Modulation de l'activité d'ovocyte par un régime calcique artificiel initiant des altérations de la méthylation de l'ADN et du développement chez la souris

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE Ecole Pratique des Hautes Etudes Section : Sciences de la Vie et de la Terre THÈSE de DOCTORAT Discipline : Biologie du développement TÓTH Szabolcs Modulation de l'activité d'ovocyte par un régime calcique artificiel initiant des altérations de la méthylation de l'ADN et du développement chez la souris Directeur de thèse : Dr. András Páldi Soutenue le 19 décembre 2005 Membres du jury : Dr. Bernard Mignotte Dr. Brigitte Lefevre Dr. Xavier Vignon Dr. Andras Paldi Dr. Jean-Pierre Ozil Responsable EPHE : Dr. Andras Paldi, GENETHON, 1bis, rue de l'internationale BP 60 - 91002 Evry cedex – France, Laboratoire du stage : Pulse-ions, INRA, BDR, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, – France directeur du labo : Dr. Jean-Pierre Ozil, EPHE Banque de Monographies SVT 1

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Publié le : jeudi 1 décembre 2005
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  Ecole Pratique des Hautes Etudes Section : Sciences de la Vie et de la Terre THÈSE de DOCTORAT Discipline : Biologie du développement   TÓTH Szabolcs Modulation de l’activité d’ovocyte par un régime calcique artificiel initiant des altérations de la méthylation de l’ADN et du développement chez la souris   Directeur de thèse : Dr. András Páldi Soutenue le 19 décembre 2005  Membres du jury : Dr. Bernard Mignotte Dr. Brigitte Lefevre Dr. Xavier Vignon  Dr. Andras Paldi  Dr. Jean-Pierre Ozil                                            Responsable EPHE : Dr. Andras Paldi, GENETHON, 1bis, rue de l'internationale BP 60 - 91002 Evry cedex – France,paldi@genethon.fr  Laboratoire du stage : Pulse-ions, INRA, BDR, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, – France directeur du labo : Dr. Jean-Pierre Ozil,rra.fy.inj@uozoli
Présentation des laboratoires et remerciements Pour cette thèseles laboratoires d’accueilsont : INRA, Jouy en Josas, BDR, Labo Pulse- ions Responsable de laboratoire : Dr. Jean-Pierre OZIL Daniel HUNEAU Christian OUALI Dr. Bernadette BANREZES Eugenie CANON   Institut Jacques Monod, Responsable de laboratoire : Dr. Andras PALDI   Mezőgazdasági Biotechnolόgiai Központ (Centre de Biotechnologie d’Agriculture), Gödöllő, Laboratoire Biotechnologie Animale Responsable de laboratoire : Dr. BŐSZE Zsuzsanna  Remerciements exceptionnels á : Daniel Huneau et Iman Tóth-Ben Sliman  également à : Dr. Antoine KERJEAN Thomas HEAMS Dr. Takuya IMAMURA  Supportsde travail en France : Bourse du Gouvernement Français et Bourse de l’INRA Bourse bilaterale du Gouvernement Français et Hongrois (TET F-34/04)
Modulation of oocyte activation by artificial calcium regime initiates alterations in DNA methylation and in embryonic development in the mouse Abstract The discovery of the role of the chromatin reorganization in the nucleus transfer experiments redefined the concepts of the embryonic development regulation. It is surprising that, after its transfer
in an oocyte before activation, the complete epigenetic reprogramming of a somatic nucleus in mammalians is also possible. This reprogramming is produced only by the oocyte cytoplasm, it is carried out during oocyte activation and it lasts until implantation. However, there have been great difficulties in highlighting the correlations between oocyte activation, the early molecular modifications and later phenotypical changes. Working hypothesis: piloting of oocyte activation makes it possible to modify the epigenetic The reprogramming and the long-term development and also it helps to understand the processes behind the phenotypical changes.In the first approachof this project, we activated freshly ovulated mouse oocytes by various calcium signals induced by repetitive electropermeabilisations. The series of calcium regimes was assumed to highlight the role of the amplitude, duration and the frequency of the calcium signals in oocyte activation. The analysis of the methylation of the genes Igf2r and H19 in parthenogenetic embryos was used to evaluate the effects of calcium oscillations on epigenetic changes.In the second approachof the project we replaced the calcium signals of the fertilization, in vivo and in vitro, by artificially modulated signals. The aim was to study the long-term effects of the activation signals by the benefits of the zygotes’ developmental potential. (1) The