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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THESE présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Par Laurent MIGUET Nouvelles méthodologies dans l'analyse protéomique par spectrométrie de masse. Application à la recherche de biomarqueurs dans le cadre des leucémies. Soutenue le 8 septembre 2006 devant la commission d'examen : Dr. Alain VAN DORSSELAER Prof. Marcel HIBERT Prof. Jean-Marie SCHMITTER Dr. Thierry RABILLOUD Dr. Noelle POTIER Dr. Laurent MAUVIEUX Directeur de thèse Rapporteur interne Rapporteur externe Rapporteur externe Examinateur Examinateur

  • nouvelles méthodologies dans l'analyse protéomique

  • travail de thèse

  • problème mal posé

  • recherche de biomarqueurs dans le cadre des leucémies

  • vifs remerciements au professeur marcel


Publié le : vendredi 1 septembre 2006
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 217
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THESE présentée pour l’obtention du grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Par Laurent MIGUET Nouvelles méthodologies dans l’analyse protéomique par spectrométrie de masse. Application à la recherche de biomarqueurs dans le cadre des leucémies. Soutenue le 8 septembre 2006 devant la commission d’examen : Dr. Alain VAN DORSSELAER Directeur de thèse Prof. Marcel HIBERT Rapporteur interne Prof. Jean-Marie SCHMITTER Rapporteur externe Dr. Thierry RABILLOUD Rapporteur externe Dr. Noelle POTIER Examinateur Dr. Laurent MAUVIEUX Examinateur
A ma famille, mes amis A Vanessa
« Si vous ne pouvez expliquer un concept à un enfant de six ans, c’est que vous ne le comprenez pas complètement. » « Un problème sans solution est un problème mal posé. » A. Einstein « Ce que l'on conçoit bien s'énonce clairement, et les mots pour le dire arrivent aisément. » N. Boileau
Remerciements Pour commencer, je souhaite remercier Alain Van Dorsselaer pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et surtout pour m’avoir soutenu et encouragé tout au long de ce travail de thèse. Merci pour ses conseils et ses recommandations qui m’ont permis de développer un esprit critique ; merci de m’avoir appris mon métier : la spectrométrie de masse. Je tiens aussi à remercier l’ARC pour m’avoir financé lors de ma dernière année de thèse. J’adresse mes plus vifs remerciements au Professeur Marcel Hibert qui a accepté de présider ce jury de thèse. Je remercie également le professeur Jean-Marie Schmitter et le Docteur Thierry Rabilloud qui ont bien voulu prendre le temps de juger ce travail. Un grand merci également à Noëlle Potier pour m’avoir encadré lors de ce travail de thèse, merci pour les discussions « remonte moral » qui m’auront permis de « recharger les batteries », merci pour m’avoir fait confiance sur les différents projets que tu m’as confiés. Ce travail de thèse n’aurait pas pu aboutir sans la profonde collaboration qui s’est mise en place avec le docteur Laurent Mauvieux. Je tiens tout particulièrement à le remercier pour nos longues discussions et pour la dynamique qu’il a su insuffler aux différents projets que nous avons menés ensemble. Je tiens aussi à remercier l’équipe d’Isabelle Schalk pour l’étude sur Pseudomonas aeruginosa.Enfin un grand merci à tout le LSMBO avec, dans le désordre : Guillaume C. qui m’aura appris à faire mes premiers pas dans la spectrométrie de masse et pour nos nombreuses soirées passées ensemble à se serrer les coudes ou à s’entretuer sur internet. Je te souhaite le plus beau mariage du monde (après le mien…) ; Christine C. qui aura eu le mérite de me supporter dans le bureau pendant toutes ces années ; Haiko, compagnon de repas qui est le prochain sur la liste (tu vas voir ça va bien se passer) ; Philippe avec qui le SELDI aura été une belle aventure.
Merci à tous ceux qui prennent la relève : Seb pour les discussions et les manips sur la chromato, mais aussi pour nos longues conversations footballistiques (Allez Racing…) ; Audrey pour le peps et la bonne humeur quotidienne (tu as encore de la marge avant de ressembler au robot d’Actarus). Merci à la Jeunesse : Laetitia, n’oublie pas de te faire ton emploi du temps et tu verras ça ira tout seul, Agnès et son Hercule j’espère que le canapé va tenir, Julien qui va découvrir la Hollande pendant que je découvrirai l’Angleterre (merci pour les matchs), Cédric qui, bien que supporter de l’OM, ira loin en SM, et Guillaume B., merci pour avoir fait un super travail sur la repro ; je te souhaite beaucoup de réussite pour le reste. Merci aux post-docs, nouveaux et anciens, Flavie et Dimitri pour leurs réponses aux questions biologiques, Andy pour ses cours d’anglais qui vont me servir de l’autre côté de la Manche, et à Fabrice B., un merci spécial pour ses corrections, pour tout le temps qu’il aura passé à m’aider et pour ses discussions sur les statistiques. J’espère que tu ferras ton trou dans le monde de la spectro de masse. Merci aux permanents : Danièle pour avoir pris le temps de m’apprendre à travailler proprement et à faire des gels droits, Sarah et ses rédactions de projets incessantes, Christine S. et tous ses conseils sur la chromatographie, JMS pour ses nombreuses photos au cours de toutes nos péripéties, Manue pour ses discussions sur la protéomique, Véro et ses attentions permanentes, Raymond et ses conseils aussi bien sur les machines que sur la Vie, et René pour ses conseils bricolages. Enfin un merci spécial aux deux occupants de mon « deuxième bureau » Hélène et Fabrice (version alpha), ce n’est qu’une page qui se tourne mais il en reste beaucoup à écrire, n’oubliez pas de me rendre visite à Oxford… Et à tous ceux que j’ai oubliés, Merci.
