MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8

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MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre Mémoire présenté par Aurélie CHRIST pour l'obtention du Diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Recherche et validation fonctionnelle de gènes impliqués dans la remobilisation de l'azote au cours du remplissage du grain chez le maïs Soutenu le 27 octobre 2009 devant le jury suivant : Andréas PALDI Président Jean-Louis PRIOUL Rapporteur Sylvie DINANT Examinatrice Flore RENAUD-PAITRA Tuteur pédagogique Bertrand HIREL Tuteur scientifique Mémoire préparé sous la direction de : M. Bertrand HIREL () Laboratoire de Nutrition Azotée des Plantes – INRA de Versailles Directrice : Mme Françoise DANIEL-VEDELE Et de : Mme Flore RENAUD-PAITRA () Laboratoire de Génétique et de Biologie Cellulaire– EPHE Directeur : M. Bernard MIGNOTTE

  • absorption d'azote après la floraison

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  • validation fonctionnelle de gènes

  • grain

  • gènes candidats dans la détermination des caractères agronomiques

  • remobilisation de l'azote des organes sources vers le grain

  • feuilles sources de maïs cultivés en condition de carence en azote

  • candidat


Publié le : jeudi 1 octobre 2009
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MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre
Mémoire présenté par    Aurélie CHRIST pour l’obtention du Diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes 
    Recherche et validation fonctionnelle de gènes impliqués dans la remobilisation de l’azote au cours du remplissage du grain chez le maïs         Soutenu le 27 octobre 2009 devant le jury suivant : Andréas PALDI Président Jean-Louis PRIOUL Rapporteur Sylvie DINANT Examinatrice Flore RENAUD-PAITRA Tuteur pédagogique Bertrand HIREL Tuteur scientifique   Mémoire préparé sous la direction de : M. Bertrand HIREL (hirel@versailles.inra.fr) Laboratoire de Nutrition Azotée des Plantes – INRA de Versailles Directrice : MmeFrançoise DANIEL-VEDELE   Et de : MmeFlore RENAUD-PAITRA (flore.renaud@uvsq.fr) Laboratoire de Génétique et de Biologie Cellulaire– EPHE Directeur : M. Bernard MIGNOTTE  
 
