Ecole Pratique des Hautes Etudes Université de Versailles Saint Quentin en Yvelines

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Ecole Pratique des Hautes Etudes – Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines Thèse présentée pour l'obtention du : Diplôme de Doctorat de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes et de l'Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire Soutenue publiquement le 19 Décembre 2008 par Christine GRANOTIER Née le 23 Août 1972 à Rennes (35) Conséquences d'une atteinte des télomères par un ligand des G-quadruplexes dans des cellules humaines normales et cancéreuses Président du jury : M. le Docteur Andras PALDI Rapporteurs : Mme. le Docteur Sophie BOMBARD M. le Docteur Jozo DELIC Directeur de thèse : M. le Professeur Jean-Luc VAYSSIERE Directeur des recherches : M. le Docteur François BOUSSIN Laboratoire de Génétique et Biologie cellulaire M. Jean-Luc VAYSSIERE UMR8159 CNRS/UVSQ - EPHE 45 avenue des Etats-Unis 78035 Versailles Cedex Laboratoire de RadioPathologie M. François BOUSSIN CEA/DSV/iRCM 18 Route du Panorama 92265 Fontenay-Aux-Roses Cedex umé Les télomères humains contribuent à la régulation des capacités de prolifération des cellules et à la stabilité mosomique en empêchant que les extrémités des chromosomes soient reconnues comme des dommages de DN. Cependant, la protéine kinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) qui joue un rôle crucial dans la nse cellulaire aux dommages de l'ADN participe à la maintenance des télomères.

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Publié le : lundi 1 décembre 2008
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Ecole Pratique des Hautes Etudes – Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines  
Thèse présentée pour l’obtention du : Diplôme de Doctorat de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes et de l’Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire Soutenue publiquement le 19 Décembre 2008  
parChristine GRANOTIER Née le 23 Août 1972 à Rennes (35)  Conséquences d’une atteinte des télomères par un ligand des G-quadruplexes dans des cellules humaines normales et cancéreuses   Président du jury : M. le Docteur Andras PALDI Rapporteurs : Mme. le Docteur Sophie BOMBARD  M. le Docteur Jozo DELIC Directeur de thèse : M. le Professeur Jean-Luc VAYSSIERE Directeur des recherches : M. le Docteur François BOUSSIN     Laboratoire de Génétique et Biologie cellulaire M. Jean-Luc VAYSSIERE UMR8159 CNRS/UVSQ - EPHEv.yal-cuejnafrq.vs@ureiess 45 avenue des Etats-Unis 78035 Versailles Cedex
Laboratoire de RadioPathologie M. François BOUSSIN CEA/DSV/iRCM francois.boussin@cea.fr 18 Route du Panorama 92265 Fontenay-Aux-Roses Cedex
 Les télomères humains contribuent à la régulation des capacités de prolifération des cellules et à la stabilité  en empêchant que les extrémités des chromosomes soient reconnues comme des dommages de  Cependant, la protéine kinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) qui joue un rôle crucial dans l cellulaire aux dommages de l’ADN participe à la maintenance des télomères. Le simple-brin télomérique  in vitro spécialisée dans desstructures G-quadruplexes qui inhibent la télomérase, la transcriptase inverse des télomères et réactivée dans 90 % des cancers. Nous avons donc étudié la localisation intracellulaire  nouveau ligand des G-quadruplexes, ses effets au niveau des télomères et leurs conséquences dans de