thesis shows that oocyte activation can be controlled by the modulation of the cytoplasmic concentration of Ca2+ as well in fertilized oocytes as in non-fertilized ones. (2) We show alterations in the dynamics of chromatin reorganization and the existence of epigenetic changes dependent on activation. (3) Using a new method, which makes it possible to modulate the calcium signals of fertilization, this work shows remarkable differences on the level of the postimplantion development initiated by modification of the oocyte activation. (4) We also show that the majority of the developmental defects appear shortly after the implantation. (5) We established a system which, by the piloting of oocyte activation, makes it possible to modify the embryonic development in a reproducible way. This work offers a new platform for the molecular analysis in order to study the mechanism of the reprogramming process.  Key words: Oocyte activation, Epigenetic reprogrammation, Totipotency, Chromatin remodelling, Pronucleus reorganization, DNA methylation, Parthenogenesis, Fertilization, Embryonic development, Calcium, Microfluidic processor, Mouse
Résumé La découverte du rôle de la réorganisation globale de la chromatine dans les expériences de transfert de noyau a redéfini les concepts de la régulation du développement embryonnaire. Par ailleurs, il est surprenant de constater que la reprogrammation épigénétique d’un noyau somatique de mammifère est aussi possible après son transfert dans un ovocyte avant qu’il ne soit activé. Cette reprogrammation est produite uniquement par le cytoplasme de l’ovocyte et se réalise pendant et juste après l’activation ovocytaire. Cependant, il y a aujourd’hui de grandes difficultés à mettre en évidence les corrélations entre l’activation ovocytaire, les changements moléculaires précoces et les conséquences sur le développement. Hypothèse de travail : nouvelle possibilité de Le pilotage de l’activation ovocytaire peut offrir une modifier la ‘reprogrammation épigénétique’ et le développement à long terme et de comprendre ainsi les processus sous-jacents et leurs relations.Dans la première approche de ce projet, nous avons activé des ovocytes fraîchement ovulés de souris par différents signaux calciques induits par des électroperméabilisations répétitives. La série de régimes calciques a été conçue pour mettre en évidence le rôle de l’amplitude, la durée et la fréquence des signaux calciques dans l’activation ovocytaire. L’analyse de la méthylation des gènes Igf2r et H19 dans les embryons parthénogénétiques servira pour évaluer l’hypothèse que les oscillations calciques peuvent induire des altérations épigénétiques.Dans la deuxième approchedu projet, nous avons remplacé les signaux calciques de la fécondation (in vivoetin vitro) par des signaux modulés artificiellement, dans le but d’étudier les effets à long terme des signaux d’activation en profitant du potentiel de développement des zygotes. (1)La thèse démontre que l’activation ovocytaire peut être pilotée par la modulation de la
concentration cytosolique du Ca2+aussi bien dans les ovocytes fécondés que non fécondés.(2)Nous montrons l’altération de la dynamique de réorganisation de la chromatine et l’existence de changements épigénétiques dépendants de l’activation.(3) l’aide d’une nouvelle méthode qui A permet de moduler les signaux calciques de la fécondation, ce travail démontre des différences remarquables au niveau du développement postimplantatoire initiées par l’altération du régime d’activation.(4)  Nous semontrons également que la majorité des défauts de développement manifestent peu après l’implantation.(5)Nous avons établi un système qui permet (par le pilotage de l’activation ovocytaire) de modifier le développement embryonnaire d’une manière reproductible. Ce travail offre une nouvelle plateforme pour les analyses moléculaires afin d’étudier le mécanisme du processus de reprogrammation.  Mots clés : Activation Ovocytaire, Reprogrammation épigénétique, Réorganisation du noyau, Totipotence, Remodelage de chromatine, Méthylation de l’ADN, Parthénogenèse, Fécondation, Développement embryonnaire, Calcium, Processeur microfluidique, Souris
