTranslated Region »
3AT : 3-aminotriazole
A : absorbance à 700 nm700nm 
Amp  : ampicilline
BSA  : albumine de sérum bovin
C-terminal  : carboxy-terminal
DNase : désoxyribonucléase
dNTP  : déoxyribonucléoside triphosphate
DTE  : dithioéritol
DTT  : dithiothréitol
eau milliQ  : eau désionisée et filtrée (Millipore)
HBP  : « Hairpin Binding Protein »
HDE  : « Histone Downstream Element »
HEPES  : acide N-2 hydroxy éthyl pipérazine N’2 éthane sulfonique
IPTG  : isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside
N-terminal  : amino-terminal
PCR  : « Polymerase Chain Reaction »
p/v  : poids à volume
RBD  : « RNA Binding Domain »
RNase : ribonucléase
rpm  : rotation par minute
SDS  : dodécyl sulfate de sodium
SLBP  : « Stem Loop Binding Protein »
TEMED  : N,N,N,N’-tétraméthyl éthylène diamine
Tris  : tris-(hydroxyméthyl) aminométhane
U  : unité
UV  : ultra violet
v/v  : volume à volume
X-Gal  : 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside
78Introduction
INTRODUCTION
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