Présentée pour l'obtention du grade de

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THESE Présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG (Ecole doctorale des sciences chimiques moléculaires et supramoléculaires de Strasbourg) par Guillaume CHEVREUX Etude des interactions moléculaires spécifiques par spectrométrie de masse : application à la chimie du vivant Soutenue le 25 octobre 2005 devant la commission d'examen : Dr. Alain VAN DORSSELAER Directeur de thèse Prof. Jacques HAIECH Rapporteur interne Prof. Jean-François MULLER Rapporteur externe Dr. Bernard MONSARRAT Rapporteur externe Dr. Michel ROBIN Examinateur Dr. Noëlle POTIER Examinateur

  • spectrométrie de masse

  • ecole doctorale des sciences chimiques

  • docteur de l'universite louis

  • laboratoire de spectrométrie de masse bio-organique


Publié le : samedi 1 octobre 2005
Lecture(s) : 60
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 198
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THESE




Présentée pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

(Ecole doctorale des sciences chimiques moléculaires et supramoléculaires de Strasbourg)

par

Guillaume CHEVREUX





Etude des interactions moléculaires spécifiques par spectrométrie de
masse : application à la chimie du vivant





Soutenue le 25 octobre 2005 devant la commission d’examen :

Dr. Alain VAN DORSSELAER Directeur de thèse
Prof. Jacques HAIECH Rapporteur interne Jean-François MULLER Rapporteur externe
Dr. Bernard MONSARRAT
Dr. Michel ROBIN Examinateur
Dr. Noëlle POTIER Exam


























« Il vaut mieux suivre le bon chemin en boitant que le mauvais d'un pas ferme. » (Saint Augustin)




























REMERCIEMENTS

Ce travail de thèse a été réalisé au Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-Organique de
Strasbourg, sous la direction de Mr. Alain Van Dorsselaer.


Je souhaite tout d’abord témoigner ma profonde reconnaissance à Alain Van Dorsselaer de m’avoir
accueilli dans son laboratoire et m’avoir permis de découvrir dans un cadre studieux et agréable la
spectrométrie de masse, la biologie et la recherche.


J’adresse mes profonds remerciements à Sanofi-Aventis pour le financement de cette thèse et plus
particulièrement à Mr. Michel Robin (l’initiateur de cette aventure) qui a apporté beaucoup d’énergie,
d’idées et de bonne humeur.


Je remercie sincèrement Noelle Potier de m’avoir patiemment guidé tout au long de ce travail,
encouragé dans les moments difficiles et surtout de l’amitié qu’elle m’a témoigné.


Ce travail étant le fruit de nombreuses collaborations, j’exprime mes remerciements à toutes les
personnes qui y ont contribué et plus particulièrement à Anne Houdusse pour son enthousiasme
communicatif.


Je remercie bien sûr amicalement toute l’équipe du LSMBO qui m’a elle aussi soutenu et avec qui j’ai
passé d’agréables moments.
Un grand merci à vous :

Laurent, Fabrice V et B, Hélène, Jonathan, Véro, Rosella, Steph, Claude, Sarah, Nathalie, Audrey,
Sébastien, Danièle, Haïko, Emmanuelle, Raymond, René, Christine C et S, François, Junior, Dominique D et
R, Dimitri, Cécile, Xiuli.


Enfin, un grand merci à mes proches :

A ma famille,
A mes voisins, les guillaume(s)
A Agathe



























































Plan général

PLAN GENERAL


INTRODUCTION GENERALE .......................................................... 11
Les objectifs de ce travail de thèse .................................................................... 13

INTRODUCTION, BIBLIOGRAPHIE ET MISE EN OEUVRE EXPERIMENTALE ... 15

CHAPITRE I : Introduction aux interactions moléculaires et à leurs techniques d’analyse ......... 17

CHAPITRE II : Théorie et appareillage ................................................................. 27

CHAPITRE III : Mise en œuvre expérimentale et méthodologie ...................................... 39

Références bibliographiques .............................................................................. 57

RESULTATS ............................................................................ 71

CHAPITRE I : Utilisation de la SM pour découvrir et développer de nouvelles molécules
à visée thérapeutique .................................................................... 73

CHAPITRE II : Etude de mécanismes biologiques impliquant des interactions moléculaires ........ 109

CHAPITRE III : Suivi de la dynamique d’échange dans le temps de complexes non-covalents .... 179

Références bibliographiques ............................................................................ 191

CONCLUSION GENERALE ........................................................... 197

PARTIE EXPERIMENTALE ........................................................... 203


- 1 -























































- 2 - Plan détaillé
PLAN DETAILLE

INTRODUCTION GENERALE ........................................................... 11
Les objectifs de ce travail de thèse ..................................................................... 13