Table des matières Abrévations  6 I. Introduction  7 I. 1. Activation ovocytaire : le début de la vie 8 I. 1.1. Le régime calcique de la fécondation 9 I. 1.2. Activation artificielle et calcium 13 I. 2. Un événement énigmatique de la période de l'activation : la réorganisation de la chromatine  22 I. 2.1. La découverte de l’empreinte parentale 23 I. 2.2. Clonage et parthénogenèse réussies chez les mammifères 24 I. 2.3. Comment se réalise la réorganisation de la chromatine? 26 I. 2.4. Le marquage épigénétique pendant le cycle de la reproduction 29 I. 2.5. Les marquages épigénétiques et l’empreinte parentale 30 I. 2.6. Les événements nucléaires des premières heures du développement 32 I. 2.7. Les applications pratiques : parthénogenèse, FIV et clonage 34 I. 3. Stratégie de travail 35                             References 37  
Abréviations
 AM/FM : modulation en amplitude et fréquence ARNm :ARN messager [Ca2+]iintracellulaire d’ion calcique libre (se trouvant dans la cytosol): concentration CaMKII : kinase II dépendant de calmoduline Cellule ES : cellule souche (Embryonic Stem cell) CICR : libération de Ca2+induite par le Ca2+(Calcium Induced Calcium Release ) CpG : cytosine- guanine nucleotide-pair Embryon J8 : embryon au 8ème jour à partir de la fécondation ou l’activation artificielle FIV : FécondationIn Vitro GP : globule polaire       H19-DMR : région différemment méthylé (Differentially Methylated Region) du gène H19 hCG : chorio- gonadotrophine humaine ICM : l’origine des tissues embryonnaires (Inner Cell Mass) Igf2-R2 : Région 2 de gène ‘Insulin like Growth Factor 2 Receptorîlot CpG : positionnement des CpG dinucléotides dans les clusters i.p. : intrapéritonéale  IP3 : inositol 1, 4, 5- triphosphate IP3R : récepteur de l’inositol 1, 4, 5- triphosphate MPF :mitosis promotion factor Ovocyte MII : ovocyte en stade métaphase II (deuxième métaphase de la méiose) Ovocyte MIII : ovocyte en stade ‘métaphase III’, un stade bloqué en développement, après la cytokinesis, mais avant la décondensation des chromosomes PCC : condensation prématurée de chromosome (Premature Chromosome Condensation) phCG : post-hCG PMSG : sérum gonadotrophine du cheval prégnant (Pregnant Mare Serum Gonadotrophine) PN : pronoyau (pronucleus) PG : cellule germinaux primordieux (Primordial Germ cells) RE : Reticulum Endoplasmique SOCs : canaux contrôlés par les réserves(Store Operated Channels) Stade 2C : stade 2 cellule TE : l’origine des tissus extra- embryonnaires (odctmerTrhEop)  
I.          Introduction
Le succès du clonage des mammifères à partir d’une cellule somatique a détruit définitivement le dogme selon lequel les changements moléculaires de la chromatine qui mènent à la différenciation
des cellules sont irréversibles chez les mammifères. Car il est possible de reformater entièrement l’activité du génome d’un noyau différencié en l’introduisant dans un ovocyte avant qu’il ne soit activé. Cette propriété extraordinaire du cytoplasme de l’ovocyte est mise en jeu pendant la période de l'activation ovocytaire. Après la fécondation, un facteur du spermatozoïde provoque dans l’ovocyte une série d’augmentations fortes de la concentration intracellulaire d’ion calcique libre ([Ca2+]i), ces signaux lui permettent de sortir de la deuxième métaphase méiotique (MII) et d’initier le développement embryonnaire (Kline et Kline, 1992a). Il existe plusieurs moyens d’induire artificiellement des changements de [Ca2+]i calciques l’ovocyte, sans l’intervention du gamète mâle. Les signaux dans artificiels sont aussi capables d’activer l’ovocyte et d’initier un développement plus ou moins long chez les embryons parthénogénétiques ou reconstitués. D’après des observations récentes, le succès du développement est fortement lié au processus de la reprogrammation. Ces transformations peuvent affecter tous les types de chromatine dans l'ovocyte, c'est-à-dire les chromatines maternelle et paternelle, mais également la chromatine des noyaux somatiques introduits dans l'ovocyte. La question des mécanismes qui assurent cette plasticité remarquable reste ouverte, elle comprend trois éléments : -       Quels sont les marquages moléculaires sur la chromatine qui déterminent la la totipotence, pluripotence ou l’unipotence d’un noyau ? -       Comment l’œuf est-il capable d’effacer et de réécrire ces marquages moléculaires assurant un développement réussi? -        ouQuels changements moléculaires de chromatine sont préfèrables, non préfèrables inacceptables pour le développement long terme ? Concernant la première question, plusieurs modifications de la chromatine (méthylation de l’ADN, acétylation, méthylation des histones, etc.) sont déjà connues, elles sont capables d’altérer l’activation d’une région génomique. Certaines d’entre elles se manifestent durant cette période très précoce du développement (p.e. déméthylation et reméthylation de l’ADN). Par contre, nous avons très peu d’information sur la seconde question, le mécanisme de ces transformations moléculaires dans l’ovocyte. Aujourd’hui, le seul indicateur fiable du niveau de reprogrammation après une telle intervention, est le succcès du développement. Mais, il est difficile de mettre en évidence les relations entre les manipulations expérimentales, les modifications moléculaires et ses conséquences sur le développement, car les résultats des manipulations embryonnaires situées dans la période de reprogrammation, sont aléatoires.  