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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
N° d'ordre : 2249 THESE présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale : BIOLOGIE, SANTE, BIOTECHNOLOGIES Spécialité : BIOSCIENCES VEGETALES Par Cécile BEN Analyse du transcriptome lors de l'embryogenèse précoce chez le Tournesol Soutenue le 15 septembre 2005 devant le jury composé de : Dr. J.D. FAURE INRA, Versailles, Rapporteur Dr. D. JOB CNRS/Bayer CropScience, Lyon, Rapporteur Dr. J.P. GALAUD UPS/CNRS, Toulouse, Examinateur Pr. L. GENTZBITTEL INPT-ENSAT, Toulouse, Directeur de thèse Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes Pôle de Biotechnologie Végétale - 18, Chemin de Borde Rouge, BP107 - 31326 CASTANET-TOLOSAN

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Publié le : jeudi 1 septembre 2005
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Source : ethesis.inp-toulouse.fr
Nombre de pages : 231
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N° d’ordre : 2249 THESE présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale :BIOLOGIE, SANTE, BIOTECHNOLOGIESSpécialité :BIOSCIENCES VEGETALES ParCécile BEN Analyse du transcriptome lors de l'embryogenèse précoce chez le Tournesol Soutenue le 15 septembre 2005 devant le jury composé de : Dr. J.D. FAURE INRA, Versailles, Rapporteur Dr. D. JOB CNRS/Bayer CropScience, Lyon, Rapporteur Dr. J.P. GALAUD UPS/CNRS, Toulouse, Examinateur Pr. L. GENTZBITTEL INPT-ENSAT, Toulouse, Directeur de thèse Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes Pôle de Biotechnologie Végétale - 18, Chemin de Borde Rouge, BP107 - 31326 CASTANET-TOLOSAN
A mon f ia ncé, Séba stien, A vec tout mon a mour.
REMERCIEMENTS Ces remerciements s’adressent à toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à l’aboutissement de mon projet de thèse. Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur Laurent Gentzbittel pour m’avoir accordé sa confiance et m’avoir guidée dans mes réflexions scientifiques tout au long de ce travail. Que cette thèse soit le témoignage de toute ma gratitude pour ses précieux conseils, pour son soutien ainsi que pour les nombreuses discussions que nous avons eues, si riches en enseignements tant sur le plan scientifique qu’humain. Je remercie Monsieur Dominique Job et Monsieur Jean-Denis Faure de m’avoir fait l’honneur d’accepter d’être rapporteurs de ce travail. Je remercie également Monsieur Jean-Philippe Galaud pour sa participation à mon jury de thèse. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma plus haute considération. Je remercie les Professeurs Gilbert Alibert et Michel Petitprez qui m’ont accueillie au sein du laboratoire de Biotechnologies et Améliorations des Plantes de l’ENSAT. J’adresse également un immense merci à Tarek Hewezi pour toutes les connaissances qu’il m’a apportées, en particulier en ce qui concerne l’approche microarray, et pour notre agréable et efficace coopération. Qu’il sache que j’ai beaucoup appris à ses côtés. Un merci tout particulier à Cecilia Tamborindeguy et Nathalie Ladouce qui, en me témoignant leur profonde amitié, m’ont soutenue à chaque instant. Un grand merci également à Thierry Liboz pour ses encouragements et son aide précieuse, notamment pour l’annotation fonctionnelle des clones, ainsi qu’à Marie-Françoise Jardinaud pour ses nombreux conseils et nos discussions scientifiques des plus enrichissantes. J’exprime toute ma reconnaissance à l’ensemble des personnes ayant très largement participé à la réalisation du projet Mago Nashi : Christian Brière, Laurent Gentzbittel, Marie-Françoise Jardinaud, Thierry Liboz, Cédric Muller, Michel Petitprez et Cecilia Tamborindeguy. Je les remercie pour la passion et l’énergie qui nous ont animés et unis au fil des découvertes. Je tenais également à remercier très chaleureusement Cédric Muller, Sébastien Moretti et Nicolas Salatgé pour leur aide si précieuse dans le domaine informatique.
J’exprime toute ma gratitude à nos collègues de Génoplante pour m’avoir permis d’exploiter leur données ainsi qu’à ceux du CRGS Toulouse-Midi Pyrénées en particulier Cécile Tonon, Julien Sarry et Gérald Salin, pour m’avoir permis d’utiliser leur matériel ainsi que pour leur conseil technique concernant la gestion des banques d’ADNc et la réalisation des microarrays. Merci également aux différentes stagiaires ayant aidé à l’accomplissement de mes travaux de thèse : Elodie, Marie-Josée, Gaby et Clara. Je voudrais vivement remercier tous les membres du BAP pour m’avoir accueillie si chaleureusement. Je garderai un merveilleux souvenir de ces années passées parmi eux. Tout particulièrement, j’adresse un grand merci à Annie, Cathy, Marie-Jo, Philippe, Patrick et Sylvie pour leur disponibilité et leur immense gentillesse. Pour finir, j’adresse tout mon amour à mon fiancé, à mes parents, à mon frère, à toute ma famille et à mes amis qui m’ont toujours soutenue dans cette aventure. Vous comptez plus que tout pour moi. Sébastien, mon Amour, sans ton soutien de chaque instant, sans ton aide si précieuse, sans ton amour, tout simplement, je n’aurais été capable de rien. Pour avoir tant contribué à transformer ce très beau défi en réussite…Merci !