humaines normales et cancéreuses.  Par autoradiographie de chromosomes métaphasiques, nous avons démontré la fixation préférentielle du marqué au tritium à l’extrémité des chromosomes des cellules cancéreuses. La présence du ligand au niveau  indépendante de leur taille, apporte un argument majeur en faveur de la formationin vivo G- des dans des cellules humaines cancéreuses.  Nous avons ensuite montré que l’effet anti-prolifératif irréversible du ligand des G-quadruplexes d’un arrêt du cycle cellulaire (en phase S et/ou G2/M), de l’activation d’une réponse aux dommages  dépendante d’ATM et aboutit à une mort cellulaire par apoptose. Si la présence du ligand des G- aux extrémités des chromosomes ne provoque pas de raccourcissement télomérique, elle induit la  de l’extrémité simple-brin. La technique d’hybridation des télomères avec une sonde PNA FISH (Fluorescencein situHybridation) a révélé que le ligand provoquait la formation d’aberrations  surtout pendant ou après la réplication, principalement des fusions de télomères entre chromatides  et des recombinaisons. La technique de CO-FISH (Chromosome Orientation Fluorescencein situ utilisant deux sondes PNA fluorescentes spécifiques des brins G et C télomériques a montré que ces télomériques résultaient préférentiellement d’une atteinte sélective du brin G télomérique matriciel.  Nous avons ensuite montré que la déficience d’ATM accentue l’instabilité télomérique induite par le ligan  G-quadruplexes. L’augmentation du nombre des aberrations télomériques induite par la déficience d’ATM relation avec un défaut de contrôle du cycle cellulaire ou une induction d’apoptose, dévoile le rôle protecteu cette kinase jouerait au niveau des télomères en empêchant une réparation inappropriée et/ou en favorisant la d’une structure protégée. Enfin, nous avons évalué les effets du ligand des G-quadruplexes dans des cellules humaines normales après vérifié que le ligand se fixait bien préférentiellement au niveau de leurs télomères. Même à fortes doses, la du ligand des G-quadruplexes n’induit qu’un ralentissement de la croissance cellulaire, sans augmentation  ni instabilité télomérique dans des cultures primaires de lymphocytes et de fibroblastes normaux nous avons observé l’activation d’un programme réversible de sénescence dans les fibroblastes. Au total, nous avons montré que le ligand provoque la formation d’aberrations télomériques uniquement  les cellules cancéreuses. Les effets du ligand des G-quadruplexes suggèrent que l’organisation et/ou la  aux dommages des télomères différent de manière très significative entre les cellules normales e éreuses. Au final, au-delà de l’intérêt thérapeutique, l’utilisation des ligands des G-quadruplexes télomériques  un outil de choix pour l’étude des télomères et des mécanismes activés dans le cadre d’un télomérique.   s clés: télomère, G-quadruplexe, cellules normales, cellules cancéreuses, ATM
DES MATIERES
TABLE DES MATIERES 3
ABRÉVIATIONS 5
INTRODUCTION 7
GÉNÉRALITÉS 8
1. LES TÉLOMERES 10
1.1 L’ADNTÉLOMÉRIQUE 10 1.2 LES PROTÉINES TÉLOMÉRIQUES 11
1.3 LA STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE DES TÉLOMÈRES EN BOUCLET 14
2. LA TÉLOMÉRASE 15
3. LES RÔLES DES TÉLOMÈRES 16
3.1 LE RÔLE DE PROTECTION DU GÉNOME 16 3.2 EFFET POSITIONNEL SUR LA TRANSCRIPTION 16 3.3 LE RACCOURCISSEMENT TÉLOMÉRIQUE ET LINDUCTION DE LA SÉNESCENCE 17 3.3.1 LE RACCOURCISSEMENT DES TÉLOMÈRES ET LHORLOGE MITOTIQUE 17 3.3.2 LES TÉLOMÈRES INDUISENT LA SÉNESCENCE RÉPLICATIVE 18 3.4 LES TÉLOMÈRES,LA TÉLOMÉRASE ET LONCOGENÈSE 21
4. LA MAINTENANCE DES TÉLOMÈRES 21
4.1 LA RÉPLICATION DES TÉLOMÈRES 22 4.2. L’ÉLONGATION DES TÉLOMÈRES PAR LA TÉLOMÉRASE 24 4.3 LA RÉGULATION DE LA TAILLE DES TÉLOMÈRES 25 4.3.1 LA RÉGULATION DE LA TAILLE DES TÉLOMÈRES LIÉE À LA STRUCTURE 25 4.3.2 LA RÉGULATION DE LA TÉLOMÉRASE 26 4.3.3 LA RÉGULATION DE LA TAILLE DES TÉLOMÈRES PAR LES PROTÉINES TÉLOMÉRIQUES 27 4.3.4 LA RÉGULATION EUÉPÉNIGIQÉT DES TÉLOMÈRES 29 4.3.5 UNE NOUVELLE VOIEARN 29
5. LES MÉCANISMES DE RÉPARATION 30                                                                 
5.1 LE MÉCANISME DE RÉPARATIONNHEJ 31 5.2 LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 32
6. LA SIGNALISATION INTRACELLULAIRE AU NIVEAU DES TÉLOMÈRES 33
6.1 L’INHIBITION DE LA RÉPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADNAU NIVEAU DES TÉLOMÈRES 33 6.2 LE ENTNNEMCTIONOFSYD TÉLOMÉRIQUE INDUIT UNE RÉPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN 34
7 LA RECOMBINAISON DES TELOMERES ET L’INSTABILITÉ CHROMOSOMIQUE 35