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre
Aurélie CHRIST
 
  Recherche et validation fonctionnelle de gènes impliqués dans la remobilisation de l’azote au cours du remplissage du grain chez le maïs     Résumé : L’efficacité d’utilisation de l’azote (NUE =Nitrogen Use Efficiency) est un caractère agronomique complexe qui définit l’efficacité avec laquelle l’azote est extrait du sol, métabolisé puis remobilisé vers les grains. La sélection de plantes qui utilisent l’azote de manière plus efficace est aujourd’hui nécessaire pour subvenir aux besoins alimentaires de la population mondiale en constante augmentation, sans nuire à l’environnement. De nombreuses études en agronomie, physiologie et génétique sont menées pour identifier les étapes limitantes de la NUE. Chez le maïs, le remplissage du grain en azote est assuré pour moitié par la remobilisation des protéines foliaires, le reste étant dépendant de l’absorption d’azote après la floraison. En utilisant deux types d’approches, ce projet a permis de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de remobilisation de l’azote au cours du remplissage du grain chez le maïs. Une étude de génétique inverse a permis de valider le rôle du gèneGS1.3codant pour une glutamine synthétase cytosolique (GS1) dans la détermination du rendement en grain. Pour tenter d’identifier de nouveaux gènes candidats impliqués dans la remobilisation de l’azote des organes sources vers le grain, une étude de type transcriptome a été réalisée. Cette approche a permis d’isoler les gènes différentiellement exprimés dans les feuilles sources de maïs cultivés en condition de carence en azote. Les corrélations identifiées entre le niveau d’expression de certains de ces gènes et les teneurs en métabolites représentatifs du métabolisme azoté et carboné confortent l’idée que le stade physiologique, tout comme l’environnement de la plante, influence fortement des réseaux de gènes, impliqués dans chacune des étapes de développement ou lors de la réponse aux stress. De plus, la détection de co-localisations entre certains gènes et des QTL (Quantitative trait lociliés à la NUE et au rendement ouvrent de nouvelles pistes pour la) validation de nouveaux gènes candidats impliqués dans l’assimilation et la remobilisation de l’azote. En associant leur fonction et leur expression tissulaire et développementale, il sera possible d’étudier l’implication de ces gènes candidats dans la détermination des caractères agronomiques et physiologiques mis en évidence par les études de génétique quantitative.  Mots clés : maïs, efficacité d’utilisation de l’azote (NUE), transition source/puits, gènes candidats, QTL, glutamine synthétase, métabolisme azoté, rendement.   
Sommaire
Sommaire INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE........................................................................................ 1 1. L’EFFICACITÉ DUTILISATION DE LAZOTE........................................................................ 1 2. LA PHOTOSYNTHÈSE........................................................................................................... 2 3. L’ AZOTEASSIMILATION DE L............................................................................................. 3 3.1 L’absorption de l’azote .......................................................................................................... 3 3.2 La réduction du nitrate ........................................................................................................... 4 3.3 L’assimilation de l’ammonium .............................................................................................. 4 3.3.1 La glutamine synthétase ............................................................................................................ 5 3.3.2 La glutamate synthase............................................................................................................... 6 3.3.3 La glutamate déshydrogénase................................................................................................... 7 4. LE MÉTABOLISME DE LAZOTE ET SA RÉGULATION........................................................... 8 4.1 Le métabolisme des principaux acides aminés ...................................................................... 8 4.1.1 L’aspartate aminotransférase ................................................................................................... 8 4.1.2 L’alanine aminotransférase ...................................................................................................... 8 4.1.3 L’asparagine synthétase............................................................................................................ 9 4.1.4 La synthèse de proline............................................................................................................. 10 4.2 Les régulateurs du métabolisme azoté ................................................................................. 10 5. LA REMOBILISATION DE LAZOTE..................................................................................... 12 5.1 L’efficacité de remobilisation .............................................................................................. 12 5.2 La protéolyse........................................................................................................................ 13 5.3 Le métabolisme de l’azote au cours de la transition source/puits ........................................ 15 6. BASES GÉNÉTIQUES DE LEFFICACITÉ DUTILISATION ET DE REMOBILISATION DE LAZOTE................................................................................................................................. 16 7. OBJECTIFS DU TRAVAIL..................................................................................................... 18 BIBLIOGRAPHIE..................................................................................................................... 20 
  
