L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THESE présentée à L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé en vue de l'obtention du titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Discipline : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Julien BOEUF Caractérisation des GASP, une nouvelle famille de protéines impliquées dans le trafic intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G Soutenue le 21 avril 2008, devant la Commission d'Examen : Dr Stéphane ALLOUCHE (Rapporteur externe) Dr Agnès HÉMAR (Rapporteur externe) Prof. Claire GAVÉRIAUX-RUFF (Rapporteur interne) Dr Frédéric SIMONIN (Directeur de thèse)

  • resensibilisation du récepteur beta2

  • régulation négative des récepteurs

  • ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé

  • conséquences physiologiques de la régulation du trafic intracellulaire des récepteurs

  • trafic intracellulaire


Publié le : mardi 1 avril 2008
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THESE

présentée à
L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

en vue de l’obtention du titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
Discipline : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

par
Julien BOEUF


Caractérisation des GASP, une nouvelle famille de
protéines impliquées dans le trafic intracellulaire
des récepteurs couplés aux protéines G





Soutenue le 21 avril 2008, devant la Commission d’Examen :
Dr Stéphane ALLOUCHE (Rapporteur externe)
Dr Agnès HÉMAR (Rapporteur externe)
Prof. Claire GAVÉRIAUX-RUFF (Rapporteur interne)
Dr Frédéric SIMONIN (Directeur de thèse)



Merci Maman et Papa pour votre confiance et votre soutien

Merci Agnès d’être à mes côtés dans les bons moments comme dans les moments
difficiles. Ton soutien, ta patience et ton optimisme m’ont été précieux.


Merci à Frédéric de m’avoir guidé durant ces années. Merci à Marie-Pierre,
Christophe et toutes les personnes qui ont fait partie de l’équipe à un moment ou
un autre pour leur aide et leur bonne humeur (Isabelle, Guillaume...). Merci à
toute l’équipe « Galzi » et aux autres équipes du département Récepteurs et
Protéines Membranaires pour nos discussions et leurs coups de pouce. Je remercie
également toutes les personnes avec qui nous avons collaboré.


Je tiens à remercier Mesdames Claire Gavériaux-Ruff et Agnès Hémar ainsi que
Monsieur Stéphane Allouche d’avoir accepté de juger mon travail.
Table des Matières


Liste des Tableaux et Figures ...................................................................................I
Abréviations..............................................................................................................III
Version abrégée du projet de thèse...................................................................... VII

I. INTRODUCTION..........................................................................................1

I.1. Les Récepteurs Couplés aux Protéines G ........................................3
I.1.1. Organisation structurale et classification.....................................................4
I.1.2. Les protéines G hétérotrimériques ...............................................................7
I.1.3. Les effecteurs intracellulaires .....................................................................11

I.2. Régulation de l’activité des récepteurs couplés aux
protéines G et trafic intracellulaire ....................................................13
I.2.1. La désensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G.................13
I.2.1.1. Phosphorylation des domaines intracellulaires des récepteurs..........13
I.2.1.2. Le recrutement de l’arrestine..............................................................15
I.2.2. L’internalisation des récepteurs couplés aux protéines G .......................16
I.2.2.1. L’arrestine et la voie des vésicules tapissées de clathrine .................17
I.2.2.2. L’ubiquitinylation.................................................................................19
I.2.2.3. Les motifs d’internalisation .................................................................21
I.2.2.4. L’internalisation tonique......................................................................24
I.2.2.5. Nouveaux mécanismes d’internalisation ............................................24
I.2.3. Quel est le devenir des récepteurs couplés aux protéines G qui ont
été internalisés ?...........................................................................................26
I.2.3.1. L’arrestine dans le trafic intracellulaire des récepteurs couplés
aux protéines G..................................................................................28
I.2.3.2. La resensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G.............30
I.2.3.2.1. Séquences de recyclage et facteurs cytoplasmiques à
domaine PDZ.......................................................................30
I.2.3.2.2. Le facteur cytoplasmique NSF régule la
resensibilisation du récepteur beta2 à l’adrénaline..............33
I.2.3.2.3. Nouvelles séquences impliqués dans la
resensibilisation des récepteurs couplés aux protéines
G..........................................................................................34
I.2.3.3. La régulation négative des récepteurs couplés aux protéines G........37
I.2.3.3.1. Ubiquitinylation et régulation négative des récepteurs
couplés aux protéines G......................................................37
I.2.3.3.2. Les protéines SNX1 et Alix..................................................38 .3. La protéine GASP-1 ............................................................39
I.2.3.3.4. Autres voies de dégradation protéolytique...........................39
I.2.4. Conséquences physiologiques de la régulation du trafic
intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G............................40
I.2.4.1. Système opioïde et tolérance.............................................................40
I.2.4.2cannabinoïde et tolérance ...................................................41
I.2.4.3. L’infarctus du myocarde et les récepteurs beta adrénergiques ..........41

