THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE STRASBOURG I

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE STRASBOURG I Discipline : Sciences du vivant Spécialité : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie présentée à la Faculté des Sciences de la Vie par Marie UMBER pour obtenir le titre de Docteur de l'Université Louis Pasteur ETUDE DE L'ONCOGENE ORF8 D'AGROBACTERIUM soutenue le 08 octobre 2004 devant le jury composé de : Prof. L. OTTEN Directeur de thèse Prof. F. BERNIER Rapporteur interne Dr.C. d'HULST Rapporteur externe Dr. X. NESME Rapporteur externe Institut de Biologie Moléculaire des Plantes UPR CNRS 2357

  • département de biologie cellulaire

  • bernier rapporteur interne

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  • institut de biologie moléculaire des plantes upr

  • membre de jury

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Publié le : vendredi 1 octobre 2004
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE STRASBOURG I
Discipline : Sciences du vivant
Spécialité : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
présentée à la Faculté des Sciences de la Vie
par
Marie UMBER
pour obtenir le titre de
Docteur de l’Université Louis Pasteur
ETUDE DE L’ONCOGENE ORF8 D’AGROBACTERIUM
soutenue le 08 octobre 2004 devant le jury composé de :
Prof. L. OTTEN Directeur de thèse
Prof. F. BERNIER Rapporteur interne
Dr.C. d’HULST Rapporteur externe
Dr. X. NESME R
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes
UPR CNRS 2357A ma familleCe travail de thèse a été effectué au Département de Biologie Cellulaire de l’Institut de Biologie Moléculaire des
Plantes, sous la direction du Professeur Léon Otten.
Grand merci à Léon pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et m’avoir encadrée durant cette thèse. Il m’a
témoigné une grande attention sur le déroulement de mon travail et a fait preuve de beaucoup de considération envers
moi. J’espère avoir acquis pendant ces quatre ans passés en sa compagnie toute la curiosité scientifique et l’ouverture
d’esprit qui le caractérise.
Je remercie vivement les membres du jury, François Bernier, Christophe d’Hulst et Xavier Nesme, d’avoir accepté de
juger ce travail.
Merci aux membres du labo 626, anciens ou nouveaux, qui m’ont aidée dans mon travail et m’ont supportée en tant
que voisine de paillasse. Merci à ma thésarde Anne, pour m’avoir initié aux joies du clonage avec tant de patience, merci à
Bernadette, pour sa constance, son calme et son efficacité, merci à P’tit Louis, pour m’avoir fait passer une année
merveilleuse, grâce à sa taquinerie et sa présence et enfin merci à mes stagiaires, Christel, Sylviane et Anne, pour m’avoir
épaulée avec tant de détermination et pour avoir apporté leur sourire à toutes ces journées de travail.
Je remercie très chaleureusement les jardiniers de l’IBMP, Sébastien Staerck, Richard Wagner, Aurélie Bailly et
Michel Kernéis, pour s’être occupés avec tant de patience de mes nombreuses plantes qui envahissaient leurs serres.
Le service de bioinformatique m’a été d’une grande aide quelques semaines avant de finir cette thèse, et je remercie
très sincèrement Valérie Cognat pour ses beaux alignements de séquences colorés qui illustrent cette thèse et surtout pour
sa patience. Merci également à Marc Bergdoll pour son étude sur la protéine A4-Orf8.
Merci au service séquençage, Philippe Hammann et Malek Alioua, pour leur efficacité et leur rapidité face à tous ces
clones que j’ai voulu séquencer, avec plus ou moins de succès.
Merci à Denise Meyer pour m’avoir guidée dans la préparation de coupes pour des immunolocalisations, même si ce
travail n’a pas encore porté ses fruits, pour ses discussions médicales et sa patience. Merci à Mathieu Erhardt pour avoir