ABSTRACT In higher plants, embryogenesis is a process of main importance which corresponds to the establishment of the correct embryo pattern and to the accumulation of storage reserves. Thus, the knowledge of the molecular and physiological events of this process represents a major interest for agronomy to improve grains quality and yields. However, the analysis of the early stages of development is often difficult because the embryo is small and embedded inside the maternal tissue. Sunflower (Helianthus annuus L.), which presents an inflorescence with numerous and relatively big embryos whose development is synchronized, has been proposed as a complementary model for the study of zygotic embryogenesis in dicotyledonous. In order to analyze the transcriptional program induced during the embryo patterning, reference cDNA libraries were constructed from globular, heart-shaped and early cotyledonary embryos which represent critical stages of embryogenesis. A substracted library from heart-shaped and cotyledonary embryos and enriched in transcripts from heart-shaped stage was also realized. A total of 23,800 clones was generated among which 4,118 were sequenced giving rise to 1,690 published EST. Forin silico analysis, sequences
from the reference libraries were coupled to EST from cDNA libraries prepared from unfertilized ovules and mid and late cotyledonary embryos. The global EST dataset represents 7,106 sequences and 3,064 potentially different genes. Functional annotation of the putative unique sequences allowed us to identify the major cell functions implicated at each stage of development revealing that embryos are engaged in active differentiation process. The EST collection analysis also led to the identification of some interesting genes such as putatively differentially expressed genes or genes with potential key roles in plant and animal embryogenesis such as Argonaute or Mago Nashi like genes. These libraries, grouped with other sunflower cDNA libraries prepared from different tissues, were used to construct a microarray containing 8,185 unique sequences. This microarray was hybridized with radiolabelled cDNA from globular, heart-shaped and cotyledonary embryos as well as unfertilized ovules and leaves used as external controls. The statistical analysis of microarray data allowed us to identify 744 differentially expressed genes between at least two conditions. The analysis of the expression profiles of those genes permitted us to build hypothesis concerning the mechanisms participating in early phases of sunflower embryogenesis. Specific transcriptional and post-transcriptional regulatory pathways as well as diverse signal transduction processes seem to be involved at each stage of this crucial phase of plant life cycle. Functional plastids biogenesis and senescence also appear to play essential roles for normal embryo development. Key words:Helianthus annuus L., embryogenesis, EST, cDNA library, microarray, gene expression analysis.
ABA ADN ADNc ARN ARNm BAC BET bp cDNA-AFLP DNAse dNTP EDTA EMS EST kb LCM PCR QTL eQTL RNAi RNAse RNP RT-PCR SDS SSC SSH TAE TE Tris
ABREVIATIONS
Acide abscissique Acide désoxyribonucléique Acide désoxyribonucléique complémentaire Acide ribonucléique Acide ribonucléique messager Bacterial artificial chromosome Bromure d’éthidium Paire de base Complementary desoxyribonucleic acid-amplified fragment length Désoxyribonucléase Désoxynucléotides triphosphate Acide Ethylène Diamine Tétra-acétique Ethyl méthane sulfonate Expressed Sequence Tag kilobase Laser Capture Microdissection Polymerase Chain Reaction Quantitative trait loci Expression quantitative trait loci RNA interference Ribonucléase Ribonucléoprotéine Reverse transcription-PCR Sodium Dodécyl Sulfate Salt Sodium Citrate Suppressive subtractive hybridization Tampon Acétate EDTA Tris-EDTA Tris (hydroxyméthyl)-méthylamine
Sommaire Détaillé
RESUME……………………………………………………………………………..1 PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I - L'embryogenèse chez les végétaux supérieurs………………………...……2 I. L'embryogenèse : une étape clé du développement des plantes……………………………….2 I.1. Une phase essentielle du développement………………………………………………………………..2 I.2. La graine : un organe végétal d'un intérêt agronomique capital……………………………………...2 I.3. La séquence de développement de la graine comporte trois phases clés. …………………………….3 II. Description histologique et morphologique de l'embryogenèse des Dicotylédones………….4 II.1. La fécondation: étape d'initiation de l'embryogenèse………………………………………………...4 II.1.1. Les acteurs de la fécondation………………………………………………………………………….4II.1.2. La double fécondation : une originalité des Angiospermes .