7.1 L’INSTABILITÉ TÉLOMÉRIQUE ASSOCIÉE AU MÉCANISMENHEJ 36 7.2 L’INSTABILITÉ TÉLOMÉRIQUE ASSOCIÉE À LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 39 7.3 LA MAINTENANCE DES TÉLOMÈRES PAR DES MÉCANISMES SFITANRETLA 40
8. LA TÉLOMÉRASE ET LES STRATÉGIES ANTICANCÉREUSES 42
9. LES STRATÉGIES ANTICANCÉREUSES QUI CIBLENT LES TÉLOMÈRES 43
9.1 LESG-PUELAURDQSXE 43 9.2 LESG-AUQSEXELPURD TÉLOMÉRIQUES IN VITRO 44 9.3 LESG-QUADRUPLEXES NON-TÉLOMÉRIQUES 45 9.4 LES PROTÉINES CAPABLES DE SE FIXER SUR LESG-ELPURDAUQSXE 47 9.5 LES LIGANDS DESG-ADQUPLRUESEX 48
10. OBJECTIFS DE LA THÈSE 50
BIBLIOGRAPHIE 52
ABRÉVIATIONS  9.1.1 Rad9/Radi1/Hus1 A Adénine ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire ADP Adénosine diphosphate  ALT Alternative Lenthening of Telomeres APB Alternative PML Bodies ARN Acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager AT Syndrome d’Ataxia Telangiectasia ATR ATM Rad3-related protein       ATM Protéine kinase mutée chez les patients atteints d’Ataxia télangiectasie ATP Adénosine triphosphate BLM Protéine hélicase mutée chez les patients atteints du syndrome de Bloom BMVC 3,6-bis 1-methyl-4-vinylpyridium carbazole diiodide C Cytosine CDK Protéine kinase qui interagit avec les cyclines pour permettre le passage dans les différentes phases du cycle cellulaire CO-FISH Chromosome Orientation-FISH DAPI 4’, 6-diamine-2’-phenylindole dihydrochloride DC Dyskératose congénitale due à la mutation de la protéine dyskérine DMSO Dimethylsulfoxyde DP Doublement de population D-loop Diplacement loop DNA-PK DNA-dependent Protein Kinase EBV Epstein Barr Virus ECTR Extra Chromosomal Telomeric Repeat ERCC1/XPF Exicion Repair Cross Complementing 1/Xeroderma Pigmentosum Factor FITC Isothiocyanate de fluorescéine FISH Fluorescence In Situ Hybridization G Guanine G-QN1 G-Quartet Nuclease 1 Gy Gray HIF-1a Hypoxia inductible factor 1a hnRNP heterogeneous nuclear RiboNucleo Protein HPV Human papilloma virus 16 Kb Kilobases KDa Kilodalton MAPK Protéine kinase activées par des agents mitogènes MRE11 Protéine mise en évidence par son implication dans la recombinaison méiotique chez   Saccharomyces cerevisiae NBS1 Protéine mutée chez les patients atteints du syndrome de Nijmengen NHEJ Non Homologous End-Joining NLS Signal de localisation nucléaire PARP Poly(ADP-ribose) polymérase Pb Paire de bases                 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR Polymerase Chain Reaction PHA Phytohemagglutinin PI3-K Protéine kinase phosphatidyl inositol 3 PML Promyelocytic Leukemia PNA Peptid Nucleic Acid POT1 Protection Of Telomere 1
RAP1 Repressor activator protein 1 Rb Protéine mutée chez les patients atteints de rétinoblastome RH Recombinaison Homologue RPA Replication Protein A SA-b-Gal b-galactosidase associée à la sénescence SCE Sister Chromatid Exchange STIR Répétition de motif télomérique dégénéré et intercalée dans les sub-télomères SV40 Simian virus 40 SVF Sérum de veau fœtal T Thymine Tankyrase TRF1-interacting ankyrin related ADP-ribose polymerase TAS Séquence associée aux télomères car peu dégénérée et contenue dans les sub-télomères TEP1 Telomerase Protein component 1 TERT Sous-unité catalytique de la télomérase TI Transcriptase inverse TIF Telomere dysfunction Induced Foci TIN2 TRF1-Interacting Nuclear Factor 2 T-loop Telomeric loop TPE Telomere Position Effect TPP1 TINT1-PIP1-PTOP1 TR Sous-unité ribonucléique de la télomérase TRD Telomere Rapid Deletion TRAP Telomeric Repeat Amplification Protocol TRF1 Telomeric Repeat binding Factor 1 TRF2 Telomeric Repeat binding Factor 2 TRFH TRF homology T-SCE Telomere-SCE UA Unité arbitraire WRN Helicase Werner g-H2AX forme phosphorylée de l’histone H2AX           
INTRODUCTION
GÉNÉRALITÉS  Décris pour la première fois dans les années 1940 par Barbara McClintock, les télomères sont des structures nucléoprotéiques situés à l’extrémité des chromosomes (McClintock, 1939). Constitués de nombreuses répétitions d’une séquence nucléotidique riche en guanine sur lesquelles sont fixées des
