Présentée l'Université de Strasbourg Faculté des Sciences de la Vie pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université de Strasbourg

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THESE Présentée à l'Université de Strasbourg, Faculté des Sciences de la Vie pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université de Strasbourg Spécialité : Neurosciences Par Sophie PAWLOWSKI INSTITUT DES NEUROSCIENCES CELLULAIRES ET INTEGRATIVES Département Nociception et Douleur UPR 3212 CNRS Université de Strasbourg Thèse dirigée par le Dr. Pierre VEINANTE Voie parabrachio-amygdaloïde : Implication du Brain-Derived Neutrophic Factor (BDNF) dans la réponse à la morphine Soutenue le 9 mai 2011 devant la commission d'examen : Mme. Catherine LE MOINE Rapporteur externe M. Jérôme TROUSLARD Rapporteur externe M. Jean ZWILLER Examinateur interne M. Pierre VEINANTE Directeur de thèse

  • principe d'induction du knock

  • procédures d'injection

  • ……… …

  • merci

  • …………

  • thèse sans la folle aventure des doctoneuro

  • générosité… merci

  • merci de ton soutien inconditionnel

  • implications fonctionnelles……………


Publié le : dimanche 1 mai 2011
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 245
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THESE Présentée à l’UniversitédeStrasbourg, Faculté des Sciences de la Vie pour l’obtention du grade de Docteur de l’UniversitédeStrasbourg Spécialité : Neurosciences
Par Sophie PAWLOWSKI INSTITUT DESNEUROSCIENCESCELLULAIRES ETINTEGRATIVESDépartement Nociception et Douleur UPR 3212 CNRSUniversitédeStrasbourg Thèse dirigée par le Dr. Pierre VEINANTE
Voieparabrachio-amygdaloïde :
Implicat ion du Brain-DerivedNeut rophicFact or(BDNF)danslaréponseàlamorphine Soutenue le 9 mai 2011 devant la commission d’examen : Mme. Catherine LE MOINE Rapporteur externe M. Jérôme TROUSLARD Rapporteur externe M. Jean ZWILLER Examinateur interne M. Pierre VEINANTE Directeur de thèse
MERCI Merci aux membres du jury, Mme. Le Moine, M. Trouslard et M. Zwiller,d’avoir accepté d’apprécier cetravail de thèse et d’être venuen discuter à Strasbourg. Merci à Marie-Joséqui m’aaccueilli dans son équipe depuis quelques années maintenant, d’abord en temps que stagiaire, puis étudiante de Master 2 et enfin doctorante. Toujours avec le sourire et le mot qui rassure, votre pragmatisme et votre générosité apportent beaucoup au laboratoire! Merci à Michel qui m’a fait entrer au laboratoire pour ce stage del’été 2004 avec au menu, coupes de cerveaux à un rythme industriel et immuno en série ! J’aurais du me douter de quelques chose à ce moment là... non ? Et merci à Pierre,d’abord mon enseignant de neuroanatomie puis mondirecteur
de thèse, confiant, fasse à une étudiante visiblementstressée… et surtout qui m’a toujours encouragé et soutenu dans mes démarches artistico-humoristico-pédagogiques (cours, conférences, ateliers, théâtre scientifique et autres tribulations variées). Merci Betty, bienveillante et soucieuse du bien être des étudiants du labo, merci pour ton aide dans les manips, Jenny (acolyte dans de nombreuses aventures DoctoNeuro et autres), Alex,
Yohann, Schtroumf grognon au grand cœuravec tes expressions sorties de nulle part ! Merci pour la rigolade dans le bureau et mercide m’avoir supporté(surtout en ces derniers temps de rédaction…), Nada, Romain, Hugues (compère de promo embarqué dans la même galère), Eric, Florent, Viviane, Luc-Henri, merci pour ton aide dans les manips, merci Maya, Stéphane et merci à tous les autres (et ceux que j’oublie) qui m’ont soutenu: Nabila, Pascal, Jean-Luc, Rémy, Sylvain, Fatima, François, Christine,….Merci les Doctoneuro. Que serait cette thèse sans la folle aventure des DoctoNeuro ? Merci à tous