Selon les observations précédentes,d’une part, par un régime calcique artificiel, il est possible de moduler l'activation ovocytaire (Ozil et Swann, 1995) et, d’autre part, l'activation ovocytaire peut modifier le développement embryonnaire (Ozil et Huneau, 2001). Ma principale interrogation basée sur ces deux observations, est de vérifier si le pilotage de l'activation ovocytaire par des signaux calciques peut constituer un nouveau moyen de modifier le processus de ‘reprogrammation épigénétique' et par conséquent celui du développement
embryonnaire. Le but de nos expériences est d’induire des altérations caractéristiques du développement de la souris de façon reproductible par la modulation précise du processus d’activation. Cela doit permettre de créer une base pour l’analyse des liens entre les événements précoces (en particulier l’activation ovocytaire) et la reprogrammation épigénétique.
Pourquoi travailler sur cette question ? La compréhension du processus de reprogrammation épigénétique par sa modulation active pourra aider à mettre au point et perfectionner les manipulations embryonnaires pour leur application avec succès à la biotechnologie animale ou la médecine humaine.
I. 1.             Activation ovocytaire : le début de la vie Définition : activation ovocytaire La plupart des chercheurs considèrent l’activation ovocytaire comme le moment du démarrage du cycle cellulaire de l’ovocyte. Il est vrai que l’activation se produit pendant un intervalle court, par contre, elle contient une grande série d’événements cellulaires et moléculaires qui sont fortement liés au signal d’activation. L’activation ovocytaire comprend tous les événements compris entre les premiers événements cellulaires de la sortie de métaphase et la formation des PN (p.e. expulsion des granules corticaux, séparation des chromatides métaphasiques, décondensation des chromosomes, remodelage de la chromatine et formation des pronoyaux).  L’activation ovocytaire est nécessaire pour déclencher le développement embryonnaire. Les ovocytes de mammifères après ovulation se trouvent dans la deuxième métaphase de la méiose (MII). Sans activation, l’œuf reste bloqué à ce stade et après un certain temps et selon l’espèce, il meurt. Pour cette cellule très spécifique, la seule possibilité d’exprimer sa totipotence et de survivre est l’activation, par un spermatozoïde par exemple, qui le transforme en un embryon capable de se développer.
I. 1.1.                   Le régime calcique de la fécondation Au moment de la fécondation, le spermatozoïde des mammifères en pénétrant dans l’ovocyte délivre deux grands messages. Le premier sous la forme d’une induction de l’oscillation calcique (par le PLC-zeta) qui déclenche le développement embryonnaire (Kline et Kline, 1992a). Le second, sous la forme de chromatine, il contient l’ADN nécessaire à la reconstitution du génome diploïde du zygote et il comprend les marquages spécifiques du génome paternel (Surani et al., 1984 ; Monk et al., 1987). Définition : Oscillation calcique Le terme « oscillation calcique » définit des augmentations répétées de [Ca2+]ique l’on peut observer dans une grande variété de types cellulaires (Berridge, 1990). Ces changements en [Ca2+]i sont intensifs mais relativement courts, entre ces au la2+retourne à son niveau de base.
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Définition : Pic de Ca2+ Le terme « pic de Ca2+ ( »Ca2+ spike) désigne une augmentation de [Ca2+ qui] intracellulaire comporte un démarrage rapide, une augmentation très intensive dont l’amplitude est indépendante de l'intensité du stimulus puis un plateau plus ou moins court et un retour au niveau de base (Meyer et Stryer, 1991). Définition : Régime calcique Ce terme désigne tous les changements de [Ca2+]ipendant le processus de signalisation calcique, soit un seul pic (régime monotonique) ou soit une série d’ augmentation en [Ca2+]i(régime répétitif).