protéines spécifiques, les télomères protègent les extrémités des chromosomes des dégradations exonucléotidiques, empêchent les recombinaisons illégitimes par fusion, et empêchent que l’extrémité des chromosomes ne soit reconnue comme une cassure d’ADN double-brin. Parallèlement à ce rôle de gardien de la stabilité chromosomique, les télomères joueraient le rôle d’une horloge mitotique en limitant la capacité de prolifération des cellules.  En effet, en l’absence de mécanisme compensatoire, la taille des télomères de la plupart des cellules somatiques diminue aux cours des divisions cellulaires à cause entre autres des problèmes de réplication des régions terminales des ADN linéaires. L’érosion progressive des télomères des cellules primaires, cultivéesin vitro, observée par Hayflick dès 1961, représenterait la base moléculaire de la sénescence réplicative. Bloquant la prolifération cellulaire, la sénescence réplicative interviendrait au cours du vieillissement et dans la prévention des tumeurs.  La télomérase est une transcriptase inverse spécialisée dans l’élongation des télomères. Fortement réprimée ou peu exprimée dans la plupart des cellules somatiques normales, elle est en revanche exprimée dans les cellules germinales et dans certaines cellules somatiques à forte capacité de prolifération (cellules souches et progéniteurs) ou à fort taux de renouvellement (lymphocytes T) et surtout réactivée dans la grande majorité des cancers. Même si sa réactivation représente une étape nécessaire, mais non suffisante à l'oncogenèse, la télomérase est le marqueur le plus ubiquitaire des cancers. Conférant aux cellules tumorales une capacité de prolifération quasi-illimitée, la télomérase est devenue une cible d’intérêt pour l’élaboration de thérapies antitumorales. Différentes stratégies sont actuellement développées pour inhiber directement la télomérase et par conséquent limiter la croissance ou induire la mort des cellules tumorales.  Parallèlement aux programmes thérapeutiques qui cherchent à cibler directement la télomérase, une autre stratégie consiste à vouloir inhiber son activité enzymatique encisdirectement au niveau des télomères.In vitro, le brin riche en guanines des télomères  d’adopter(brin G) serait en effet capable une structure à quatre brins impliquant des quatuors de guanine (G4 ou G-quadruplexe) dont la stabilisation bloquerait la télomérase. L’utilisation de ligands capables de se fixer sur les G4 télomériques pourrait perturber le bon fonctionnement du système télomère/télomérase. L’idée consistait à penser que les ligands G4 empêcheraient la télomérase de compenser le raccourcissement télomérique qui induirait à terme la mort des cellules tumorales.  Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à participer à la caractérisation des conséquences d’une atteinte des télomères par un ligand des G-quadruplexes. Dans cette optique, : 1) nous avons étudié les effets cellulaires dans des lignées humaines tumorales de plusieurs molécules dérivées de pyridine sélectionnéesin vitro pour ses capacités de fixation sur les G-quadruplexes et d’inhibition de la télomérase, 2) par autoradiographie, nous avons apprécié la localisation intracellulaire d’une de ces molécules (360A marquée au tritium) dans des cellules vivantes humaines normales et cancéreuses, 3) nous avons ensuite cherché à caractériser les effets moléculaires que ce ligand 360A provoque dans des cellules tumorales en évaluant le rôle de la kinase ATM impliquée dans les mécanismes de réparation des dommages de l’ADN,
4) et enfin, nous avons recherché les effets cellulaires induits par ce ligand des G4 dans des cellules humaines normales qui présentent ou pas une activité télomérasique.  Outre les renseignements fournis quant à la possible utilisation des ligands G4 dans le cadre de traitements anticancéreux, l’utilisation de ce type de ligand permet l’étude du rôle, de la régulation des télomères ainsi que les effets et conséquences d’un dysfonctionnement des télomères.