mes acolytes de franches parties de rigolades, sans ordre de préférence et dans le désordre de l’ordre d’apparition, merci à Malika etDomitille ferventes actrices et supportrices invétérées des premiers pas des DoctoNeuro, merci à Etienne (assistant dévoué et Jean Bon appliqué), Delphine
(Chaman), Alex et Elise (Crocodile Donut), Dzenan (Marabout’ficelle), Roomila (Neuropolairette), Matei (Justine/Neuropolairette), Laetitia (cortex/cône), Virginie (hypothalamus psychiatre), Alexandre (hippocampe cow-boy), Yohann (scout), Marie-Andrée (Maryse la Potiche), Joseph (Maestro), Antoine et Ilona (oreilles), Arthur et Marc-Antoine (yeux), Mardochée (l’infirmier),Maya (Broca),Carolina (l’infirmière), Cyprien (l’explorateur)… sans oublier Sercan, celui qui peut
endosser tous les rôlesNeuropolaire, Gustave, vendeur du téléachat, figurant, animateur télé, mais aussi remarquable scénariste, dialoguiste, metteur en scène,attaché de presse…et thésard hors paire bien entendu! Et merci àbien d’autresquej’oubli etqui ont participé de près ou de loin
à nos exploits. Longue vie aux DoctoNeuro ! merci à mes amies : Claire et Maryline mes complices depuis les bancs del’Université. Merci particulièrement à Claire qui depuis ce premier TP en DEUG reste mon meilleur binôme, toujours là pour moi entre ses manips et le reste ! Merci à Aude Marseillaise d’adoptionqui reste à mais l’écoute des Strasbourgeois, à Floriane expatriée au pays des kiwis, à Sophie (fidèle amie depuis le
lycée) et merci beaucoup à Ipek (çok teşekürler), Nathalie (et toute la famille) et Malika qui sont devenues pour moi bien plus que des collègues ! Merci pour votre soutien, pour vos encouragements, pour vos fous rires, votre gentillesse, votre générositéMerci ! merci à Sercan, mon plus précieux allié. Merci de ton soutien inconditionnel, de ton aide précieuse,de ta présence, de ton calme inébranlable (je ne sais toujours pas comment tu fais…),de
ta douceur, de ta confiance… pour toutcela et pour bien plus encore qui ne peut se dire ici, Merci ! merci à mes parents, Marie-Jo et Daniel,qui m’ont toujours soutenuet encouragé dans ces longues années universitaires et quiont toujours respecté mes choix. Merci d’avoir été là dansles
moments de doutes, les périodes difficiles et les réussites ! Merci pour votre compréhension et votre soutien inaltérable ! Vous êtes mes premiers fans, je le sais ! Ne vous cachez pas ! merci à mes petits compagnons de manip (souris, rats, et grenouilles) et merci àl’IPCBde ne pas
m’être tombésur la tête.Par contre, vous ne m’en tiendrez pas rigueur si je ne remercie pas les ascenseurs récalcitrants, les canicules prolongées, les travaux en tout genre, les générateurs qui surchauffent, les PC qui plantent, les chambrent froides qui se prennent pour des étuves, les
livraisons qui n’arrivent jamais, les inondations de l’animalerie et… les anticorps BDNF!Mais c’est aussi cela une thèse ! Je pourrais résumer ma thèse par cette citation :essayant« En continuellement on finit par réussir. Donc plus ça rate, plus on a de chances que ça marche.»
(Devise Shadock). Enfin, veuillez noter dans vos dictionnaires, AMYGDALEstructure du cerveau possédant 8 pattes velues, qui provoque des réactions de peur chez
certaines personnes. Une morsure d'amygdale peut provoquer une paralysie brachiale latérale amygdaloïde étendue, dont le seul remède connu à ce jour est une injection de BDNF (Bidule Défectueux Non Fiable), traitement qui a pour effet secondaire une délétion spatio-temporelle de plusieurs années de thèse.
Sophie
S
OMMAIRE p. iv p. vii p. ix p. 01 p. 03 p. 04 p. 04 p. 06 p. 07 p. 08 p. 11 p. 11 p. 12 p. 13 p. 14 p. 15 p. 16 p. 16 p. 17 p. 18 p. 21 p. 24 p. 24 p. 26 p. 26 p. 28 p. 29 p. 31 p. 31 p. 31 p. 31 p. 31 p. 32 p. 32 p. 34 p. 35 p. 35 p. 37 p. 39 p. 40 p. 41