Liste des abréviations utilisées  Liste des Abréviations   ADN acide désoxyribonucléique N azote ADNc i ue NH4+d’ammonium acide désoxyribonuclé q NiR nitrite réductase complémentaire Ala alanine nm nanomètre AlaAT alanine aminotransférase NO2 nitrite NO3- nitrate ARN acide ribonucléique NR nitrate réductase AS asparagine synthétase ara NUENitrogen Use Efficiency Asn asp gine (Efficacité d’utilisation de Asp aspartate AspAT aspartate aminotransférase l’azote) P5CS 1-pyrroline-5-carboxylate ATG autophagie ATP adénosine t ate synthétase BET  bromure dréitphihdoisupmh  pb, Kb  paire de bases, kilobases BSAbovine serum albumine PCRPolymerase Chain Reaction C carbone (réaction de polymérisation CO2 chaîne) dioxyde de carbone en PEPc phosphoénolpyruvate CTAB bromure de cétyltriméthylammonium carboxylase Pro proline Da, kDa dalton, kilo dalton DEPC diéthyl-pyrocarbonate quantitative en temps qPCR PCR dNTP d réel tréioxynucléotides QTL  Quantitative trait loci DO  depnhsiotsép ohpattieqs ue RFLP  Restriction Fragment Length EDTA éthylène diamine tétra-hpromyloPism acétique RILs (Rliegcnoémesb irneacnotmIbmibnraendt eLs)i nes ESTExpressed Sequence Tag FJ feuille jeune ROSReactive Oxygen Species FS feuille sénescente (agents oxydants) g, mg, µg grammes, milligrammes, rpm rotations par minutes microgrammes RT (Rtreavnesrcsrei ptrtiaonns cinrivpetrisoen) GDH glutamate déshydrogénase Gln  glutamine Rubisco  ribublose l1a,s5e--boixsypghéonpahsaet e Glu glutamate car oxy Gly glycine SAG (Sgeènneessc eanscseo cAsss oàcliaa ted Gene GOGAT glutamate synthase sénescence) GS glutamine synthétase SDS sodium dodécylphosphate GS1 GS cytosolique GS2  GS plastidiale  SSeSr A   saécriidnee  sulfosalicylique h, mn, s heures, minutes, secondes JAF  jours après la floraison  SSSSCH    itracSdsiebs pSruopnnilas etradnats  JAP jours après pollinisation vetiactrudirby KCN cyanure de potassiumH ization L, ml, µl litre, millilitre, microlitre TAE tris acétate EDTA LiCl chlorure de lithium Thr thréonine M, mM, µM molaire (moles.L-1 U), milli unité enzymatique molaire, micro molaire UV ultra violet Mu élément transposableMutator    
Introduction bibliographique
1. L’efficacité d’utilisation de l’azote
Introduction bibliographique
L’azote (N) est un élément essentiel à la croissance des plantes. Il est présent dans le sol sous forme de nitrate (NO3-) et d’ammonium (NH4+), mais rarement en quantité suffisante pour assurer un rendement optimal. Depuis quarante ans, l’utilisation massive d’engrais azotés associée à l’apparition de nouvelles variétés de riz, de blé et de maïs et la modernisation des systèmes d’irrigation ont permis de doubler les rendements agricoles sans trop augmenter les surfaces cultivées. Cette intensification de l’agriculture a entraîné des pollutions environnementales au niveau des sols et de l’eau, notamment par infiltration des engrais dans les nappes phréatiques et les eaux de surface. Aujourd’hui, ces effets nocifs pour l’environnement et la santé humaine ne sont plus négligés. C’est pourquoi les objectifs agronomiques actuels visent à satisfaire les besoins alimentaires de la population mondiale en constante augmentation, en améliorant les rendements, sans nuire à l’environnement (Dyson, 1999). Il est pour cela nécessaire d’identifier les étapes limitantes dans l’assimilation, la gestion et la remobilisation de l’N par les plantes pour permettre une valorisation efficace de celui-ci tout en maintenant une forte teneur en protéines dans les organes récoltables (Hirel al. et, 2007). L’efficacité avec laquelle l’N est extrait du sol, métabolisé, transporté puis stocké dans les grains représente un paramètre agronomique : l’efficacité d’utilisation de l’azote (NUE =Nitrogen Use Efficiency).   La NUE est définie par le rapport entre le rendement obtenu et la dose d’N apportée (Goodet al., 2004). Elle peut être divisée en deux composantes : l’efficacité d’absorption (= capacité à extraire l’N du sol sous forme de NO3- d’NH et4+) et l’efficacité d’utilisation (= capacité à métaboliser et remobiliser l’N pour produire suffisamment de grains). L’efficacité d’absorptionest un paramètre important dans la détermination du de l’N rendement car elle conditionne la quantité d’N qui pourra être remobilisé lors du remplissage du grain. Chez le maïs, entre 35 et 55 % de l’N contenu dans le grain est absorbé après la floraison. L’efficacité d’utilisationreprésente quant à elle la capacité de la plante à métaboliser et àde l’N remobiliser l’N pour permettre la croissance végétative et l’exportation de l’N vers les organes en formation. Chez le maïs, la majorité de l’N du grain provient de la remobilisation des protéines foliaires (environ 60 %). Selon les espèces ou le génotype considéré, la part d’N remobilisé vers les organes puits (jeunes feuilles, grains) est variable et influencée par les conditions environnementales comme le niveau de fertilisation azotée (Hirelet al., 2001).
 