tenté des localisations au microscope électronique avec mes plantes, mais aussi pour sa bonne humeur et sa gentillesse.
Merci à Jérôme Mutterer pour son initiation rapide, mais efficace, au microscope confocal, et encore félicitations.
Merci à André Steinmetz pour m’avoir si généreusement donné quelques µL de son plasmide pNTL2104.
Enfin, je tiens à exprimer ma reconnaissance au laboratoire d’Andréas Weber à Cologne, qui m’a accueillie avec
chaleur afin de m’initier à l’assimilation de CO radioactif par mes plantes, et plus particulièrement à Andréas qui a pris2
sur son temps pour m’encadrer et Lars pour son entière disponibilité et sa pédagogie.
Ensuite, je remercie les membres de la confrérie des grimpeurs, le mardi ou le jeudi entre midi et deux, Malek,
Herrade, Didier, Esther et Anne, pour m’avoir fait découvrir l’escalade et m’y avoir fait prendre goût. Je regretterai ces
moments à la fois de détente et d’efforts intenses.
Merci à Herrade, ma Maman d’adoption, pour son accueil si chaleureux dans le cercle fermé du quatrième étage,
pour son écoute, sa tendresse, son amitié et sa disponibilité.
Je remercie particulièrement toutes les personnes du café du quatrième, Yves, Marie-Claire, Pascal, Thomas et
Monika, pour toutes ces pauses en leur compagnie. Merci à Esther et Arnaud pour m’avoir soutenue pendant toutes ces
années, pour leur aide précieuse de tous les instants et pour leur sourire.
Merci à tous ceux qui m’ont aidée dans mon travail lorsque j’ai rencontré des problèmes techniques, Guillaume,
Laurent, Marina et j’en oublie beaucoup.
Merci aux amis de l’IBMP, ceux qui m’ont soutenue pendant ces quatre ans. Marina, ton amitié et ton écoute m’ont
permis de surmonter les moments difficiles, grâce à ton sourire et ton rire inoubliable. Merci à Alexis, pour toutes nos
chamailleries et nos rigolades. Merci aux ‘girls’ de la cantine, Rozenn, Thalia, Valérie, Céline et Didier, perdu au milieu de
toutes ces filles. Merci à Nanard, pour nos virées à la gravière ou à Caracalla. Merci à Guillaume, pour avoir partagé avec
moi ses goûts musicaux et littéraires.
Un grand merci à Antoine, qui a toujours été disponible pour moi lorsque j’avais des ennuis mécaniques, et mon vélo
lui en est reconnaissant.Merci à tous les autres membres de l’IBMP, ceux que j’ai oubliés et qui sont indispensables, Josette, Marie-Jeanne,
Martine et d’autres encore.
Un grand merci particulier à mes fistons messins, Philippe, Seb et Laurent, qui malgré la distance et le temps qui
passe ne m’ont jamais oubliée et ont toujours été contents de me revoir quand je passais à Metz. Je remercie spécialement
Philippe pour toute l’amitié qu’il me témoigne.
Merci à Stephele, ma petite belge d’adoption, qui m’a fait passer deux années de folie à la découverte de Strasbourg.
Merci à mon Seppele de m’avoir fait découvrir un monde que je ne connaissais pas.
Je remercie vivement tous mes amis de la ‘bande à Féfé’ d’avoir toujours été présents et de m’avoir acceptée dans
leur groupe. Merci particulier à Romain, Even, Did et Céline pour avoir bien voulu partager leurs soirées avec moi.
Je tiens à remercier mes parents, pour m’avoir guidée dans la vie et fait profiter de leur culture musicale et
scientifique, et merci particulier à mon père, qui m’a sans doute transmis ses gènes de la curiosité scientifique. Plein de
mercis à Jean, Anne, Jacques, Claire, Thérèse, Pierre, Odile et Emmanuelle, pour toute l’affection qu’ils me portent et que
seuls peuvent apporter des frères et sœurs. Leur présence me permet de me ressourcer et de ne pas oublier d’où je viens.
Merci enfin à Félix, pour tout ce qu’il m’a apporté et pour être simplement ce qu’il est.Sommaire