Liste des abréviations…………………………………………………………………….…. Liste des figures et tableaux……………………………………………..…………...……. Publications et communications……………………………………………………..….… AVANT-PROPOS…………………………………………………………………………....... INTRODUCTIONBIBLIOGRAPHIQUE…………………………………………….……….. 1. Le noyau parabrachial………………………………………………………….……..… 1.1. Organisation anatomique ……………………………………………….………... 1.2. Implications fonctionnelles…………………………………………….…...……..1.2.1. Fonctions viscérales ………………………………………..…………..….… 1.2.2. Nociception …………………………………………………………………… 2. Amygdale et amygdale étendue………………………………………….………..….. 2.1. De l’amygdale à l’amygdale étendue……………………………..………….…. 2.2. L’amygdale étendue centrale…………………………………….…………..….. 2.2.1. Organisation anatomique……………………………………………….……2.2.2. Neurochimie…………………………………………………………………... 2.2.3. Connectivité…………………………………………………………….….…..2.3. Aspects fonctionnels………………………………………………………….….... 2.3.1. Régulations cardiovasculaires………………………………………….…… 2.3.2. Peur…………………………………………………………………….…...…. 2.3.3. Nociception ……………………………………………………………..…..… 2.3.4. Dépendance aux drogues…………………………………………………… 3. La voie parabrachio-amygdaloïde étendue…………………………….…………… 3.1. Organisation anatomique……………………………………………….……….. 3.2. Aspects fonctionnels……………………………………………………………… 3.2.1. Une voie nociceptive……………………………………………….………… 3.2.2. … mais pas uniquement…………………………………………………….. 3.2.3. Voie parabrachio-amygdaloïde étendue et opioïdes…………………..…. 4. Le BDNF……………………………………………………………………..…….….…… 4.1. Généralités…………………………………………………………..…….….…….. 4.1.1. Définition…………………………………………………………….………… Une neurotrophine………………………………………………………….… Du gène à la protéine……………………………………………………..…. 4.1.2. Transport, sécrétion et libération………………………………………...…. 4.1.3. Récepteurs et voies de signalisation intracellulaires…………………….. 4.1.4. Expression et localisation du BDNF et de son récepteur…………….….. 4.2. Implications fonctionnelles…………………………………………………….… 4.2.1. Nociception……………………………………………………………………. 4.2.2. Dépendance aux drogues……………………………………….…….……. 4.2.3. Plasticité synaptique……………………………………………………...….. OBJECTIFS…………………………………………………………………………………….. MATERIELETMETHODE………………………………………………………………….…
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PROCEDURES GENERALES…………………………………………………………………...… 1. Animaux………………………………………………………………………….………… 1.1.Souris utilisées…………………………………………………………………..…. 1.2. Principe des souris loxP-BDNF……………………………………..…………… 2. Chirurgies stéréotaxiques et procédures d’injection……………………………... 2.1. Chirurgies stéréotaxiques………………………………………………………... 2.2. Injections par pression……………………………………………………..…….. 2.3. Injection de BDA…………………………………………………………..……….. 3. Histologie et détection du BDNF……………………………………………………… 3.1. Prélèvements sur tissus fixés par perfusion………………………………….. 3.2. Coupes……………………………………………………………………………….. 3.3. Immunohistochimie et révélation BDA………………………………...………. 3.3.1. Immunofluorescence……………………………………………..………….. 3.3.2. Immunohistochimie avec révélation peroxydase……………….………… 3.3.3. Révélation BDA………………………………………………………..………3.4. Détection du BDNF………………………………………………………………… 3.4.1. Hybridation in situ……………………………………………………….…….3.4.2. Immunohistochimie BDNF……………………………………………..…....3.5. Microscopie et iconographie………………………………………………….…. PROCEDURES SPECIFIQUES……………………………………………………………….…....1. Invalidation locale du BDNF…………………………………………………………… 1.1. Principe d’induction du knock-out local………………………………………. 1.2. Injections de particules virales adéno-associées (AAVs)………………….. 1.2.1. Définitions des AAVs……………………………………………………...…. 1.2.2. Production des AAVs …………………………………………………..……. 1.2.3. Procédures d’injection et temps de migration…………………………….. 1.2.4. Précautions sanitaires……………………………………………………..