1. LES TÉLOMERES  
1.1 L’ADN télomérique  Les télomères sont constitués d’une région d’ADN double-brin suivie d’une courte extension 3’ simple-brin générée pendant la phase S (Makarov, 1997 ; Hemann, 1999 ; Jacob, 2003). Ils sont formés de répétitions d’une séquence riche en guanines de 5 à 8 paires de bases selon les espèces (Zakian, 1995). Chez l’homme, la séquence télomérique est T2AG3 1988). Le brin porteur de (Moyzis, l’extrémité 3’ simple-brin riche en G est nommé brin G alors que le brin complémentaire riche en C porteur de l’extrémité 5’ est appelé brin C. Chez l’homme, la taille moyenne des télomères d’une cellule somatique (de 5 à 20 Kb) est variable selon l’âge du donneur, l’organe étudié et l’historique prolifératif de la cellule (Wright et Shay, 2005 ; Shay, 2007). La taille de l’extension 3’ simple-brin varie quant à elle, de 60 à 500 nucléotides chez l’homme (Makarov, 1997 ; Wright, 1997 ; Stewart, 2003) et selon les espèces (Chakhparonian et Wellinger, 2003). La taille des télomères varie entre chromosomes d’une même cellule (Lansdorp, 1996), mais aussi d’une lignée cellulaire à l’autre.  En amont des télomères, les régions dites sub-télomériques sont constituées de deux domaines distincts définis par leur position par rapport aux centromères : le domaine proximal et le domaine distal (Wellinger et Sen, 1997). Chez l’homme, la région proximale de 1 à 40 Kb selon les chromosomes contient des répétitions du motif télomérique plus ou moins dégénéré (STIR) (Cheng, 1991 ; Blackburn, 1991) alors que le domaine distal d’une centaine de kilobases (Wellinger et Sen, 1997) contient des séquences télomériques moins dégénérées, appelées séquences associées aux télomères (TAS).  Les régions télomériques ne contiennent aucun gène au contraire des régions sub-télomériques et péri-centromériques qui restent cependant pauvres en gènes. Les régions télomériques et su-b télomériques contiennent des nucléosomes dont l’espacement est légèrement différent de celui des régions non-télomériques (Makarov, 1993 ; Tommerup, 1994). En revanche, les marques épigénétiques, présentes au niveau de l’hétérochromatine péri-centromériques comme la triméthylation des histones H3 sur la lysine 9 « H3K9me » et H4 sur la lysine 20 « H4K20me », le faible niveau d’acétylation des histones H3 et H4 et un enrichissement en HP1 protéine essentielle pour la compaction de la chromatine (Lachner, 2001 ), sont retrouvées au niveau des régions télomériques et sub-télomériques (Baur, 2001 ; Koering, 2002 ; Gonzalo, 2005 et 2006 ; Benetti, 2007 ; Blasco, 2007).  Si la chromatine péri-centromérique est fortement méthylée et que les régions sub-télomériques
peuvent être méthylées, en revanche, les répétitions télomériques TTAGGG ne peuvent être méthylées car elles sont dépourvues de séquences CpG, substrats des ADN méthyltransférases (Steinert, 2004).  1.2 Les protéines télomériques  Chez les mammifères, les protéines télomériques, directement associées à l’ADN télomérique double (TRF1 et TRF2) ou simple-brin (POT1) ou de liaison (RAP1, TIN2 et TPP1), sont regroupées sous la forme d’un complexe : shelterin (de Lange, 2005).  La shelterin protège les télomères, détermine la structure de l’extrémité des télomères et intervient dans la régulation de la taille des télomères en modulant l’accès de la télomérase sur l’extrémité 3’ simple-brin (Stansel, 2001 ; de Lange, 2005 ; Voir chapitre « La régulation de la taille des télomères par les protéines télomérique »).  - TRF1 TRF1 (Telomeric Repeat Factor 1) se fixe spécifiquement sur l’ADN télomérique double-brin télomérique (Zhong, 1992 ; Broccoli, 1997). Elle comporte un domaine N-terminal acide, un domaine spécifique de dimérisation (TRFH – TRF homology), un signal de localisation nucléaire (NLS) qui interagit avec l’importin b1 pour assurer la translocation de TRF1 du cytoplasme vers le noyau et un domaine Myb de fixation de l’ADN double-brin (Fairall, 2001 ; Forwood et Jans, 2002 ; Smith, 1997 ; Bianchi, 1997).  