Sommaire


Introduction

I. Agrobacterium............................................................................................................... 1
1. Concepts généraux ................................................................................................................... 1
1.1. Le T-DNA ....................................................................................................................................... 1
1.2. La prolifération cellulaire................................................................................................................ 2
1.2.1. La galle du collet ........................................................................................................................ 2
1.2.2. Les chevelus racinaires............................................................................................................... 2
2. Processus d’infection................................................................................................................ 4
2.1. Reconnaissance bactérie/hôte.......................................................................................................... 4
2.2. Induction des gènes vir.................................................................................................................... 4
2.3. Transfert du T-DNA........... 5
2.3.1. Production du brin T................................................................................................................... 5
2.3.2. Le transporteur T.......... 6
2.3.3. Intégration dans le génome de l’hôte.......................................................................................... 6
II. Contenu du T-DNA et fonction des gènes .................................................................. 7
1. Synthèse des opines .................................................................................................................. 7
2. Synthèse d’hormones... 8
2.1. Agrobacterium tumefaciens et vitis ................................................................................................. 8
2.2. Agrobacterium rhizogenes .............................................................................................................. 9
3. La famille rolB.......................................................................................................................... 9
3.1. Les gènes rol ................................................................................................................................. 10
3.1.1. Le gène rolA ............................................................................................................................. 10
3.1.1.1. Phénotype des plantes transgéniques rolA ...................................................................... 10
3.1.1.2. Expression du gène rolA 11
3.1.1.3. Autres propriétés du gène rolA ....................................................................................... 12
3.1.2. Le gène rolB 12
3.1.2.1. Phénotype des plantes transgéniques rolB 12
3.1.2.2. Sensibilité à l’auxine induite par rolB............................................................................. 13
3.1.2.3. Expression et localisation la protéine RolB .................................................................... 14
3.1.3. Le gène rolC 15
3.1.3.1. Phénotype des plantes transgéniques rolC...................................................................... 15
3.1.3.2. Hormones végétales et rolC............................................................................................ 16
3.1.3.3. Expression et localisation de la protéine RolC................................................................ 17
3.1.3.4. Autres propriétés du gène rolC ....................................................................................... 17
3.1.4. Le gène rolD............................................................................................................................. 17
3.2. Le gène 6b..................................................................................................................................... 18
3.2.1. Pouvoir oncogénique de 6b ...................................................................................................... 18
3.2.2. Phénotype des plantes transgéniques 6b................................................................................... 19
3.2.3. Expression et localisation la protéine 6B.................................................................................. 20
3.2.4. Autres propriétés du gène 6b.................................................................................................... 20
3.3. Le gène orf8... 21
3.3.1. Structure du gène orf8 et homologies avec le gène iaaM......................................................... 21
3.3.2. Activité tryptophane mono-oxygénase de protéine Orf8.......................................................... 21
3.3.3. Le gène orf8 et l’auxine............................................................................................................ 22
3.3.4. Phénotype des plantes transgéniques orf8 ................................................................................ 22
3.3.5. Expression et localisation de la protéine Orf8.......................................................................... 22
3.3.6. Comparaison fonctionnelle des gènes A4-orf8 et A-iaaM ....................................................... 22
3.4. Les autres membres de la famille rolB.......................................................................................... 23
3.4.1. Les gènes orf13 et orf14........................................................................................................... 23
3.4.1.1. Propriétés du gène orf13 ................................................................................................. 23


3.4.1.2. Propriétés du gène orf14 ................................................................................................. 24
3.4.2. Le gène orf3n............................................................................................................................ 24
3.4.3. Le gène rolB .......................................................................................................................... 24 TR
3.4.4. Le gène 5 .................................................................................................................................. 25
3.4.5. Le gène e et le gène f ................................................................................................................ 26
3.4.6. Le gène lso.26
3.4.7. Le gène 3’.. 26
3.4.8. Les gènes c et c’ ....................................................................................................................... 27
3.4.9. Le gène 6a.27
3.5. Les homologues des gènes rolB-like chez les plantes................................................................... 27
3.5.1. Le gène NgrolB ........................................................................................................................ 27
3.5.2. Le gène NgrolC 28
3.5.3. Les gènes Ngorf13 et Ngorf14.................................................................................................. 29
3.5.4. Le gène trolC 29
3.5.5. Les gènes torf13 et torf14......................................................................................................... 29
3.6. Conclusions sur la famille rolB..................................................................................................... 29
III. Transport des sucres chez le tabac ........................................................................... 31
1. Les vaisseaux du phloème...................................................................................................... 31
1.1. Organisation du système vasculaire ..............................................................................................31
1.2. Formation du système vasculaire .................................................................................................. 32
1.3. Architecture du phloème ............................................................................................................... 32
1.3.1. Formation du complexe CC-TC ............................................................................................... 32
1.3.2. Communication au sein du complexe CC-TC .......................................................................... 33
1.3.3. Molécules présentes dans la sève de phloème 33
1.3.3.1. Molécules ‘classiques’.................................................................................................... 33
1.3.3.2. Les protéines...................................................................................................................33
1.3.3.3. Les ARNs........................................................................................................................34
2. Les plasmodesmes .................................................................................................................. 34
2.1. Biogenèse et architecture des plasmodesmes ................................................................................ 34
2.1.1. Biogenèse des plasmodesmes................................................................................................... 35
2.1.2. Architecture des plasmodesmes................................................................................................ 35
2.1.3. Etats fonctionnels des plasmodesmes....................................................................................... 35
2.2. Les macromolécules traversant les plasmodesmes........................................................................ 36
2.2.1. Les protéines de mouvement virales......................................................................................... 36
2.2.2. Les protéines endogènes........................................................................................................... 36
2.2.3. Les acides ribonucléiques......................................................................................................... 37
2.3. Mécanismes de mouvement des macromolécules......................................................................... 37
2.3.1. Augmentation de la TLE ..........................................................................................................37
2.3.2. Passage à travers les plasmodesmes 38
2.4. Rôle des plasmodesmes dans le développement des plantes......................................................... 38
3. Transition puits/source.. 39
3.1. Maturation structurale des feuilles ................................................................................................ 39
3.2. Origine du carbone dans les feuilles puits..................................................................................... 39
4. Transport du saccharose chez le tabac................................................................................. 40
4.1. Chargement dans les vaisseaux du phloème 40
4.2. Circulation dans le tube criblé....................................................................................................... 40
4.3. Déchargement dans les tissus puits ............................................................................................... 41
IV. Présentation de ce travail de thèse............................................................................ 42