Le calcium, inducteur ou organisateur des événements de l’activation Les oscillations en [Ca2+]iévidence dans de nombreux types de cellules ; elles sontont été mises en déclenchées par des stimuli spécifiques à la cellule, tels que des neurotransmetteurs, des hormones ou des facteurs de croissance (Berridge, 1993 ; Tsien et Tsien, 1990). La libération répétitive de [Ca2+]i est un mode de signalisation fondamentalement important dans la régulation d’expression de certains gènes (Li et al., 1998; Dolmetsch et al., 1998), dans la progression du cycle cellulaire (Berridge, 1995;Groigno et Whitaker, 1998 ; Kao et al., 1990; Lefevre et al., 1997; Pesty et al., 1998) et dans la différenciation cellulaire (Clapham, 1995; Berridge et al., 2000). L’oscillation calcique est observée également pendant la maturation de l’ovocyte (Carroll et al., 1994), la destruction de l’enveloppe nucléaire (Nuclear Envelop Breakdown)et juste après la fécondation (Jaffe et Schlichter, 1985; Jones, 1998; Swann et Ozil, 1994 Runft et al., 2002). La fécondation initie une oscillation soutenue de [Ca2+]i qui déclenche une séquence d’événements cellulaires dans l’ovocyte qui se déroulent selon un ordre précis (Ducibella et al., 2002). Kline et Kline ont montré que l'inhibition partielle des signaux calciques de la fécondation par le chelator de Ca2+ GC, BAPTA-AM, ne modifie pas les événements précoces d'activation (exocytose des : changements moléculaires de la zone pellucide), mais perturbe les événements tardifs de l'activation (expulsion du deuxième GP, formation du PN ; Kline et Kline, 1992a). C’est à dire que les changements de [Ca2+]ipeuvent agir différemment sur les événements d'activation. L'élévation de [Ca2+]imène à l'exocytose des granules corticaux (GC) (Kline et Kline, 1992a). Le contenu de ces GC modifie l’enveloppe extracellulaire (la zone pellucide) de l'oeuf et empêche la polyspermie. En effet, après la fécondation des glycoprotéines (ZP2 et ZP3, composant la zone pellucide) sont modifiées, en conséquence, le spermatozoïde ne peut plus ni se fixer, ni subir la réaction acrosomique (Bleil et Wassarman, 1980; Bleil et Wassarman, 1983). L’augmentation intense du [Ca2+]i également la induitreprise de la méiose remaniement par le complet de l’activité dusystème phosphorylase-kinase d’ovocyte. Les résultats chez la souris et le xénope ont démontré que la reprise de la méiose est inhibée par la prévention de l’augmentation en
[Ca2+]i pendant Ozil, 1992). Une élévation importante la fécondation (Masui et al., 1977; Vitullo et du niveau de Ca2+ intracytoplasmique déclenche les cascades d’activation ou d’inactivation des éléments du système phosphorylase - kinase dans le but d’achever la méiose et de lancer le premier cycle cellulaire. Cette augmentation en [Ca2+]i calmoduline II la kinase dépendante de la active (CaMkinase II, Lorca et al., 1993) ce qui provoque la destruction de la cycline-B, via la phosphorylation de cdc25. La destruction de la cycline-B composant duMPF (Mitosis Promotion Factor),inactive le MPF permettant la reprise de la méiose (revue : Heikinheimo et Gibbons, 1998). Les exemples ci dessus montrent la dépendance de Ca2+ différents événements cellulaires des d’activation chez les mammifères. De plus, il a été recemment découvert que les événements individuels tels que l'exocytose des GC, la sortie de la métaphase II, le recrutement d’ARN messager et l’entrée dans l'interphase exigent un nombre différent d’impulsions calciques (Ducibella et al., 2002). Au niveau de l’activité enzymatique des kinases, quelques impulsions sont suffisantes pour diminuer largement l'activité de H1 kinase et du MPF, aussi bien que la sortie de la métaphase II, mais la diminution de l'activité de MAPK et la formation du PN nécessitent un régime calcique bien plus important. Ces observations ont suggéré un rôle additionnel des signaux calciques de l’activation : l’organisation temporelle des événements cellulaires via le nombre de signaux périodiques. Un autre phénomène précoce typique de la fécondation, la dépolarisation transitoire de la membrane et al.,observé chez les ascidies et les oursins (Dale et De Felice, 1984; De Simone  est 1998) et une hyperpolarisation chez quelques espèces mammifères (Gianaroli et al., 1994; Miyazaki, 1988; Nuccitelli, 1980) mais l’existence de ce processus n’est pas démontré chez la souris.