INTRODUCTION, BIBLIOGRAPHIE ET MISE EN OEUVRE EXPERIMENTALE ... 15

CHAPITRE I : Introduction aux interactions moléculaires et à leurs techniques d’analyse .......... 17
I. Les différents types d’interactions rencontrées dans des complexes biologiques non-covalents ... 17
1. Forces électrostatiques ............................................................................................................................ 17
1.1. Interactions ioniques ....................................................................................................................... 17
1.2. Interactions de Van der Waals ........................................................................................................ 18
1.2.1. Effet de Keesom (interactions dipôle-dipôle).......................................................................... 18
1.2.2. Effet d’induction de Debye (interactions dipôle-dipôle induit)................................................. 19
1.2.3. Effet de dispersion de London (interactions dipôle induit-dipôle induit).................................. 19
1.2.4. Energie et rayon de Van der Waals ………………………………………………………………. 20
2. Liaison hydrogène .................................................................................................................................... 20
3. Effet hydrophobe ...................................................................................................................................... 21
4. Le rôle des ponts disulfures dans les protéines : un renforcement de la structure tridimensionnelle ...... 21
5. Les interactions moléculaires sont dépendantes du milieu : importance pour la conformation
d’une protéine ............................................................................................................................................ 22
II. Les techniques d’analyse des interactions inter-moléculaires ............................................................. 22
1. Les techniques physiques actuelles ......................................................................................................... 22
1.1. Les méthodes spectroscopiques (UV, fluorescence) ...................................................................... 22
1.2. La microcalorimétrie ........................................................................................................................ 22
1.3. Le biacore ....................................................................................................................................... 23
1.4. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ................................................................................. 24
1.5. La Diffraction des Rayons X (DRX) ................................................................................................ 24
2. La spectrométrie de masse électrospray : une nouvelle méthode d’analyse des complexes
non-covalents ............................................................................................................................................ 25

CHAPITRE II : Théorie et appareillage ................................................................. 27
I. La spectrométrie de masse électrospray : la technique d’ionisation de choix pour l’étude des
complexes non-covalents ......................................................................................................................... 27
1. Historique ................................................................................................................................................. 27
2. Le spectromètre de masse électrospray .................................................................................................. 27
2.1. La production des ions en phase gazeuse par électrospray .......................................................... 28
2.1.1. La production des gouttelettes chargées à partir d’une solution ........................................... 28
2.1.2. L’explosion coulombienne ..................................................................................................... 30
- 3 - Plan détaillé
2.1.3. Le transfert des ions en phase gazeuse ............................................................................... 30
2.2. L’interface ....................................................................................................................................... 31
2.3. Les analyseurs ............................................................................................................................... 32
2.3.1. Performances d’un analyseur ............................................................................................... 32
2.3.2. L’analyseur quadripolaire (Q) ............................................................................. 33
2.3.3. L’analyseur à temps de vol (TOF) ........................................................................................ 35
II. Les appareils utilisés au laboratoire ....................................................................................................... 37
1. Le LCT (Micromass, Manchester, UK) .................................................................................................... 37
2. Le Q-TOF (Micromass, Manchester, UK) ................................................................................................ 37
3. Le micrOTOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) .............................................................................. 38

CHAPITRE III : Mise en œuvre expérimentale et méthodologie ...................................... 39
I. Deux types de spectrométrie de masse : la spectrométrie de masse moléculaire et
supramoléculaire ....................................................................................................................................... 39
II. Mise au point et instrumentation en spectrométrie de masse supramoléculaire ............................... 39
1. Importance de la préparation de l’échantillon .......................................................................................... 39
1.1. Les tampons compatibles avec l’analyse de masse ....................................................................... 39
1.2. Les différentes techniques d’échange de tampon .......................................................................... 41
2. Optimisation des paramètres d’analyse du spectromètre de masse ....................................................... 41
2.1. Les paramètres importants pour la conservation des interactions non-covalentes en phase
gazeuse ........................................................................................................................................... 41
2.2. Les paramètres importants pour la transmission des ions en phase gazeuse ............................... 44
III. Les informations obtenues et leur validité .............................................................................................. 45
1. Les informations déduites de la spectrométrie de masse ........................................................................ 46
1.1. Détermination de la stœchiométrie des espèces formées en solution ........................................... 46
1.2. La spécificité des interactions détectées ........................................................................................ 46
1.3. Evaluation de l’affinité en solution .................................................................................................. 47
1.4. Suivi de la conformation des biomolécules .................................................................................... 48
1.5. Evaluation de la nature des interactions (électrostatique ou effet hydrophobe) par dissociation
en phase gazeuse ........................................................................................................................... 49
1.5.1. Les interactions moléculaires sont modifiées en phase gazeuse .......................................... 50
1.5.2. La conformation native d’une protéine est elle maintenue en phase gazeuse ? ................... 50
1.5.3. Intérêt de la dissociation en phase gazeuse ......................................................................... 52
2. Validité de l’approche ............................................................................................................................... 53
2.1. Les molécules non-volatiles peuvent s’agréger non-spécifiquement sur les biomolécules ............ 53
2.2. L’équilibre chimique en solution est-il déplacé durant le processus électrospray? ......................... 53
2.3. Réactions d’association ou de dissociation des molécules en phase gazeuse ............................. 54
IV. Conclusion de cette étude bibliographique et perspectives d’études ................................................. 54
Références bibliographiques .............................................................................. 57

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