L’analyse de l’interaction entre les télomères et TRF1 a mis en évidence une corrélation entre la taille des télomères et la quantité de protéines TRF1 associées aux télomères (Loayza, 2003 ; Smogorzewska, 2000).  - TRF2 Identifiée comme paralogue de TRF1, TRF2 (Telomeric Repeat Factor 2) présente une architecture similaire à celle de TRF1 (Broccoli, 1997 ; Bilaud, 1997). En effet, TRF2 possède un domaine de dimérisation, un domaine de fixation à l’ADN télomérique et un signal de localisation nucléaire. Alors que TRF1 présente une partie amino-terminale acide, TRF2 présente une extrémité amino-terminale basique. Cette différence empêche donc la formation d’hétérodimère TRF1/TRF2. Comme pour TRF1, la fixation de TRF2 sur les télomères se fait sous la forme d’homodimère (Bianchi, 1997 ; Broccoli, 1997). Pour leur fixation aux télomères, les homodimères de TRF1 et de TRF2 sont donc en compétition (Broccoli, 1997 ; Bilaud, 1997).  La protéine TRF2, exprimée de façon ubiquitaire dans tous les types cellulaires, est nécessaire à la protection et à la stabilisation des télomères (Griffith, 1999). Elle est notamment impliquée dans la régulation de la taille des télomères et surtout dans la formation et le maintien de la structure des télomères en boucle T (Voir chapitre « La structure tridimensionnelle des télomères en boucle T).  - POT1
Elément le plus conservé du shelterin, POT1 (Protection Of Telomere 1) est une protéine télomérique qui se fixe sur la région 3’ simple-brin du télomère (Baumann et Cech, 2001) et à la base de la boucle T (Loayza, 2004). Au niveau de son extrémité C-terminale, se trouve un domaine de reconnaissance à un complexe associé à TRF1, et à son extrémité N-terminale se trouve deux domaines OB (Oligonucléotide/oligosaccharide Binding) de fixation à l’ADN simple-brin qui permettent la reconnaissance spécifique de la séquence télomérique TTAGGGTTAG (Lei, 2004). POT1 assume un rôle de protection de l’extrémité 3’ simple-brin télomérique (Kondo, 2004 ; Hockemeyer, 2005). La protection du télomère assurée par POT1 dépend de sa liaison avec TPP1 (Hockemeyer, 2007) qui assure une connexion entre POT1 et les protéines TRF1 et TRF2 qui sont fixées sur l’ADN télomérique double-brin.  - TIN2 La protéine TIN2 (TRF1 Interacting Nuclear protein 2), identifiée par des expériences de double hybride avec TRF1 (Kim, 1999), interagit avec TRF1, TRF2 et POT1 (O’Connor, 2006). Médiateur essentiel à la formation du complexe shelterin, TIN2 sert de pivot en connectant TPP1/POT1 à TRF1 et à TRF2 ainsi que TRF1 à TRF2 (O’Connor, 2006). Cette connexion à TRF1 et TRF2 contribue à la stabilisation de TRF2 sur les télomères (Liu, 2004 ; Ye, 2004). La déplétion ou l’expression d’un mutant de TIN2 provoquent une destabilisation du shelterin (Kim, 2004 ; e, 2004 ; Palm, 2008). Y Comme le gène codant TRF1, le gène TINF2, qui n'est pas fortement exprimé, est cependant retrouvé dans de nombreux tissus humains (cœur, cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein et pancréas) sous la forme d’un transcrit de 2,4 Kb (Simonsson, 2001). L'expression de TIN2 ne varie ni avec la croissance, ni lors de l'immortalisation ou de la transformation cellulaire.  TPP1 -TPP1 (anciennement TINT1, PTOP ou PIP1) a été découvert comme une protéine interagissant avec TIN2 et POT1 (Houghtaling, 2004 ; O’Connor, 2006 ; Ye, 2004). Sans fixation directe sur l’ADN télomérique maisvia sa fixation sur POT1 et TIN2, TPP1 contribue à stabiliser l’interaction entre TRF1, TIN2 et TRF2 (O’Connor, 2006), favorise l’assemblage du shelterinvia avec interaction son TIN2 (Chen, 2007b) et joue un rôle dans la localisation de POT1 au niveau des télomères (Kim, 2004 ; Houghtaling, 2004 ; Liu, 2004). La liaison TPP1-POT1, augmentant l’affinité de POT1 pour le simple-brin télomérique, paraît essentielle au contrôle que POT1 exerce sur la régulation des télomères et serait nécessaire à la fonction protectrice de l’extrémité télomérique (Xin, 2007 ; Hockemeyer, 2007). L’association entre la télomérase et le domaine OB (Oligonucléotide/oligosaccharide Binding) de TPP1 a permis de mettre en évidence le lien physique existant entre le shelterin et la télomérase (Xin, 2007).  