I.3. Les protéines de la famille GASP et leur fonction........................43
I.3.1. Description de la famille...............................................................................43
I.3.2. La protéine GASP-1 ......................................................................................44
I.3.2.1. Interaction avec les récepteurs couplés aux protéines G ...................44
I.3.2.2. La régulation négative des récepteurs par GASP-1 ...........................44
I.3.2.2. Tolérance aux cannabinoïdes ............................................................47
I.3.2.3. Régulation du rythme circadien..........................................................48
I.3.3. GASP-2, maladie de Huntington et cancérogenèse...................................48

I.4. Objectifs des travaux de thèse51

II. RÉSULTATS ET DISCUSSION .............................................................53

II.1. Étude de la relation entre structure et activité des
protéines GASP ........................................................................................55
II.1.1. Introduction ...................................................................................................57
II.1.1.1. Les GASP interagissent in vitro avec le domaine
carboxylterminal des récepteurs couplés aux protéines G ..............................58
II.1.1.1.1. Choix des récepteurs testés ..............................................58
II.1.1.1.2. Choix des protéines GASP étudiées .................................63
II.1.1.2. Justification de l’étude de l’hélice 8 des RCPG et de son rôle
potentiel dans l’interaction avec les GASP.........................................65
II.1.1.3. Caractérisation d’un nouveau motif GASP d’interaction
protéine-protéine ................................................................................67
II.1.1.3.1. Choix des mutants tronqués de GASP-1...........................67
II.1.1.3.2. Mutagenèse dirigée des deux motifs conservés de
GASP-2 .............................................................................69
II.1.1.3.3. Un peptide dérivé du motif GASP peut-il inhiber
l’interaction entre les RCPG et les GASP ?.......................69
II.1.2. Résumé des résultats...................................................................................70
II.1.3. Publications n°1 et 2.....................................................................................73
II.1.4. Éléments de discussion ...............................................................................75
II.1.4.1. La méthode de GST pull-down...........................................................75
II.1.4.2. Un profil d’interaction large entre les GASP et les RCPG ..................77
II.1.4.3. Les GASP : famille et sous-familles ...................................................77
II.1.4.4. L’hélice 8 des RCPG ..........................................................................79
II.1.4.5. Le motif GASP, un nouveau motif d’interaction protéine-protéine......81
II.1.5. Travaux en cours : inhibition de la régulation négative du
récepteur DOR à l’aide du peptide GASP84
II.1.5.1. Choix du modèle cellulaire NG108-15................................................84
II.1.4.2. Translocation du peptide GASP dans les cellules NG108-15 ............84

II.2. Étude du rôle de GASP-1 et GASP-2 sur le trafic
intracellulaire du récepteur muscarinique M ................................87 1
II.2.1. Introduction ...................................................................................................89
II.2.1.1. Le système cholinergique...................................................................89
II.2.1.1.1. Les récepteurs muscariniques...........................................89
II.2.1.1.2. Les effets muscariniques...................................................90
II.2.1.1.3. Les agonistes et antagonistes des récepteurs
muscariniques ...................................................................91
II.2.1.1.4. Régulation de l’activité des récepteurs muscariniques......94
II.2.1.2. Choix du modèle expérimental et des essais .....................................94
II.2.1.3. Imagerie confocale sur cellules vivantes : « linear unmixing » ...........97
II.2.3. Résumé des résultats...................................................................................98
II.2.4. Publication n°3..............................................................................................99
II.2.5. Éléments de discussion .............................................................................101