Introduction bibliographique
Les chapitres suivants présentent les différentes étapes permettant l’assimilation de l’N par les plantes, depuis l’absorption de l’N inorganique du sol, jusqu’à son incorporation dans les composés organiques et sa remobilisation. La figure 1 résume ces différentes étapes de réduction et d’assimilation de l’azote ainsi que le métabolisme des principaux acides aminés au niveau foliaire. Un bref rappel sur le mécanisme de la photosynthèse débute cette introduction.
2. La photosynthèse
Les végétaux sont autotrophes pour le carbone. Le processus de photosynthèse leur permet de transformer l’énergie lumineuse en matière. Ils sont capables, grâce à cette énergie, de synthétiser des sucres à partir du dioxyde de carbone (CO2) de l’air et d’eau puisée dans le sol. La feuille est un organe spécialisé dont la fonction principale est la photosynthèse. Elle est constituée de limbe et de vaisseaux conducteurs regroupés sous forme de nervures. Le limbe est le tissu photosynthétique proprement dit. Les nervures relient, via le pétiole, les tissus conducteurs de sève (xylème et phloème), des feuilles au système de circulation de la plante. Le xylème assure l’alimentation en eau et éléments minéraux absorbés du sol par les racines (sève brute). Le phloème permet l’exportation des photosynthétats solubles (essentiellement des sucres) (sève élaborée) vers les puits (organes en développement dont l’activité photosynthétique n’est pas suffisante). Le phloème est constitué de tubes criblés (cellules vivantes allongées, dépourvues de noyau et de plastes et dont les parois possèdent des pores) associés à des cellules compagnes du phloème qui, de part leurs fonctions métaboliques, permettent d’alimenter les cellules du tube criblé (Farineau and Morot-Gaudry, 2006a). Les chloroplastes sont des organites présents dans le cytoplasme des cellules végétales. Ils sont indispensables à la photosynthèse. Grâce à la chlorophylle qu’ils contiennent, ils sont capables de capter la lumière pour la transformer en énergie chimique sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) (Farineau and Morot-Gaudry, 2006a). Le cycle de Calvin est une succession de réactions biochimiques qui permettent la réduction et l’incorporation du CO2atmosphérique dans des molécules organiques. Il existe trois mécanismes de fixation du CO2par leur efficacité. Le nombre de carbones, qui se différencient que possède la première molécule organique formée lors de la fixation du CO2 de permet déterminer le type de photosynthèse des plantes. Le mécanisme en C3 correspond au mécanisme de base et il est le plus répandu au sein du règne végétal (plantes vertes, arbres). Les types C4 et CAM sont des adaptations aux climats secs (Farineau and Morot-Gaudry, 2006b). L’enzyme clé du cycle de Calvin est la ribulose 1,5-bisphophate carboxylase-oxygénase (Rubisco). Chez les plantes à photosynthèse de type C3, cette enzyme catalyse la fixation du CO2 
 
Introduction bibliographique
sur le ribulose 1,5-bisphophate pour donner deux molécules d’acide 3-phosphoglycérique (APG) qui est un composé à trois atomes de carbone. La Rubisco est également capable de catalyser une réaction à partir de dioxygène (O2) au lieu du CO2, c’est la photorespiration. Ce processus entraîne une diminution du taux de photosynthèse. Pour éviter la photorespiration, il est nécessaire d’augmenter la pression partielle en CO2autour de la Rubisco (Farineau and Morot-Gaudry, 2006b). Chez les plantes à photosynthèse de type C4, le CO2 assimilé par la est phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPc) dans un composé à quatre atomes de carbone (oxaloacétate puis malate). Cette réaction a lieu dans les cellules du mésophylle (assise cellulaire située entre les nervures). L’acide dicarboxylique (à quatre atomes de carbone) formé est ensuite transféré en grande quantité dans les cellules de la gaine périvasculaire. Une enzyme libère le CO2qui se trouve donc concentré dans ces cellules où il est pris en charge par la Rubisco, selon le mécanisme des plantes en C3. Les plantes en C4 sont principalement des graminées tropicales (maïs, sorgho, canne à sucre) chez lesquelles la photorespiration est très faible du fait de la compartimentation et de l’enrichissement en CO2(Farineau and Morot-Gaudry, 2006c). Les plantes grasses comme les cactus, possèdent une photosynthèse de type CAM (métabolisme acide crassulacéen). Comme les plantes en C4, elles possèdent deux enzymes fixatrices de CO2(PEPc et Rubisco). Mais la séparation des réactions n’est pas spatiale (cellules du mésophylle/cellules de la gaine périvasculaire), mais temporelle (jour/nuit). La nuit, les stomates sont ouverts, permettant la fixation du CO2dans une molécule de malate qui est stocké dans la vacuole. La journée, ce malate est retransformé en CO2pour alimenter le cycle de Calvin. Ainsi, les stomates peuvent rester fermés la journée pour éviter les pertes d’eau par transpiration sans altérer l’apport en CO2(Farineau and Morot-Gaudry, 2006c).
3. L’assimilation de l’azote
3.1 L’absorption de l’azote
L’assimilation de l’N inorganique et son incorporation dans des squelettes carbonés a une influence sur la production de biomasse et le rendement en grains des plantes. De nombreuses études ont été menées afin de comprendre le rôle des différents acteurs de l’assimilation de l’N. Elles ont montré que les gènes impliqués dans ce processus sont fortement régulés par des facteurs internes (espèce, type cellulaire, métabolites…) et environnementaux (lumière, température…) . L’N est absorbé au niveau des racines majoritairement sous forme de NO3-, et dans une moindre mesure sous forme d’NH4+. Des transporteurs spécifiques à haute ou basse
 