…………………………………………5II.2. Mise en place des axes apico-basal et radial de l'embryon…………………………………………...6 II.2.1. La première division asymétrique traduit la polarisation du zygote.…………………………………6II.2.1.1. Déroulement de la première division du zygote………………………………………………………6II.2.1.2. Hypothèses sur l'origine de la polarité du zygote…………………………………………………….7II.2.2. De l'embryon deux cellules jusqu'à l'embryon globulaire : mise en place des axes apico-basal et radial…………………………………………………………………………………………………………...9II.2.3. Transition globulaire-coeur : acquisition de la symétrie bilatérale et organisation définitive de la plante………………………………………………………………………………………………………….10II.2.4. Stade cotylédonaire : croissance et accumulation des réserves……………………………………..10II.3. Autres modèles de développements embryonnaires…………………………………………………10 II.3.1. Comparaison avec l'embryogenèse zygotique chez les Monocotylédones.…………………………10II.3.2. Principales différences entre embryogenèse végétale et animale…………………………………...11III. Méthodes d’étude des mécanismes moléculaires impliqués au cours de l’embryogenèse végétale……………………………………………………………………….…………………….12 III.1. L'analyse par mutagenèse, une source d’informations abondantes mais insuffisantes………….12 III.1.1. Criblage de siliques immatures………………………………………………………….………….13III.1.2. Criblage de plantules en germination………………………………………………………………13
III.1.3. Limites de l'approche par mutagenèse……………………………………..……………………….14III.2. L'analyse par les méthodes de la génomique fonctionnelle, une approche prometteuse…………14 III.2.1. Les techniques de transcriptomique à faible débit………………………………………………….14III.2.2. Les approches ESTs et microarrays ou l’étude globale de l’expression du génome………………15IV. Modèle génétique et fonctionnel de l’établissement du patron embryonnaire chez les dicotylédones……………………………………………………………………………………….17 IV.1. L’élaboration du plan d’organisation de l’embryon végétal implique une régulation génétique très fine……………………………………………………………………………………………………….17 IV.1.1. Inégalité des sexes lors de l’embryogenèse précoce : rôle prédominant du génome maternel…….17IV.1.2. Gènes impliqués dans la mise en place de l’axe apico-basal……………………………………….18IV.1.2.1. Suspenseur vs embryon : acquisition de devenirs cellulaires distincts dès la première division asymétrique……………………………………...……………………………………………………………18IV.1.2.2. Mise en place du méristème racinaire……………………………………………………...………19IV.1.2.3. Mise en place du méristème apical………………………………………………………….……...20IV.1.3. Gènes intervenant dans la mise en place de l’axe radial…………………….……………………..20IV.1.3.1. Gènes impliqués dans la spécification et le maintien du protoderme………………………………20IV.1.3.2. Gènes impliqués dans la différenciation des tissus internes………………………………………..21IV.1.4. Gènes intervenant dans l’établissement de la symétrie bilatérale : Mise en place des organes latéraux…………………………………………….…………………………………………………………22IV.2. La différenciation cellulaire au sein de l’embryon végétal nécessite l’échange d’indices de position……………………………………………………………………………………………………….22 IV.2.1. La paroi cellulaire : un composant actif de la transduction du signal au sein de l’embryon……..23IV.2.1.1. Propriétés chimiques de la paroi végétale et régulation du développement embryonnaire………..23IV.2.1.2. Les plasmodesmes, douanes régulant les échanges moléculaires entre cellules……..…………….23IV.2.2. Les hormones végétales, médiateurs indispensables à la formation d’un patron embryonnaire correct……………………………..………………………………………………………………………….24IV.2.2.1. L'auxine, molécule coordinatrice de l’établissement du patron embryonnaire…………………….24IV.2.2.2. Les stérols : régulateurs de la division et de l’expansion cellulaire lors de l’embryogenèseprécoce?……………………………………………………………………………………………………..26IV.2.2.3. Le rôle des cytokinines au cours de l’embryogenèse précoce reste encore à définir……...……….27IV.3. Les récentes analyses transcriptomiques offrent un premier aperçu des principales fonctions cellulaires et voies de régulation impliquées au cours de l’embryogenèse végétale……….…………….27 IV.3.1. Un large éventail de fonctions cellulaires indispensables au développement embryonnaire…..….27IV.3.2. Comparaison ‘tissus maternels vs. embryonnaires’ et identification des particularités du programme embryonnaire……………………………………...…………………………………………….28
IV.3.3. Des programmes génétiques spécifiques à chaque type de graines : exemple des graines vertes et non vertes………………………………………………………..……………………………………………29IV.4. Elaboration du patron embryonnaire chez les dicotylédones : organisation modulaire de l’embryon ou croissance différentielle ?.......................................................................................................29 Chapitre II - Le tournesol : un modèle d'étude complémentaire de l'embryogenèse zygotique chez les Dicotylédones………………………………………………………….31