II.3. Étude du rôle physiologique de GASP-1 chez l’animal ............105
II.3.1. GASP-1 est impliqué dans les réponses comportementales liées à
l’administration de cocaïne........................................................................107
II.3.1.1. Introduction.......................................................................................107
II.3.1.1.1. L’action de la cocaïne sur le circuit de la récompense ....107
II.3.1.1.2. Aspect neurobiologique de l’action de la cocaïne............107
II.3.1.1.2.1. Le système dopaminergique ........................107
II.3.1.1.2.2. Le système cholinergique.............................110
II.3.1.1.3. Problématique : GASP-1 et la stimulation prolongée
des RCPG in vivo ............................................................110
II.3.1.1.4. Les objectifs ....................................................................112
II.3.1.1.5. L’étude des effets comportementaux de la cocaïne ........112
II.3.1.1.5.1. L’autoadministration de cocaïne...................113
II.3.1.1.5.2. La sensibilisation à l’effet
hyperlocomoteur...........................................114
II.3.1.2. Résumé des résultats.......................................................................115
II.3.1.3. Publication n°4 .................................................................................116
II.3.1.4. Éléments de discussion117
II.3.1.4.1. Les effets comportementaux de la cocaïne .....................117
II.3.1.4.2. Les effets biochimiques de la cocaïne au niveau du
striatum............................................................................118
II.3.1.4.3. Existe-t-il un lien entre les réponses
comportementales et les modifications biochimiques
observées........................................................................120
II.3.2. GASP-1 et les rythmes circadiens.............................................................124
II.3.2.1. Introduction : les rythmes circadiens ................................................124
II.3.2.1.1. Les deux composantes des rythmes circadiens ..............124
II.3.2.1.2. L’horloge biologique interne ou système circadien..........125
II.3.2.1.3. Le noyau suprachiasmatique...........................................125
II.3.2.1.4. Les mécanismes intracellulaires des rythmes .................126
II.3.2.2. Problématique et objectifs ................................................................129
II.3.2.3. La mesure des rythmes par actimétrie .............................................130
II.3.2.4. Résultats ..........................................................................................133
II.3.2.4.1. Interaction in vitro de GASP-1 et GASP-2 avec les
protéines Period ..............................................................133
II.3.2.4.2. Colocalisation en contexte cellulaire de GASP-1 et
GASP-2 avec les protéines Period ..................................135
II.3.2.4.3. Variation de l’expression de GASP-1 entre jour et
nuit...................................................................................143
II.3.2.4.4. Influence de GASP-1 sur la régulation des rythmes
circadiens ........................................................................145
II.3.2.5. Éléments de discussion....................................................................151
II.3.2.5.1. Les GASP interagissent avec les protéines Period .........151
II.3.2.5.2. La localisation subcellulaire des protéines Period
dépend de la présence des GASP ..................................151
II.3.2.5.3. GASP-1 et les rythmes circadiens chez la souris ............153

III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...............................................157

