FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis Pasteur Strasbourg I THÈSE présentée à la FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Domaine : Biologie Moléculaire et Biochimie Végétale par Alexandre NOIRIEL Étude d'une famille de gènes d'Arabidopsis thaliana homologues de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine. Caractérisation d'une nouvelle phospholipase A1 et étude d'une stérol acyltransferase Soutenue le 2 juillet 2004 devant la Commission d'examen : M Pierre BENVENISTE Directeur de thèse M Francis KARST Rapporteur interne M Alain PUGIN Rapporteur externe M Sten STYMNE Examinateur M Alain ZACHOWSKI Rapporteur externe

  • géranyle géranyle diphosphate

  • famille des acat

  • conséquences marquées de l'activité enzymatique sur le métabolisme lipidique de la levure

  • tentatives de modification de la quantit é d'esters de stérols par surexpression

  • gène

  • lcat humaine


Publié le : jeudi 1 juillet 2004
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Université Louis Pasteur Strasbourg I THÈSE présentée à la FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Domaine : Biologie Moléculaire et Biochimie Végétale par Alexandre NOIRIEL Étude d’une famille de gènes d’Arabidopsis thalianahomologues de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine. Caractérisation d’une nouvelle phospholipase A1 et étude d’une stérol acyltransferase Soutenue le2 juillet 2004devant la Commission d’examen :  M Pierre BENVENISTE Directeur de thèse  M Francis KARST Rapporteur interne  M Alain PUGIN Rapporteur externe  M Sten STYMNE Examinateur  M Alain ZACHOWSKI Rapporteur externe
Je tiens à exprimer ma reconnaissance et mes remerciements à Monsieur Pierre Benveniste pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et qui m’a ainsi permis de réaliser ce travail de thèse Messieurs Karst, Pugin, Stymne et Zachowski pour avoir accepté de juger ce travail Pierrette Bouvier-Navé et Hubert Schaller qui ont guidé mes recherches Jean-Luc Souciet, Claudine Bleykasten-Grosshans et Joseph Schacherer pour leurs conseils avisés concernant la levure Annie Hoeft, Màrta Ramel et Monique Schmitz qui m’ont assisté ainsi qu’à toute l’équipe du laboratoire. Enfin, une pensée particulière à toutes celles et tout ceux qui m’ont supporté (dans les deux sens du terme) durant ces années…
Sciences sans conscience n’est que ruine de l’âme. François Rabelais Celui qui ne connaît pas l'histoire est condamné à la revivre. Karl Marx La célébrité m'a apporté un gros avantage : les femmes qui me disent non sont plus belles qu'autrefois. Woody Allen
Thématique de la thèse
 La quantité de stérols libres est extrêmement régulée dans les membranes. Un moyen utilisé par les plantes pour réguler la teneur en stérols libres est d’estérifier ces stérols excédentaires et de les compartimenter dans des vésicules extramembranaires. L’enzyme qui estérifie les stérols, la stérol acyltransférase, joue donc un rôle majeur dans cette régulation.  Si de nombreux travaux biochimiques ont été consacrés à cette enzyme, le gène (ou les gènes) codant pour la SAT restaient inconnus. Par analogie avec des SAT préalablement caractérisées chez d’autres organismes, Champignons et Mammifères notamment, la SAT végétale pouvait appartenir à la famille des ACAT ou des LCAT. Le séquençage systématique du génome d’A. thalianaa permis de mettre en évidence plusieurs gènes homologues aux ACAT ou aux LCAT. Dans le génome d’A. thaliana,la seule protéine apparentée aux ACAT n’estérifie pas les stérols mais le diacylglycérol pour former un triacyglycérol, cette protéine n’était donc pas la SAT recherchée. Les 4 gènes d’A. thaliana homologues à la LCAT humaine étaient donc des candidats privilégiés pour coder une SAT végétale. Ces 4 gènes AtLCAT1, AtLCAT2, AtLCAT3 et AtLCAT4donc été exprimés ont inlevuro et/ouinplantadans le but de caractériser une SAT végétale.  