Les protéines TIN2, TPP1 et POT1 sont capables d’interagir entre elles aux niveaux cytoplasmique et nucléaire. TPP1 qui contient un signal de localisation nucléaire contrôle directement la quantité de TPP1 et de POT1 au niveau nucléaire. La liaison TIN2-TPP1 favorise la localisation nucléaire de TPP1 et POT1. Une désorganisation de la localisation nucléaire de TPP1 engendre une réponse aux dommages de l’ADN et une dérégulation de la taille des télomères. Ces résultats mettent en valeur le rôle des interactions cytoplasmiques entre TIN2, TPP1 et POT1 dans la régulation et l’assemblage du shelterin au niveau nucléaire (Chen, 2007b).
 - RAP1  RAP1 (Repressor Activator Protein 1) a été identifiée chez la levure par des expériences de double hybride comme interagissant avec TRF1 et TRF2 (Kim, 1999 ; Li, 2000 et 2003 ; O’Connor, 2006). Bien qu’étant une protéine télomérique, Rap1 ne se fixe pas directement sur l’ADN télomérique.  Mais les protéines télomériques du shelterin ne sont pas les seules présentes au niveau des télomères, elles interagissent avec d’autres voies métaboliques (réparation des dommages de l’ADN, régulation du cycle cellulaire ou induction d’apoptose) qui participent aussi à la maintenance des télomères. La présence de ces facteurs de recombinaison et de réparation de l’ADN au niveau des télomères constitue un paradoxe. En effet, les télomères ont longtemps été considérés comme des structures protégées qui ne devaient pas être reconnues par la machinerie cellulaire de réparation. En fait, une réponse aux dommages de l’ADN, localisée et transitoire, s’avère importante pour la réplication, la protection et la stabilité des télomères. Cette observation souligne la nature complexe de la régulation des télomères.  
1.3 La structure tridimensionnelle des télomères en boucle T  Alors que les télomères ont longtemps été schématisés par une structure linéaire (Greider, 1999), ils sont en réalité capables de former une structure tridimensionnelle mise en évidence par microscopie électronique : la boucle T (boucle Télomérique) due à l’invasion de l’extrémité 3’ simple-brin télomérique dans la région d’ADN télomérique double-brin (Griffith, 1999 ; Greider, 1999). Cette invasion fait qu’une partie de l’ADN télomérique double-brin devient simple-brin, ce qui forme une boucle D (Displacement-loop ou D-loop ). La formation de la boucle T dont la taille varie de 1 à 25 Kb dans les cellules humaines nécessiterait une extrémité 3’ simple-brin télomérique relativement longue (Stansel, 2001). TRF2 qui reconnaît la jonction entre la région d’ADN double-brin et l’extrémité 3’ simple-brin télomérique favorise la formation de la boucle T (Stansel 2001 ; Fouche, 2006a ; Yanez, 2005).  La boucle T qui protège les télomères (Smogorzewska et de Lange, 2004) car elle empêche leur dégradation et la formation de fusions télomériques, participe à la régulation de leur taille en modulant l’accès de la télomérase (de Lange, 2004).  Actuellement, on ne sait pas si la boucle T représente la structure prédominante ou la seule structure qui permet de protéger l’extrémité des chromosomes, ni quelle est la proportion de chromosomes capables d’adopter cette organisation tridimensionnelle. De plus, le brin G télomérique simple-brin serait également susceptible d’adopterin vitroune autre structure tridimensionnelle à quatre brins qui impliquent des quatuors de guanines, G4 ou G-quadruplexes (Neidle et Parkinson, 2003) (Voir chapitre « Les G-quadruplexes »).  Mais le simple-brin télomérique pourrait également se replier, sans envahir l’ADN double-brin télomérique, il serait alors protégé par les protéines POT1-TIN2-TRF1 (Riou, 2005).