…. 1.3. Groupes expérimentaux……………………………………………………...…… 1.4. Contrôle histologique…………………………………………………...………… 2. Lésions excitotoxiques…………………………………………………………………. 2.1. Procédure d’induction de la lésion……………………………………………... 2.1.1. Principe de la lésion…………………………..……..………………………. 2.1.2. Injection……………………………………………………………..………… 2.2. Groupes expérimentaux …………………………………………………..……… 2.3. Contrôle histologique……………………………………………………..………. 3. Tests comportementaux, évaluation nociceptive et activation cellulaire……... 3.1. Comportement…………………………………………………………….…….….. 3.1.1. Coordination motrice…………………………………………………………. 3.1.2. Evaluation du niveau d’anxiété………………………………………..……. Test du champ ouvert………………………………………………………… Labyrinthe en croix surélevé………………………………………………… Test d’émergence (dark-light)………………………………………..……… 3.1.3. Evaluation nociceptive…………………………………………………...….. Evaluation de la sensibilité nociceptive mécanique……………………… Evaluation de la sensibilité nociceptive thermique chaude………..….… 3.2. Morphine aiguë…………………………………………………………………..… 3.2.1. Procédure d’injection…………………………………………………….…… 3.2.2. Analgésie aiguë…………………………………………………………..…… 3.2.3. Induction de la protéine c-Fos…………………………………………...….. 3.3. Morphine chronique…………………………………………………….………….
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p. 42 p. 42 p. 42 p. 42 p. 42 p. 42 p. 43 p. 44 p. 44 p. 44 p. 44 p. 45 p. 45 p. 45 p. 46 p. 46 p. 46 p. 47 p. 47 p. 48 p. 48 p. 48 p. 48 p. 48 p. 48 p. 49 p. 49 p. 50 p. 50
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3.3.1. Procédure d’injection………………………………………………….…...… 3.3.2. Syndrome de sevrage………………………………………………….……. 3.3.3. Induction de la protéine c-Fos………………………………………….…… 4. Analyses statistiques ……………………………………………..……………...…….. RESULTATS…………………………………………………………………………………… CHAPITRE1. EFFET DE LINVALIDATION LOCALE DUBDNFDANS LEPBlSUR LANALGESIE MORPHINIQUE……………………………………………………………………………….. CHAPITRE2. VOIE PARABRACHIO-AMYGDALOÏDE,BDNFET SEVRAGE DE LA MORPHINE…. 1. Introduction……………………………………………………………………………..… 2. Résultats………………………………………………………………………….………..2.1. Immunoréactivité MOR dans la voie parabrachio-AEc…………….….……...2.2. Invalidation locale du BDNF dans le PBl : Sevrage de la morphine…….…2.2.1. Syndrome de sevrage………………………………………………………... 2.2.2. Induction de la protéine c-Fos par le sevrage précipité de la morphine…………………………………………………………………………. Activation cellulaire…………………………………………………….…...… Traçage antérograde et induction de la protéine c-Fos par le sevrage de la morphine……………………………………….……………………. 2.3. Lésion excitotoxique unilatérale du PBel…………………..……………..……2.3.1. Analgésie morphinique………………..……………………………………... 2.3.2. Sevrage précipité…………………………………………….…………….…. 2.3.3. Contrôle moteur……………………………………………………….………. 2.3.4. Validation histologique des sites de lésion………..…………………….…. 3. Discussion……………………………………………………………………………..….. 3.1. Considérations méthodologiques……………………………………………...... 3.2. Voie parabrachio-amygdaloïde : BDNF et sevrage de la morphine………..
DISCUSSION GENERALE………………………………….…………………………..……. ANNEXES……………………………………………………..……………………………….. ANNEXE1 :Mise en place d’une technique de traçage neuronal par transfert de gènesANNEXE2 :Implication dans d’autres études du laboratoire………...…………………….ANNEXE3 :Détection du BDNF par western blot………………………………….….…….ANNEXE4 :Solutions utilisées………………………………………………………………...REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………………...
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p. 55 p. 55 p. 56 p. 57 p. 58 p. 59 p. 89 p. 90 p. 92 p. 92 p. 92 p. 92 p. 93 p. 93 p. 94 p. 95 p. 95 p. 96 p. 96 p. 97 p. 98 p. 98 p. 101 p. 107
p. 115
p. 116 p. 125 p. 127 p. 131 p. 135
AEc AAV AMPAARNmBDA BDNFBLA BST BSTL CaMKII CCK CeA CeC CeL CeM CGRP CMV CPu CRE CREB CRF DAB DOR dsREDeGFP ELISAEPSC ERK GABAGFP IPAC IASP