I. Le tournesol : une plante d'intérêt agronomique……………………………………………...31 I.1. Le tournesol : une plante ayant subi les effets de la domestication………………………………….31 I.2. Historique de la culture du tournesol………………………………………………………………….31 I.3. Quelques généralités sur le tournesol………………………………………………………………….32 I.4. Intérêt économique et production……………………………………………………………………...32 I.4.1. Le tournesol, une culture aux débouchés très diversifiés.………………………………….……….32I.4.1.1. Production d’huile alimentaire…………………………………………………………….…………32I.4.1.2. Utilisation des protéines en alimentation humaine…………………………………………………..33I.4.1.3. Utilisation des tourteaux en alimentation animale…………………………………….……………..33I.4.1.4. Valorisation non alimentaire……………………………………………..…………………………..33I.4.2. Importance économique.…………………………………..………………………………………….34II. Une plante présentant de nombreux atouts pour l'étude de l'embryogenèse………………35 II.1. Un appareil reproducteur à l’anatomie avantageuse pour l’étude de l’embryogenèse…………...35II.2. L’embryogenèse somatique du tournesol : un modèle d’étude des phases d’initiation de l’embryogenèse………………………………………………………………………………………………35 II.3. Des outils disponibles en constant développement…………………………………………………..36 III. Etat actuel des connaissances sur le développement embryonnaire chez le tournesol……36 III.1. Embryogenèse somatique et analyse du transcriptome lors de l’acquisition de la polarité embryonnaire………………………………………………………………………………………………..36 III.2. Description de QTLs impliqués dans les processus du développement embryonnaire du tournesol……………………………………………………………………………………………………...37 III.3. Contrôle moléculaire de la mise en place des réserves au sein de l’embryon de tournesol………38 III.3.1. Cinétique de l’accumulation des réserves au sein de l’embryon…………………………...………38III.3.2. Modèle de synthèse des acides gras au sein de l’embryon de tournesol……………..…………….38III.3.3. Les hélianthinines, principales protéines de réserves du tournesol……………………….……….39Chapitre III – Intérêts et objectifs du projet de thèse…………………………………..40
PARTIE 2 - RESULTATS ET DISCUSSION Chapitre I – Approche EST : Création de ressources et analyses d’expression génique in silico…………………………………………………………………………………...…42 I. Choix méthodologiques………………………………………………………………………....42 I.1. Choix du matériel végétal: une stratégie « stades de développement » préférée à « jours après pollinisation »……………………………………………………………………………………………..…42 I.2. La technologie SMART est utilisée pour pallier aux faibles quantités de matériel végétal………..43 I.3. Les banques d’ADNc de référence : un échantillonnage de l’ensemble des gènes exprimés……….44 I.4. Les banques SSH : enrichissement en gènes faiblement et préférentiellement exprimés pour un stade de développement……………………………………………………………………………………..45 II. Approche fonctionnelle de l’embryogenèse précoce du tournesol par analyse…………….46 II.1. Article: Comparative analysis of early embryonic sunflower cDNA libraries……………………..46 II.2. Analyse de la banque SSH enrichie en transcrits spécifiques d’embryons au stade coeur………..64 III. Difficultés rencontrées pour l’obtention des données EST. ………………………………..65 III.1. Un fort taux de redondance des banques HaGlbR, HaHeaR et HaHeaS………………………….65 III.2. Existence de plusieurs facteurs expérimentaux limitant le rendement du séquençage…………..66 Chapitre II – Approche ‘Microarrays’ : Analyse simultanée de l’expression de 8 185 gènes lors de l’embryogenèse précoce du tournesol……………………………………..68 I. Choix méthodologiques et mise en œuvre technique………………………………………….69 I.1. Construction d’un microarray ADNc sur membrane nylon…………………………………………69 I.1.1. Raisons du choix de la technique employée…………………………………………………………..69I.1.2. Construction du microarrays………………………………………………...………………………..70I.1.2.1. Construction d’une puce générale plutôt qu’une puce thématique……………………………..……70I.1.2.2. Sélection de l’EST la plus représentative pour chaque contig……………………………….………71I.1.2.3. Choix des témoins……………………………………………………………………………...……..71I.2. Elaboration d’un plan d’expérience performant pour faciliter l’analyse des données……………..72 I.2.1. Sélection des échantillons à tester : Stades embryonnaires d’intérêt et témoins………………...…..72I.2.2. Importance des répétitions des mesures…………………………………………...…………………..72I.2.3. Carré Latin Incomplet : Intérêt et puissance du dispositif expérimental utilisé.……………………73I.3. L’analyse statistique des données est basée sur deux ANOVA interconnectées…………………….73
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