Introduction bibliographique
affinité assurent l’absorption de ces deux formes d’N inorganique (Glass et al., 2002; Orsel et al., 2002).
3.2 La réduction du nitrate
Une fois absorbé, le NO3-peut être stocké dans la vacuole ou métabolisé dans les cellules racinaires ou foliaires après y avoir été exporté. Pour pouvoir être métabolisé, le NO3-doit tout d’abord être réduit en NH4+. Cette réduction a lieu en deux étapes. La première a lieu dans le cytoplasme et est catalysée par la nitrate réductase (NR) qui assure la réduction du NO3- en nitrite (NO2-). La seconde permet de réduire le NO2- en NH4+ au cours de la réaction catalysée par la nitrite réductase (NiR), localisée dans le chloroplaste. L’hypothèse selon laquelle l’étape limitante dans l’assimilation du NO3-celle catalysée par la NR a longtemps été avancée.  serait Des programmes de sélection, entre autre chez le maïs, ont été mis en place pour isoler des génotypes possédant une forte activité NR. Mais aucune des variétés à forte activité NR sélectionnée n’a présentée une augmentation de rendement (Andrewset al., 2004).
3.3 L’assimilation de l’ammonium
L’NH4+est directement absorbé ou provient de la réduction des nitrates. Il est également produit chez les plantes par de nombreuses voies métaboliques comme la photorespiration, la synthèse de lignine (constituant des parois cellulaires) ou la dégradation des protéines. L’NH4+ est assimilé ou réassimilé par le cycle glutamine synthétase (GS)/ glutamate synthase (GOGAT). La GS incorpore l’NH4+ glutamate pour former de la glutamine. La GOGAT catalyse la au conversion de glutamine et d’-cétoglutarate en deux molécules de glutamate. La glutamine et le glutamate servent ensuite de donneurs de groupement amines pour la synthèse d’autres composés azotés tels que les autres acides aminés et les nucléotides. Au cours de la photorespiration, la Rubisco est oxygénée par l’O2 induisant ainsi la production de phosphoglycolate. Celui-ci est converti séquentiellement dans le chloroplaste, le peroxysome et la mitochondrie en glycine, sérine et NH4+(Farineau and Morot-Gaudry, 2006b). Chez les plantes à photosynthèse de type C3, la quantité d’NH4+issu de la photorespiration est dix fois supérieure à celui issu de l’assimilation primaire de l’N (Oaks, 1994). Ce type de plantes doit donc être capable de le réassimiler en glutamate et glutamine pour éviter une accumulation toxique de cet NH4+. En revanche, chez les plantes à photosynthèse de type C4, la compartimentation des étapes de fixation du CO2 fortement l’activité oxygénase de la réduit
 