LISTE DES ABREVIATIONS
amygdale étendue centrale particules virales adéno-associées α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate ARN messager biotine dextran amine Brain-Derived Neurotrophic Factor
noyau basolatéral de l’amygdale noyau du lit de la strie terminale noyau du lit de la strie terminale, partie latérale kinase calcium-calmoduline dépendante cholécystokinine noyau central de l’amygdale noyau central de l’amygdale, subdivision capsulaire noyau central de l’amygdale, subdivision latérale noyau central de l’amygdale, subdivision médiane Calcitonin Gene-Related Peptide cytomégalovirus caudé putamen c-AMP Response Element cAMP-calcium response element binding protein facteur de libération de l’hormone corticotrope diaminobenzidine récepteur des opioïdes de type delta protéine fluorescente de couleur rouge enhanced green fluorescent protein enzyme-linked immunosorbent assay courants post-synaptiques excitateurs
extracellular signal-regulated kinase acideγ-aminobutyrique protéine fluorescente verte noyau interstitiel de la branche postérieure de la commissure antérieure association internationale pour l’étude de la douleur
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KO KOR LA LGP LTP
knock-out récepteur des opioïdes de type kappa noyau latéral de l’amygdale globus pallidus latéral potentialisation à long terme MAP kinase mitogen-activated protein kinase récepteur métabotropiques du glutamate de type 5 récepteur des opioïdes de type mu neuronal nuclei Nerve Growth Factor N-méthyl-D-aspartate neurotrophines noyau du tractus solitaire ocytocine substance grise périaqueducale noyau parabrachial noyau parabrachial externe latéral noyau parabrachial latéral noyau parabrachial crescent latéral noyau parabrachial médian phosphatidylinositol-3 kinase phosphokinase A phosphokinase B phosphokinase C phospholipase-C gamma noyau paraventriculaire de l’hypothalamus pédoncule cérébelleux supérieur amygdale étendue sous-lenticulaire tropomyosin-related kinaseversion complète du récepteur TrkB isoforme 1 tronquée du récepteur TrkB isoforme 2 tronquée du récepteur TrkB small hair-pin RNA-TrkB small hair-pin scramble
mGluR5 MOR NeuN NGF NMDA NT NTS OT PAG PB PBel PBl PBlcr PBm PI3K PKA PKB PKC PLCγPVN scp SLEA Trk TrkB.FL TrkB.T1 TrkB.T2 ShTrkB ShSRC
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tVTA VTA WGA
queue de l’aire tegmentale ventrale aire tegmentale ventrale agglutinine du germe de blé
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FIGURE1 : FIGURE2 : TABLEAU1 :
FIGURE3 : FIGURE4 : FIGURE5 : TABLEAU2 :
FIGURE6 : FIGURE7 :
FIGURE8 : FIGURE9 : FIGURE10 : TABLEAU3 : FIGURE11 : TABLEAU4 : FIGURE12 :
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FIGURE14 : TABLEAU6 : FIGURE15 :
TABLEAU7 : FIGURE16 :
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FIGURE19 :FIGURE20 :
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FIGURE22 :
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ISTE DES TABLEAUX ET FIGURESPAGEp. 05 p. 06 p. 07 p. 11 p. 12 p. 13 p. 14 p. 15 p. 24 p. 32 p. 33 p. 43 p. 44 p. 45 p.45’p.45’’p. 46 p. 47 p. 49 p. 49 p. 51 p. 52 p. 53 p. 91 p. 91 p. 92 p. 92p. 92’’