Un premier chapitre est consacré à l’étude deAtLCAT3dont nous avons montré qu’elle code une phospholipase A1, nous verrons la caractérisation biochimique de cette enzyme à la fonction inattendue, par expression dans la levure. Nous étudierons également les conséquences marquées de l’activité enzymatique sur le métabolisme lipidique de la levure.  Le second chapitre est consacré à l’étude deAtLCAT2qui code une stérol acyltransférase végétale. Nous présenterons les conséquences de la surexpression et de la mutation de cette protéine sur la quantité d’esters de stérolsin planta. Nous étudierons aussi le comportement de ces plantes cultivées dans des conditions où le métabolisme des esters de stérols est affecté.  Enfin le dernier chapitre regroupe les résultats obtenus lors de l’étude deAtLCAT1etAtLCAT4,que les tentatives de modification de la quantité d’esters de stérols par ainsi surexpression d’une SAT fongique. Un essai de clonage de la SAT végétale par complémentation d’un mutant de levure sera également présenté.
Liste des abréviations acylCoA cholestérol acyltransférase acide désoxyribonucléique acide désoxyribonucléique complémentaire acide gras acide gras libre acide ribonucléique acide ribonucléique messager adénosine triphosphate bromure d’éthidium sérum albumine bovine cycle seuil coenzyme A diméthylsulfoxyde désoxyribonucléotide triphosphate densité optique dithioérythritol éthylène diamine tétraacétate diphosphate de farnésyle glycéraldéhyde 3-phosphate géranyle géranyle diphosphate milieu de germination heure lipoprotéine de forte densité 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase diphosphate d’isopentényle Kilo paire de bases Kilo Dalton Knock-out
ACAT ADN ADNcAG AG ARN ARNmATP BET BSA Ct CoA DMSOdNTP D.O. DTE EDTA FPP G3P GGPP GM h HDL HMG CoA HMGR IPP Kb KD KO
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
L LB LCAT LDL LPC ORF pb PC PCR RE RNAse
rpm s SAT SDS TAE TAG TE Tris UV wt X-Gal
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litre milieu de Luria Bertani lécithine cholestérol acyltransférase lipoprotéine de faible densité lysophosphatidylcholine phase ouverte de lecture paire de bases phosphatidylcholine réaction de polymérisation en chaîne réticulum endoplasmique ribonucléase
rotation par minute seconde stérol acyltransférase dodécyl sulfate de sodium tampon tris acétate EDTA triacylglycérol tampon tris EDTA tris-hydroxyméthyl-aminométhane ultra-violet wild-type (« sauvage ») 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside
Liste des figures et tableaux : PageFigure 1: Numérotation du squelette carboné des stérols d’après la nomenclature1 I.U.P.A.C. Figure 2: Structure du noyau hopane et exemple d’hopanoïde.1Figure 3: Structure des principaux stérols des eucaryotes.2Figure 4: Rôle des stérols dans la structuration des membranes plasmiques2Figure 5: Synthèse de l’IPP via la voie MEP5Figure 6: Tronc commun de la biosynthèse des stérols6Figure 7: Schéma de biosynthèse des stérols à partir de l’époxyde de squalène6Figure 8: Métabolisme des stérols7Figure 9: Structure d’une lipoprotéine8Figure 10: Homéostasie du cholestérol chez les Mammifères9Figure 11: Accumulation des esters de stérols dans les stérolosomes12Figure 12: Réaction d’estérification du cholestérol catalysée par acylCoA cholestérol14 acyltransférases (ACAT) et les lécithine cholestérol acyltransférases  (LCAT) Figure 13: Pourcentage d'identité entre les séquences protéiques des LCAT-like20Figure 14: Arbre phylogénétique reliant des protéines apparentées aux LCAT21Figure 15: Alignement entre les séquences de HsLCAT et des 4 LCAT-like22 d’ArabidopsisthalianaFigure 16: Les différents types de phospholipases, sites d’hydrolyse et produits23 formés Figure 17: Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées25 pYeDP60-AtLCAT3Figure 18: Alignement de séquences nucléotidiques entreAtLCAT3et un clone de26 tabac q8487 décrit comme un facteur de transcription chez les plantes