PLAN GENERAL
Introduction générale............................................... 13
Les objectifs de ce travail de thèse ...............................................................................15
Partie I : Introduction à la protéomique et à la peptidomique,
bibliographie et mise en œuvre expérimentale .................... 17
Chapitre I : Objectifs de l’approche protéomique.......................................................19
Chapitre II : L’outil Spectrométrie de Masse pour l’étude protéomique. Principes
et description....................................................................................................................... 26
Chapitre III : Mise en œuvre expérimentale et méthodologie : De la préparation
de l’échantillon à l’analyse par spectrométrie de masse, le cas des protéines
membranaires........................................................................................................................51
Partie II : Résultats ............................................... 81
Chapitre I : Analyse différentielle et quantification par spectrométrie de masse
de protéines issues de mélanges complexes ......................................... 83
Chapitre II : Elaboration de nouveaux outils et
de nouvelles stratégies
analytiques appliqués à l’analyse des protéines membranaires par
spectrométrie de masse .......................................................................... 103
Chapitre III : Recherche de nouveaux biomarqueurs dans le cadre des
hémopathies lymphoïdes chroniques ..................................................... 159
Conclusions générales ....................................................................................................... 199
Partie Expérimentale........................................................................................................205
Annexes ............................................................................................................................... 219
1
2
PLAN DETAILLE
Introduction générale .......................................................................13
Les objectifs de ce travail de thèse...................................................................... 15
Introduction à la Protéomique et à la peptidomique, Bibliographie
et Mise en œuvre Expérimentale .....................................................17 ................................................................................................................
Chapitre I : Objectifs de l’approche protéomique............................................... 19
1) Définition de la protéomique ............................................................................................... 19
2) Approche protéomique descriptive : Obtenir un catalogue ................................................. 20
3) Approche protéomique différentielle et quantification........................................................ 22
4) Recherche de modifications post-traductionnelles .............................................................. 22
5) Protéomique Clinique et recherche de biomarqueurs .......................................................... 23
6) La complexomique : étude de la machinerie cellulaire........................................................ 24
7) Utilité de la spectrométrie de masse pour l’étude protéomique........................................... 25
Chapitre II : L’outil Spectrométrie de Masse pour l’étude protéomique. Principes et descriptions...................................................................................... 26
1) Les sources........................................................................................................................... 26
1.1) Source par ionisation électrospray (ESI)........................................................................... 27 1.1.1) La production de gouttelettes chargées à partir d’une solution ......................... 27 1.1.2) Fission des gouttelettes chargées, l’explosion coulombienne ........................... 28 1.1.3) Emission des ions en phase gazeuse.................................................................. 29 1.1.3.1) Modèle de Dole (la charge résiduelle)............................................... 29 1.1.3.2) Modèle d’Iribarne et de Thomson ..................................................... 30 1.1.4) Miniaturisation des sources électrospray........................................................... 30
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