Introduction bibliographique
Rubisco ce qui limite de manière significative la production d’NH4+photorespiratoire (Lea and Ireland, 1999). Au cours du développement des plantes, deux étapes sont remarquables par la quantité d’NH4+ en glutamate et glutamine (Lam réassimilé et al., 1996). La première a lieu durant la germination lorsque les protéines de la graine sont dégradées pour permettre le transport de glutamine vers la plantule en développement. La seconde apparaît au cours de la sénescence lorsque les protéines sont dégradées dans les feuilles sources pour permettre le transport de glutamine vers les organes en développement tels que les grains. Les enzymes impliquées dans l’assimilation et la réassimilation de l’NH4+, GS/GOGAT, mais aussi la glutamate déshydrogénase (GDH), voient donc leur activité modifiée et induite en fonction des différents stades de développement et des conditions environnementales (Hirel and Lea, 2001).
3.3.1 La glutamine synthétase Il existe deux formes de glutamine synthétase (GS), une cytosolique (GS1) codée par une famille multigénique chez la plupart des plantes et une plastidiale (GS2) codée par un seul gène. La GS2, forme prédominante dans les feuilles, est impliquée dans l’assimilation primaire de l’NH4+et le recyclage de l’NH4+photorespiratoire. La GS1 surtout présente dans les racines, est plutôt impliquée dans la remobilisation de l’N des organes sources. Chez les plantes de type C4, comme le maïs, la compartimentation des différentes réactions photosynthétiques implique un niveau très faible de photorespiration. L’NH4+ photorespiratoire est donc produit en très faible quantité. Ainsi, chez ce type de plantes, la GS1 est l’isoenzyme majoritaire tout au long du développement de la plante. Chez le maïs, il existe cinq isoformes de GS cytosoliques codées par cinq gènes distincts et différentiellement exprimés dans tous les tissus ce qui suggère qu’ils n’ont certainement pas tous le même rôle dans la remobilisation de l’N. Le gèneGS1.2 est principalement exprimé dans le tissu vasculaire. Les gènesGS1.1 etGS1.5 exprimés au sont niveau racinaire. Alors que les gènesGS1.3 etGS1.4 plus constitutivement exprimés dans sont tous les tissus (Liet al., 1993). De nombreuses études ont été réalisées pour mieux comprendre le rôle de la GS en utilisant des plantes mutantes ou surexprimant une des isoformes de cette enzyme. Chez le lotier, des mutants de la photorespiration ont été isolés et présentent une déficience en GS plastidiale (GS2). Ces mutants sont viables uniquement sous atmosphère enrichie en CO2de stress dû à une accumulation d’NH. Ils montrent des symptômes 4+lorsqu’ils sont transférés sous atmosphère « normale ». Ceci prouve l’importance de l’isoforme plastidiale dans le recyclage de l’N photorespiratoire. Le développement quasi normal de ces mutants sous
 