Figure 19: Dosage des TAG de mutants de levures, affectés dans la biosynthèse28 des TAG, transformés pYeDP60-AtLCAT3Figure 20: Détermination par chromatographie gazeuse de la composition en acides29 gras des triglycérides de levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3Figure 21: Western-blot des protéines des fraction microsomales et du surnageant30  100 000g de levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3-Flag Figure 22: Dosage par chromatographie en phase gazeuse des acides gras libérés dans32 les fractions acides gras libres (AGL) et lysophosphatidylcholine (LPC)  après incubation de 1-myritoyl, 2-oleyl phosphatidylcholine. Figure 23: Pourcentage de la radioactivité libérée par AtLCAT3 dans les fractions32  acides gras libres (AGL) et lysophosphatidylcholine (lysoPC) après  incubation de diverses phosphatidylcholines radiomarquées Figure 24: Détermination de la température optimale de AtLCAT3 : mesure de33 l’activité spécifique phospholipase A1 en fonction de la température. Figure 25: Alignement de séquences peptidiques conservées dans la famille des34  LCAT animales et des LCAT-like végétales Figure 26: Mutation d’acides aminés conservés de AtLCAT335 Figure 27: Détermination de la quantité et de la composition des principaux39 métabolites lipidiques de la levure Sc062 transformée pYeDP60-AtLCAT3Figure 28: Chromatogramme des méthyl-esters d'acides gras libres de la levure Sc06240  transformée pYeDP60-AtLCAT3 Figure 29: Incorporation de 14C-acide oléique dans différentes molécules lipidiques41 dans des levures transformées pYeDP60-AtLCAT3. Figure 30: Mesure des activité G3PAT et LPCAT dans des levures Sc06243 transformées pYeDP60-AtLCAT3quantifiées par la mesure de la PC  synthétisée Figure 31: Détermination de l’activité DGAT en fonction de la concentration44 d’acylCoA dans les levures Sc062 transformées pYeDP60-AtLCAT3Figure 32: Corrélation entre l’accumulation de TAG et activité phospholipase A144 dans la levure transformée pYeDP60-AtLCAT3Figure 33: Mesure de l’activité phospholipase et de la quantité de TAG de45 levures Sc062 transformées pVt102U-NtLCAT3Figure 34: Dosage des stérols libres et estérifiés de levure Sc062 transformée46 pYeDP60-AtLCAT3
Figure 35: Voies de biosynthèse des principales classes de lipides47Figure 36: Récapitulatif des principales enzymes de la biosynthèse des lipides chez47 la levure Figure 37: Expression relative des gènes de la synthèse des lipides chez la levure47 Sc062 pYeDP60-AtLCAT3mesurée par PCRq Figure 38: Observation microscopiques de levures transformées pYeDP60-AtLCAT348 Figure 39: Mouvements des acides gras entre les principaux pools de lipides chez50 la levure Sc062 transformée pYeDP60-AtLCAT3Figure 40: Mesure de l’expression du transgène 35S::AtLCAT3, de la quantité d’esters52 de stérols et de TAG dans des transformants primaires de tabac. Figure 41: Mesure de l’activité spécifique phospholipase A dans les microsomes de53 feuillesdes transformants primaires de tabac 35S::AtLCAT3. Figure 42: Mesure de l’expression du transgène 35S::AtLCAT3dans des transformants53 de tabac de génération T2 par PCR quantitative. Figure 43: Mesure de différentes activités acylhydrolases dans les transformants de54 tabac 35::AtLCAT3de génération T2 Figure 44: Détermination de la cinétique d’expression de AtLCAT3 dans différentes56 conditions de stress physiologique d’Arabidopsisthaliana. Figure 45: Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées64 pYeDP60-MtLCAT2Figure 46: Pourcentage de stimulation de la formation d’esters de stérols en fonction66 des stérols libres incubés Figure 47: Analyse d’Arabidopsis transformés 35S ::AtLCAT268Figure 48: Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés70 35S::AtLCAT2cultivés en milieu liquide Figure 49: Composition stérolique des fractions stérols libres et esters d’Arabidopsis70 transformés 35S::AtLCAT2cultivés en milieu liquide Figure 50: Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsis transformés71 35S::AtLCAT2cultivés en serre Figure 51: Composition stérolique de la fraction esters de stérols d’Arabidopsis71 transformés 35S::AtLCAT2cultivés en serre Figure 52: Quantification des stérols libres et esters d’Arabidopsistransformés72 35S::AtLCAT2cultivés sur milieu callogène