Chapitre I
Caractérisation de plantes transgéniques exprimant le gène A4-orf8
et chacune de ses deux parties

I. Les plantes 2x35S::A4-Norf8 .................................................................................... 43
1. Phénotype des plantes 2x35S::A4-Norf8 .............................................................................. 43
1.1. Les plantes 2x35S::A4-Norf8-32HE ............................................................................................. 44
1.2. antes 2x35S::A4--5HE ............................................................................................... 44
1.3. Les plantes 2x35S::A4-Norf8-32HO 44
1.4. antes 2x35S::A4--5HO 44
2. Caractérisation des plantes 2x35S::A4-Norf8...................................................................... 45
3. Discussion et perspectives pour les plantes 2x35S::A4-Norf8 ............................................ 53
3.1. Comparaison des plantes 2x35S::A4-Norf8 et 35S::A4-rolC ....................................................... 53
3.2. Localisation de la partie A4-NOrf8.. 53
II. Les plantes 2x35S::A4-orf8........................................................................................ 55
1. Régénération des plantes 2x35S::A4-orf8 ............................................................................ 55
2. Phénotype des plantes 2x35S::A4-orf8 ................................................................................. 55
2.1. Description des régénérants primaires .......................................................................................... 56
2.2. s plantes à une copie retenues ................................................................................ 56
2.2.1. Les plantes 2x35S::A4-orf8-6HO, -16HO et -33HO................................................................ 56
2.2.2. antes 2x35S::A4-orf8-5HO............................................................................................. 56
2.2.3. Les plantes 2x35S::A4-orf8-14HO........................................................................................... 57
2.2.4. antes 2x35S::A4-orf8-20HO 57
3. Coupes histologiques des feuilles 2x35S::A4-orf8-5HO ...................................................... 57
4. Dosage des sucres dans les plantes 2x35S::A4-orf8............................................................. 58
5. Sensibilité des plantes 2x35S::A4-orf8 à l’auxine................................................................ 58
6. Discussion et perspectives pour les plantes 2x35S::A4-orf8 ............................................... 59
6.1. Les plantes 2x35S::A4-orf8 et AvrBs3 ......................................................................................... 59
6.2. Etudes histologiques des plantes 2x35S::A4-orf8......................................................................... 59
6.3. Localisation de la protéine A4-Orf8.............................................................................................. 60
6.4. Implication de la partie A4-COrf8 ................................................................................................ 60
III. Les plantes 2x35S::A4-Corf8..................................................................................... 61
1. Régénération des plantes 2x35S::A4-Corf8.......................................................................... 61
2. Phénotype des plantes 2x35S::A4-Corf8............................................................................... 61
3. Dosage des sucres dans les plantes 2x35S::A4-Corf8 .......................................................... 61
4. Sensibilité des plantes 2x35S::A4-Corf8 à l’auxine ............................................................. 62
5. Discussion et perspectives pour les plantes 2x35S::A4-Corf8............................................. 62
5.1. Rôle de la partie A4-COrf8 dans la protéine A4-Orf8 entière....................................................... 62
5.2. Effets antagonistes de A4-NOrf8 et A4-COrf8 ............................................................................. 62
5.3. Localisation de la partie A4-COrf8............................................................................................... 63
IV. Croisements entre les plantes 2x35S::A4-Norf8 et 2x35S::A4-Corf8 .................... 64
1. Choix des plantes 2x35S::A4-Norf8 et 2x35S::A4-Corf8 .................................................... 64
1.1. Conditions nécessaires pour ce croisement ................................................................................... 64
1.2. Les lignées 2x35S::A4-Norf8 et 2x35S::A4-Corf8 retenues......................................................... 64
2. Phénotype des plantes 2x35S::A4-Norf8+2x35S::A4-Corf8................................................ 65