Introduction bibliographique
atmosphère enrichie en CO2que cette forme n’est pas essentielle à également  indique l’assimilation primaire de l’NH4+ (Orea et al., 2002). Toujours chez le lotier, la surexpression d’un gène GS1 de soja provoque une augmentation des teneurs en NH4+et en acides aminés dans les racines, malgré une assimilation réduite d’NH4+. Les auteurs expliquent que cette augmentation des teneurs en NH4+aminés dans les racines est due à la dégradationet en acides des protéines foliaires. La surexpression de la GS1 dans les feuilles accélèrerait le développement et induirait l’entrée en sénescence (Vincent al. et, 1997). Chez des lotiers surexprimant le gène GS1 de luzerne, des résultats semblables ont été décrits. Les transformants présentent une augmentation de biomasse et accumulent des protéines et des acides aminés, en particulier de l’aspartate, de l’asparagine et de la proline (Ortegaet al., 2004). Chez le tabac, la surexpression d’un gèneGS1 permetégalement d’augmenter la biomasse, le contenu en protéines foliaires et l’activité photosynthétique, surtout en condition de nutrition azotée limitante. Cet accroissement de biomasse serait dû à un meilleur recyclage de l’NH4+ photorespiratoire plutôt qu’à une meilleure utilisation de l’N (Fuenteset al., 2001; Oliveiraet al., 2002). Il a récemment été montré que la mutation d’un des gènesGS1 (OsGS1.1), chez le riz provoque un sévère retard de croissance et affecte également le remplissage des grains. De plus, ce gène a été localisé dans les cellules compagnes du phloème, lui suggérant un rôle dans la remobilisation de l’N via la synthèse de glutamine et son chargement dans le phloème (Tabuchi et al.le maïs deux lignées mutantes pour les gènes, 2005). Chez GS1.3 etGS1.4, ainsi que le double mutantGS1.3/GS1.4, présentent également une réduction importante de leur rendement. Le phénotype du mutantGS1.3est une réduction du nombre de grains, alors que le mutantGS1.4 présente une diminution de la taille des grains. Le gèneGS1.3 exprimé dans les cellules du est mésophylle et de façon constitutive tout au long du développement. Le gèneGS1.4est localisé dans les cellules de la gaine périvasculaire et son expression est augmentée au cours du vieillissement (Martinet al., 2006).
3.3.2 La glutamate synthase La glutamate synthase (GOGAT) est présente sous deux formes, la première utilise la ferrédoxine comme donneur d’électrons, l’autre est dépendante du NADH (Fd- et NADH-GOGAT). La Fd-GOGAT représente 95% de l’activité GOGAT dans les feuilles. Elle est codée par deux gènes aux rôles bien distincts,GLU1etGLU2. Le premier, GLU1, est majoritairement exprimé, il prédomine largement dans les feuilles et est induit par la lumière et les sucres. Le second, GLU2, est plus exprimé dans les racines. L’étude de mutants photorespiratoires déficients pour le gèneGLU1de démontrer l’importance de la Fd-GOGAT dans la a permis réassimilation de l’NH4+photorespiratoire et l’assimilation primaire de l’N. Ce gène pourrait agir  
Introduction bibliographique
de concert avec la glutamine synthétase chloroplastique (GS2) (Coschigano al. et, 1998). L’activité NADH-GOGAT est bien plus faible que l’activité Fd-GOGAT. La NADH-GOGAT est codée par un seul gèneGLT1, surtout exprimé dans les racines, le tissu vasculaire et les grains comme les GS cytosoliques (GS1.1,GS1.2 etGS1.5) et le gèneGLU2 la Fd- codant GOGAT (Hayakawaet al., 1994). Des mutants nuls pourGLT1présentent une baisse drastique des teneurs en glutamate et sont incapables d’assimiler l’NH4+ non-photorespiratoire sous atmosphère enrichie en CO2le rôle de cette forme NADH-dépendante dans. Ceci démontre l’assimilation de l’N réduit. Le couple GS1/NADH-GOGAT pourrait jouer un rôle important dans le recyclage de l’N dans les tissus vasculaires des feuilles sénescentes (Lancien al. et, 2002).
3.3.3 La glutamate déshydrogénase Avant la mise en évidence du cycle GS/GOGAT, la glutamate déshydrogénase (GDH) a + longtemps été considérée comme la principale enzyme assimilant l’NH4. La GDH, sous la dépendance du NAD(H), catalyse la réaction réversible qui désamine le glutamate en NH4+et-cétoglutarate, ou inversement associe ces deux molécules pour former du glutamate. Des expériences de marquage isotopique avec de l’NH4+marqué au15N ainsi que l’étude des mutants déficients pour la GS ou la GOGAT, ont montré que la GDH joue un rôle négligeable dans l’assimilation de l’NH4+ comparaison avec le cycle GS/GOGAT (Hirel and Lea, 2001). De par telles expériences ont aussi permis de démontrer que la GDHin vivo, désamine le glutamate pour produire de l’-cétoglutarate et alimenter le cycle de Kreps et par conséquent, qu’elle n’assimile pas l’NH4+(Duboiset al., 2003). L’activité de cette enzyme est induite par l’NH4+, au cours de la sénescence foliaire et lors d’une carence en sucres (Masclaux al. et, 2000). L’enzyme est préférentiellement localisée dans les mitochondries du tissu vasculaire. Mais il a été montré qu’au cours de la sénescence ou lorsque les plantes sont cultivées sur NH4+comme seule source d’N, la protéine est également présente dans le cytosol de ces cellules (Dubois al. et, 2003; Terce-Laforgueet al., 2004). Malgré de nombreuses études pour tenter de comprendre le rôle de la GDH au cours de l’assimilation et la remobilisation du C et de l’N, sa fonction n’est pas encore clairement définie. Sa présence dans le tissu vasculaire suggère qu’elle aurait plutôt un rôle de senseur du statut azoté et carboné de la plante. De plus, son activité est régulée par de nombreux signaux, tels que la concentration en NH4+et en composés carbonés, le stress hydrique ou la toxicité des métaux lourds, ce qui conforte le rôle de senseur de l’enzyme en fonction des conditions environnementales (Loulakakiset al., 2009).
 
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