Remaniements de la chromatine Chez les oursins, un pic de Ca2+ se produit dans la cellule pendant que les embryons entrent dans l'anaphase du premier cycle cellulaire, avant la disjonction des chromatides et l'élongation de l'axe du fuseau. La micro-injection des chélateurs de calcium ou de l'héparine, un antagoniste du récepteur de triphosphate d’inositol (IP3R, nécessaire à la libération du Ca2+) bloque laséparation des chromosomeset cause le retard duremodelage nucléaire(Groigno et Whitaker, 1998). La procédure d’activation est nécessaire aussi chez la souris pour la transformation des chromosomes du spermatozoïde et de l’ovocyte en pronucleus (Uehara et Yanagimachi, 1976; Usui et Yanagimachi, 1976). D’après ces observations, il n’est pas surprenant que la dynamique de formation des PN est dépendante du régime calcique d’activation ovocytaire (Vitullo et Ozil, 1992). La décondensation et la réorganisation de la chromatine en une structure pronucléaire est obligatoire pour l’activation complète et le lancement du développement (Kubiak, 1989 ; Clarke et al., 1988). Des transformations similaires peuvent être aussi effectuées sur une chromatine originaire d’une cellule somatique. Mais une réorganisation semblable à celle de la fécondation ne fonctionne que si le noyau est introduit avant ou juste après l'impulsion électrique d’activation (Tarkowski et Balakier, 1980; Czolowska et al., 1984; Szollosi et al., 1986). Ces premières expériences suggèrent que les effets de l’activation ovocytaire ne se limitent pas à la sortie de l’ovocyte de la métaphase II. De plus, ils
posent la possibilité de liaisons entre le régime calcique, la restructuration de la chromatine et la dynamique de formation du PN. (Voir aussi : page 22)
Mécanisme d’oscillation calcique La [Ca2+]i extracellulaire) que l’ordre de 100nM (environ 20.000 fois plus basse du milieu celle de est strictement contrôlée par l’ovocyte. La fécondation de l’ovocyte induit des élévations transitoires de [Ca2+]ijusqu’à 1-2μ(Cuthbertson et Cobbold, 1985; Taylor et al., 1993).M Ce n’est pas seulement le spermatozoïde mais aussi l’extrait cytosolique préparé à partir du sperme qui cause les augmentations de la [Ca2+]iquand celui ci est microinjecté dans l’oeuf. Le facteur dans les extraits n'est pas spécifique de l’espèce ; chez les mammifères l’injection des extraits du sperme du hamster, d'humain ou du porc peuvent causer des oscillations calciques semblables à celles observées à la fécondation dans l’ovocyte d’hamster, d'humain ou de souris (Swann, 1990; Parrington et al., 1996; Stricker, 1997; Fissore et al., 1998). Les résultats ci-dessus suggèrent que le facteur spermatique ainsi que le mécanisme d’induction de la libération du Ca2+ doivent être fondamentalement similaires entre les espèces. Le mécanisme qui a lieu lors de la fécondation de l'œuf est appelé « la libération du Ca2+induit par le Ca2+» ou CICR (Calcium Induced Calcium Release). Le CICR est essentiel dans le déclenchement, la propagation et l’oscillation des élévations de [Ca2+]i induites par le spermatozoïde. Pour l’activation de CICR et la libération spontanée de Ca2+des réservoirs intracellulaires, situés dans le  réticulum endoplasmique (RE), la sensibilisation du récepteur de l’inositol 1, 4, 5- triphosphate (IP3R, canal calcique) par l’IP3 est essentielle. Cet état modifié, en réponse à une infime augmentation locale de [Ca2+]icanaux calciques (IP3R) et donc la libération générale du, permet l’ouverture des Ca2+des réservoirs cytoplasmiques. Il est maintenant clair que l’oscillation calcique à la fécondation est induite par la phospholipase C du spermatozoïde (PLCζ la (PIP2) et) qui favorise l'hydrolyse du biphosphate de phosphatidylinositol production d'IP3. L’augmentation de la concentration cytoplasmique d’IP3 provoque le changement conformationnel de l’IP3R