3. Dosage de l’amidon dans les plantes 2x35S::A4-Norf8+2x35S::A4-Corf8 ........................ 65
4. Discussion et perspectives des plantes 2x35S::A4-Norf8A4-Corf8...................... 65
V. Conclusions et perspectives générales ...................................................................... 67
1. Fonction de la partie A4-NOrf8 ............................................................................................ 67
2. a partie A4-COrf8 67
2.1. Fonction de la partie A4-COrf8 seule ........................................................................................... 67
2.2. la partie A4-COrf8 au sein de la protéine entière ...................................................... 68


Chapitre II
Localisation de la protéine A4-Orf8 et ses deux domaines

I. Constructions des protéines de fusion avec la GFP3 .............................................. 69
1. La GFP (Green Fluorescent Protein) ................................................................................... 69
2. Construction des gènes de fusion .......................................................................................... 69
3. Insertion des différents membres des fusions dans le vecteur pCK .................................. 70
3.1. Le vecteur pCK ............................................................................................................................. 70
3.2. Amplification des différents membres et clonage dans pCK ........................................................ 70
4. Insertion des différents constructions dans le vecteur pBi121.2 ........................................ 71
4.1. Le vecteur pBi121.2 ...................................................................................................................... 71
4.2. Clonage dans pBi121.2 et intégration dans A. tumefaciens........................................................... 71
5. Vérification de la taille des protéines de fusion ................................................................... 71
II. Localisation de la protéine A4-NOrf8 ...................................................................... 73
1. Expression transitoire dans des feuilles de Nicotiana rustica ............................................. 73
1.1. Observation en conditions normales ............................................................................................. 73
1.2. Observation dans des cellules plasmolysées ................................................................................. 73
1.3. Observation de préparations de paroi............................................................................................74
1.4. Limites du système infiltration de feuille......................................................................................74
2. Expression stable dans des plants de Nicotiana tabacum.................................................... 74
2.1. Régénération des plantes 2x35S::A4-Norf8:gfp3.......................................................................... 75
2.2. Phénotype des plantes 2x35S::A4-Norf8:gfp3 .............................................................................. 75
2.3. Localisation de la protéine de fusion............................................................................................. 75
3. Discussion et perspectives sur la localisation de la protéine A4-NOrf8............................. 76
3.1. A4-NOrf8 et les plasmodesmes..................................................................................................... 76
3.2. Vérification de l’hypothèse plasmodesme 77
III. Localisation des protéines A4-Orf8 et A4-COrf8.................................................... 78
1. Les protéines de fusion A4-COrf8:GFP3 et GFP3:A4-COrf8............................................ 78
1.1. Expression transitoire dans des feuilles de Nicotiana rustica ....................................................... 78
1.2. Expression stable dans des plants de Nicotiana tabacum.............................................................. 78
1.2.1. Régénération des plantes MRx et MTx .................................................................................... 78
1.2.2. Phénotype des plantes MRx et MTx......................................................................................... 79
1.2.3. Localisation des protéines de fusion 79
1.3. Conclusions et perspectives sur la localisation de A4-COrf8 79
2. Les protéines de fusion A4-Orf8:GFP3 et GFP3:A4-Orf8 ................................................. 79
2.1. Expression transitoire dans des feuilles de Nicotiana rustica ....................................................... 79
2.2. Expression stable dans des plants de Nicotiana tabacum.............................................................. 80
2.2.1. Régénération des plantes MPx et MQx 80
2.2.2. Phénotype des plantes MPx et MQx 80
2.2.3. Localisation des protéines de fusion 81
2.3. Discussion et perspectives sur la localisation de A4-Orf8 ............................................................ 81
2.3.1. La double localisation de la protéine A4-Orf8 ......................................................................... 81
2.3.2. Vérification de la double localisation....................................................................................... 81
IV. Utilisation de l’épitope HA ........................................................................................ 83
1. La séquence tag utilisé ........................................................................................................... 83
2. Construction des gènes de fusion .......................................................................................... 83
2.1. Clonage dans le vecteur pCK ........................................................................................................ 83
2.2. Clona pBi121.2 et intégration dans A. tumefaciens........................................................... 84

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