IV. MATÉRIEL ET MÉTHODES .................................................................163

IV.1. Biologie moléculaire .............................................................................165
IV.1.1. Les plasmides .............................................................................................165
IV.1.1.1. Les plasmides pcDNA3.1/Néo et Hygro.........................................165
IV.1.1.2. Le plasmide pGEX .........................................................................167
IV.1.2. Les clonages par réaction de polymérisation en chaîne.........................167
IV.1.3. Les souches bactériennes168
®IV.1.3.1. E. coli TOP10 et XL1-Blue : clonage et amplification
plasmidique ....................................................................................168
IV.1.3.2. E. coli Bl21 Rosetta2 : expression de protéines recombinantes.....168
IV.1.4. Préparation de bactéries compétentes et transformation
bactérienne..................................................................................................169
IV.1.5. Amplification plasmidique169
IV.1.6. Stratégies de clonage et de mutagenèse..................................................170
IV.1.6.1. Clonage et mutagenèse des protéines de la famille GASP............170
IV.1.6.1.1. Les ADNc codant pour les protéines GASP ..................170
IV.1.6.1.2. Construction des vecteurs codants pour les mutants
tronqués de GASP-1 et GASP-2 ...................................171
IV.1.6.1.3.
ponctuels de GASP-2....................................................171
IV.1.6.1.4. Construction des vecteurs codants pour GASP-2 et
pour son domaine carboxyl-terminal fusionné à la
GST...............................................................................173
IV.1.6.1.5. Les protéines GASP-1 et GASP-2 fusionnées à
l’EYFP ...........................................................................173
IV.1.6.2. Clonage et mutagenèse dirigée des domaines
carboxylterminaux de RCPG .......................................................................173
IV.1.6.2.1. Les vecteurs codant pour les domaines
carboxylterminaux de RCPG fusionnés à la GST.......................173
IV.1.6.2.2. Mutants ponctuels des domaines
carboxylterminaux des récepteurs δ aux opioïdes et β à 1
l’adrénaline....................................................................175
IV.1.6.2.3. Construction du vecteur codant pour le récepteur
®muscarinique M fusionné à l’étiquette FLAG ..............175 1
IV.1.6.2.4. Le vecteur codant pour le récepteur à
l’acétylcholine muscarinique M1 fusionné à l’EGFP. .....176
IV.1.6.3. Construction des vecteurs codant pour les protéines Period
fusionnées à la mCherry. ...............................................................176
IV.2. Biologie cellulaire ..................................................................................177
IV.2.1. Les cellules de mammifère ........................................................................177
IV.2.1.1. Les cellules CHO ...........................................................................177
IV.2.1.2. Les cellules NG108-15...................................................................178
IV.2.2. Transfection de cellules eucaryotes .........................................................178
IV.2.3. Stabilisation des cellules transfectées : sélection par résistance
aux antibiotiques, tri au FACS179

IV.3. Essai de GST pull down.......................................................................179
IV.3.1. Transcription et traduction in vitro des protéines radiomarquées.........179
IV.3.1.1. Kit de transcription et traduction in vitro .........................................179
35IV.3.1.2. Marquage des protéines à la méthionine [ S] ...............................179
IV.3.2. Production en bactérie des protéines de fusion avec la GST.................180
IV.3.3. Synthèse des peptides GASP ....................................................................181
IV.3.4. Essais de GST pull down : interaction et compétition.............................181
IV.3.4.1. Interaction in vitro des différents partenaires..................................181
IV.3.4.1. Essais de compétition en GST pull down.......................................183
IV.3.4.3. Analyse du surnageant...................................................................183

IV.4. Mesure de liaison spécifique de ligand radioactif......................183
IV.4.1. Les radioligands et ligands........................................................................184
IV.4.1.1. Les radioligands muscariniques .....................................................184
IV.4.1.2. Les ands dopaminergiques.................................................184
IV.4.1.3. Radioligand opioïde........................................................................184
IV.4.1.4. Les ligands .....................................................................................184
IV.4.2. Mesure du nombre de site à l’aide d’une concentration saturante
de ligand radioactif185
IV.4.2.1. Mesure du nombre de sites muscariniques et
dopaminergiques dans différentes structures du cerveau de
souris..............................................................................................187
IV.4.2.2. Mesure du nombre de sites muscariniques dans les lignées
CHO ...............................................................................................188

IV.5. Imagerie en microscopie confocale ................................................188

IV.6. Mesure de la libération de calcium intracellulaire......................189

IV.7. Anticorps primaire dirigé contre GASP-1......................................190
IV.7.1. Production d’anticorps dirigés contre GASP-1........................................190
IV.7.2. Purification des anticorps par chromatographie d’affinité .....................191

IV.8. Modèle murin déficient en protéine GASP-1 ................................191

Références bibliographiques ...............................................................................193

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