et l’activation du CICR (Berridge et Irvine, 1984; Berridge et Irvine, 1989; Jones et al., 1998a; Parrington et al., 1999; Rice et al., 2000; Saunders et al., 2002). D'autre part, la signalisation Ca2+ àl'oeuf d'oursin peut également impliquer le CICR la fécondation de  les par récepteurs ryanodine. (review : Miyazaki et al., 1993). La liaison d’IP3 et du Ca2+aux récepteurs situés sur la membrane du RE induit la déplétion de Ca2+. Le signal généré par cette diminution de concentration de Ca2+dans le RE provoque une interaction encore mal connue entre la membrane plasmique et le RE ( à travers les récepteurs SOC, les canaux dirigés par les réserves de Ca2+ réapprovisionnement du stock de Ca) qui est responsable du2+du RE (Putney, Jr. et Bird, 1993 McGuinness et al., 1996; Putney, Jr. et al., 2001). Finalement, nous pouvons tirer la conclusion suivante, dans la libération du Ca2+ deux processus
principaux sont impliqués : la sensibilisation des canaux calciques (surtout l’IP3R) et la concentration du Ca2+dans le cytosol et les réservoirs. L’altération de l’un ou de l’autre peut modifier la régulation de [Ca2+]i.
Le profil du régime calcique Le signal calcique au cours de la fécondation est un phénomène universel dans le monde vivant. Selon les espèces, le signal d’activation peut être constitué d’un seul pic de Ca2+ cnidaires, (p.e. quelques mollusques, échinodermes, poissons, grenouilles, quelques mammifères) ou par des impulsions répétitives de Ca2+(régime oscillatoire chez les plantes, némertes, mollusques, annélides, chordés, mammifères) (revue : Stricker, 1999). La fécondation est suivie chez les mammifères par des élévations répétitives de la concentration cytosolique de Ca2+  (Miyazaki oscillation démarreet Igusa, 1981; Cuthbertson et al., 1981). Cette quelques minutes après la fusion des gamètes (Cuthbertson et al., 1981; Deguchi et al., 2000) et dure 3h chez la lapine (Fissore et Robl, 1992) 5-7h chez le bovin (Fissore et al., 1992) et l’humain (Taylor et al., 1993; Taylor, 1994) jusqu’à la formation des PN (Jellerette et al., 2000; Marangos et al., 2003). Les caractéristiques des signaux individuels et la fréquence du régime sont des propriètés intrinsèques de l’ovocyte de chaque espèce (Dolmetsch et al., 1998; Stricker, 1999). Chez la souris, le signal initial se produit 1-3 minutes après la fusion des gamètes (Lawrence et al., 1997) et persiste pendant 3- 4 min ; les pics de Ca2+ sec) avec une fréquence variable (Swann,suivants sont plus courts (30-60 1992; Miyazaki et al., 1993), l’oscillation se maintient 3- 4 h (Cuthbertson et Cobbold, 1985; Kline et Kline, 1992a). Cette spécificité pose la question de l’existence d’un impact dépendant de la distribution temporelle de Ca2+cytosolique pendant l’activation.
I. 1.2.                   Activation artificielle et calcium Pendant le demi-siècle d’étude de la parthénogenèse, nous avons trouvé qu’une grande variété des stimuli d’origine extérieure est capable d’activer des ovocytes sans interaction du spermatozoïde. Pour la première fois, la mise en évidence directe de l’augmentation du [Ca2+]i ou à la fécondation activation d’un œuf a été obtenu dans les années 70 (chez le poisson Ridgway et al., 1977 ; et chez l’oursin Steinhardt et al., 1977). Plus tard Cuthbertson et al. ont démontré, que l’activation par le spermatozoïde ou par l’éthanol est effectué par des élévations en [Ca2+]i avec des profils temporels différents (Cuthbertson et al., 1981). Il a été observé que la majorité des activateurs initient des augmentations différentes en amplitude ou en régime de [Ca2+]i (monotoniques ou répétitifs ; revue : Swann et Ozil, 1994).
Activation par un seul signal calcique
Éthanol L'éthanol agit directement sur la membrane cellulaire, polarisant et déstructurant la membrane (Lee,
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