INTRODUCTIONOrganisation du noyau parabrachial………………………................. Efférences principales du noyau parabrachial………………………...Principaux neuromédiateurs présents dans les fibres/terminaisons et/ou les somasdu noyau parabrachial …...……………….................. Anatomie du complexe amygdalien…………………...……………..Organisation de l’amygdaleétendue…………………..……………... Organisation du noyau du lit de la strie terminale………..…………...Principaux neuromédiateurs présents dans les fibres/terminaisons et/ou les somas de l’amygdale étendue centrale.……………………... Principales afférences et efférences del’amygdale étendue centrale.... Organisation topographique des projections du noyau parabrachial pontique vers les structures de l'amygdale étendue centrale………….Structure du gène et de la protéine du BDNF chez le rat…………..NTR Voies de signalisation intracellulaires des récepteurs TrkB et p75 . MATERIEL ET METHODEDélétion locale du BDNF ………………………...………………..…Anticorps utilisés pour les immunomarquages………………………Protocoles d’immunohistochimie……………………………………..Protocoles de révélation de la peroxydase………………………...….Protocole de révélation histochimique de la BDA par le système Avidine-Biotine-Peroxydase……………………………………….Protocole de révélation de la BDA couplée à un immunomarquage c-Fos…………………………………………………………………..... Récapitulatif des paramètres testés pour les immunomarquages du BDNF…………………..…………………………………………….Constructions virale ……………………………….………………….Délais d’attente après les injections stéréotaxiques...………………..Décours temporel des expériences de lésion du noyau parabrachial externe latéral par injection d'acide iboténique………………………Tests comportementaux utilisés et paramètres mesurés………...…….Tests comportementaux………………………..……………………...RESULTATSDécours temporel du sevrage de la morphine précipité par la naloxone : évaluation comportementale…………..………………….Décours temporel du sevrage de la morphine précipité par la naloxone : procédure d'induction de la protéine c-Fos………...……...Immunoréactivité MOR chez la souris………………………………..Syndrome de sevrage de la morphine : influence du KO local du BDNF dans le noyau parabrachial latéral.…………………………….Effet de la délétion locale du BDNF dans le noyau parabrachial latéral sur le syndrome de sevrage de la morphine…………….……..Influence du KO local du BDNF dans le noyau parabrachial latéral sur l'induction de la protéine c-Fos par le sevrage de la morphine
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FIGURE23 :
FIGURE24 :
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FIGURE28 : FIGURE29 :
FIGURE30 : FIGURE31 : FIGURE32 : FIGURE33 : FIGURE34 :
FIGURE35 :
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FIGURE37 :FIGURE38 :TABLEAU8 : TABLEAU9 : TABLEAU10:
précipité par la naloxone…...…………………………………………Induction de la protéine c-Fos par le sevrage de la morphine précipité par la naloxone………………………………………………………..Induction de la protéine c-Fos par le sevrage de la morphine précipité dans les régions innervées par lenoyau parabrachial externe latéral…Effet de la lésion excitotoxique du noyau parabrachial externe latéral sur l'analgésie morphinique…………………………………………...Syndrome de sevrage de la morphine : influence de la lésion excitotoxique du noyau parabrachial externe latéral .………………...Effet de la lésion excitotoxique du noyau parabrachial externe latéral sur le syndrome de sevrage de la morphine…………………...……...Coordination motrice et apprentissage moteur……………………….Contrôle histologique des lésions excitotoxiques…………………….ANNEXESSites d’injection des AAV-GFP dans le PVN………………………...Efférences du PVN……………………………………………………Sites d’injection de l’AAV-GFP dans le CPu………………………...Sites d'injection de l'AAV WGA/GFP-dsRED dans le CPu………….Sites d'injection des AAVs WGA/dsRED-GFP-2A2A et
Marquage trans-synaptique après injection d'AAV WGA/dsRED-GFP-2A2A dans le CPu………………………………………………Sites d'injection des AAVs WGA/dsRED-GFP-2A2A et WGA/dsRED-GFP-CMV dans le CeA……………………………….Protocole du western blot……………………………………………..Détection du BDNF par western blot…………………………………Solutions et gels pour western blot…………………………………...Solutions pour histologie et immunohistochimie………………….....
WGA/dsRED-GFP-CMV dans le CPu………………………………..Anesthésiques utilisés…………………………………………………
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