Figure 53: Composition stérolique des fractions stérols libres et esters73 d’Arabidopsistransformés 35S::AtLCAT2cultivés sur milieu callogène Figure 54: Phénotype d’Arabidopsis transformés 35S::AtLCAT2cultivés en milieu74 liquide durant 15 jours en présence de différentes concentration de  mévalolactone. Figure 55: Description des lignées de mutants T-DNA dans le gèneAtLCAT278Figure 56: Chromatogrammes de la fraction esters de stérols (saponifiés et acétylés)79 extraite de mutant d’insertion T-DNA dansAtLCAT2. Figure 57: Quantification des stérols libres et esters de mutantAtLCAT2cultivés80 en milieu liquide Figure 58: Composition stérolique de la fraction esters de stérols de mutants80AtLCAT2cultivés en milieu liquide Figure 59: Phénotype d’ArabidopsismutantsAtLCAT2cultivés en milieu liquide82 durant 15 jours en présence de mévalolactone 5mM. Figure 60: Phénotype d’ArabidopsismutantsAtLCAT2cultivés en milieu liquide81 durant 15 jours en présence de différentes concentrations de mévalolactone. Figure 61: Phénotype d’Arabidopsismutants AtLCAT2 cultivés sur milieu solide82 durant 3 semaines en présence de mévalolactone 5mM. Figure 62: Hypothèse sur la régulation de l’estérification des stérols chez87Arabidopsisen présence de mévalolactone (MVL) Figure 63: Analyse d’Arabidopsistransformés 35S::AtLCAT191Figure 64: Analyse de tabac transformés 35S ::AtLCAT1cultivés sur milieu92 callogène Figure 65: Quantité de stérols libres et d’esters de stérols dans des transformants93 primaires d’Arabidopsisécotype WS transformé 35S::AtLCAT1 Figure 66: Dosage des stérols de transformants secondaires d’Arabidopsisécotype94 WS transformé 35S::AtLCAT1 Figure 67: Dosage des stérols de tabac transformés 35S::AtLCAT1cultivés sur95 milieu callogène Figure 68: Description de la lignée EQY127 contenant une insertion T-DNA96 dans le gèneAtLCAT1Figure 69: Criblage d’un mutant T-DNA homozygote par PCR97
Figure 70: Alignement de séquences entre le produit de PCR ‘’TAG5-LC8‘’98 et soit le T-DNA soit le gèneAtLCAT1de la lignée mutante EQY127. Figure 71: Dosage des lipides neutres de levures Sc059 transformées100 pYeDP60-AtLCAT4Figure 72: Mesure par PCR quantitative en temps réel de l’expression relative du103 transgène dans des tabacs SH6 transformés 35S::ScARE2. Figure 73: Mesure de la quantité de stérols de transformants primaires de tabacs SH6104 transformés 35S::ScARE2Figure 74: Pourcentage des différents stérols de la fraction ester de stérols de105 transformants primaires de tabacs transformés 35S::ScARE2. Figure 75: Criblage de la SAT de plante par une technique de shuffling dans107 le triple mutantare1 are2 arv1 Figure 76: Génération d’un triple mutantare1 are2 arv1108Figure 77: Disruption par recombinaison homologue deScarv1par le fragment de109 PCR ‘’arv1Δura3‘’ Figure 78: Préparation d’un fragment de PCR ‘’arv1Δura3‘’ pour la disruption de109Scarv1des amorces UR1 et UR2à partir Figure 79: Vecteur de clonage119Figure 80: Vecteurs d’expression dans la plante119Figure 81: Vecteurs d’expression dans la levure120Figure 82: Séparation des lipides neutres par chromatographie sure couche mince130Tableau A: Optimisation des protocoles de disruption de gène110Tableau B: Représentativité du nombre de colonies obtenues par tétrade, après110 dissection des tétrades de la souche D9R disruptée sur une des deux  copies du gènearv1. Tableau C: Représentativité du nombre de colonies obtenues par tétrade, après110 dissection des tétrades de la souche D9RB62, disruptée sur une des  deux copies du gènearv1et transformée par le plasmide pRS317-ScARE2. Tableau D: Description des programmes de PCR utilisés125
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