 2. LA TÉLOMÉRASE  La télomérase est une transcriptase inverse nucléaire spécialisée dans la synthèse des séquences télomériques à l’extrémité 3’ simple-brin des télomères (Greider, 1990 ; Smogorzewska, 2004 ; Autexier, 2006 ; Collins, 2008). Le complexe télomérasique est constitué d’une sous-unité protéique catalytique TERT (Telomerase Reverse Trancsriptase) et d’une matrice ARN TR (Telomerase RNA template) (Greider, 1987).  - hTERT La sous-unité catalytique humaine, hTERT est une protéine nucléaire de 127 kDa (Kilian, 1997) de la famille des transcriptases inverses. hTERT possède un motif de localisation nucléolaire, un motif T spécifique de la télomérase, plusieurs motifs de transcriptase inverse fortement conservés (1, 2, A, B, C, D, E) et un signal d’exportation nucléolaire (Yang, 2002 ; Weinrich, 1997 ; Lingner, 1997 ; Bachand, 2001a et 2001b ; Seimiya, 2000). L’expression des ARNm codant hTERT qui n’est pas ubiquitaire est strictement corrélée à l’activité télomérasique (Meyerson, 1997 ; Moon, 2007).  - hTR La séquence primaire de la sous-unité ribonucléique de 451 nucléotides (153 kDa) comprend une séquence dite matricielle de 11 nucléotides (5’-CUAACCCUAAC-3’) complémentaire de l’extrémité 3 simple-brin télomérique (Feng, 1995 ; Blasco, 1995). hTR qui est exprimée de façon quasi-ubiquitaire dans les cellules qui présentent ou non une activité télomérasique (Feng, 1995), présente des motifs variables qui modulent son interaction avec hTERT (Chen, 2000). La structure secondaire d’hTR en tiges-boucles (Romero, 1991) est indispensable à la fonction de la télomérase (Autexier, 1998 ; Gilley, 1995 ; Gilley, 1996).  Si, hTERT et hTR sont les deux éléments essentiels pour reconstituer l’activité télomérasiquein vitro (Weinrich, 1997 ; Beattie, 1998 ; Bachand, 1999 ; Feng, 1995 ; Nakamura, 1997), d’autres protéines sont nécessaires à l’assemblage, à la conformation et à la localisation nucléaire du complexe télomérasique (Smorgorzewska, 2004 ; Harrington, 2003 ; Etheridge, 2002 ; Zhu, 2004 ;). En effet, de nombreuses protéines (dyskérine, Est1a, p53, Ku70, Ku80, hnRNP, nucléoline ou les protéines chaperones p23 et p90) s’associeraient au complexe télomérasique (Mitchell, 1999 ; Mochizuki, 2004 ; Chai, 2002 ; Ting, 2005 ; Khurts, 2004 ; Holt, 1999 ; Forsythe, 2001 ; Keppler, 2006 ; Phatak, 2007 ; Cohen, 2007). Est1A/B participerait à la protection du télomère et les protéines chaperones p23 et p90 à l’assemblage du complexe télomérasique. La dyskérine (57 KDa) est une pseudo-uridine synthétase qui permet la stabilisation des molécules d’ARN (Davis, 1995 ; Hoareau-Aveilla, 2008) participerait à la régulation de l’activité télomérasique. La dyskératose congénitale est une maladie génétique rare associée à des mutations dans les gènes codant la dyskérine, hTR et TIN2 (Vulliamy, 2001 ; Marrone, 2005 ; Mason, 2005 ; Savage, 2008) qui provoque une réduction de l’activité télomérasique et un raccourcissement accéléré des télomères (Shay, 2004b ; Knudson, 2005).  Une étude récente par spectomètrie de masse a mis en évidence que la télomérase active (un complexe protéique de 650 à 670 kDa) regrouperait deux dimères constitués chacun d’hTERT, d’hTR
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