Thèse présentée pour obtenir le grade de

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
- 1 - Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant Par Gaëlle LAPOUGE MECANISMES D'ACTION D'UNE NOUVELLE CLASSE DE MUTATIONS DU RECEPTEUR DES ANDROGENES DANS LES CANCERS DE LA PROSTATE Soutenue publiquement le 12 avril 2007 Membres du jury Directeur de thèse : M. Jocelyn CERALINE, MCU-PH/HDR, EA 3430-ULP Rapporteur Interne : M Bruno CHATTON, Professeur, UMR7175-ULP Rapporteur externe : M. Gwendal LAZENNEC, HDR, INSERM U540 Rapporteur Externe : M. Stéphane OUDARD, PU-PH, Hôpital Européen Georges Pompidou Examinateur : M. Hervé LANG, PU-PH, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

  • ra q640x

  • voie de l'interleukine

  • ra q640x sur l'expression

  • description du récepteur des androgènes

  • impact de la perte de la région cte sur les activités transcriptionnelles du récepteur

  • androgènes q640x

  • hypersensibilité de la voie du récepteur des androgènes

  • expression génique

  • région carboxy-terminale


Publié le : dimanche 1 avril 2007
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’université Louis Pasteur
Strasbourg I


Discipline : Sciences du vivant
Par Gaëlle LAPOUGE



MECANISMES D’ACTION D’UNE
NOUVELLE CLASSE DE MUTATIONS
DU RECEPTEUR DES ANDROGENES
DANS LES CANCERS DE LA
PROSTATE


Soutenue publiquement le 12 avril 2007



Membres du jury

Directeur de thèse : M. Jocelyn CERALINE, MCU-PH/HDR, EA 3430-ULP

Rapporteur Interne : M Bruno CHATTON, Professeur, UMR7175-ULP

Rapporteur externe : M. Gwendal LAZENNEC, HDR, INSERM U540

Rapporteur Externe : M. Stéphane OUDARD, PU-PH, Hôpital Européen Georges
Pompidou

Examinateur : M. Hervé LANG, PU-PH, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

- 1 -
TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION 1

1 Le récepteur des androgènes 1

1.1 Description du récepteur des androgènes 1
1.1.1 La région amino-terminale 3
1.1.2 centrale 5
1.1.3 La région carboxy-terminale 7

1.2 Mécanisme d’activation du RA 8
1.2.1 Activation dépendante ligand
1.2.2 indépendante du 10
1.2.2.1 Les voies de signalisation de l’EGF 10
1.2.2.2 La voie du TGFβ 11
1.2.2.3 La voie de l’IGF-I 12
1.2.2.4 l’interleukine 6 13
1.2.2.5 La voie de 4 15

1.3 Mécanismes d’action du RA 16
1.3.1 Interactions avec les cofacteurs 16
1.3.1.1 Les coactivateurs 17
1.3.1.1.1 CBP et p300 : coactivateurs de classe I 17
1.3.1.1.2 La famille SRC : coactivateurs de classe II 19
1.3.1.1.3 La famille des PIAS 20
1.3.1.1.4 Coactivateurs influençant la liaison du ligand et la stabilité du RA 20
1.3.1.1.5 teurs influençant le trafic nucléo-cytoplasmique du RA 22
1.3.1.2 Les corépresseurs 22
1.3.2 Interaction avec l’appareil général de transcription 24

1.4 Activités transcriptionnelles du RA dans la prostate 26
1.4.1 Actions génotropiques 26
1.4.2 non 30

- 2 -
1.4.2.1 La voie de transduction du signal Akt 30
1.4.2.2 La voie d’activation du facteur de transcription AP-1 30
1.4.2.3 La voie de signalisation NF-κB 32

2 Le cancer de la prostate 33

2.1 La prostate 33

2.2 Le Cancer de la prostate 37
2.2.1 Le dépistage du cancer de la prostate 37
2.2.2 Les différents stades évolutifs du cancer de la prostate 38
2.2.2.1 Le stade T1 39
2.2.2.2 Le stade T2 9
2.2.2.3 Le stade T3-4 9
2.2.2.4 Le stade T4 9
2.2.2.5 Le stade N 9
2.2.2.6 Le stade M 39
2.2.3 Les métastases osseuses. 40
2.2.3.1 Le développement des métastases osseuses 40
2.2.3.2 Voie de signalisation de l’ostéoclastogenèse 42
2.2.3.2.1 TRAF6 43
2.2.3.2.2 Le complexe protéique NF-κB 44
2.2.3.2.3 Le complexe protéique AP-1 45
2.2.3.2.4 La famille protéique NFAT 46
2.2.3.3 Voies de signalisation de l’ostéogenèse 47
2.2.4 Les différents traitements 48
2.2.4.1 La prostatectomie
2.2.4.2 radiothérapie
2.2.4.3 La chimiothérapie 49
2.2.4.4 L’hormonothérapie
2.2.5 Les mécanismes de l’échappement hormonal 53
2.2.5.1 L’hypersensibilité de la voie du récepteur des androgènes 53
2.2.5.2 Voies alternatives d’activation du RA 54
2.2.5.3 Activation des gènes de survie cellulaire 54

- 3 -
2.2.6 Mutations du RA 55
2.2.6.1 Mutations affectant la liaison à l’ADN 56
2.2.6.2 fectant la liaison du ligand 57

3 Mise en évidence des mutations du récepteur des androgènes dans les cancers de la
prostate 58



MATERIEL ET METHODE 64

Constructions plasmidiques

Culture cellulaire 66

Le retardement sur gel (gel shift) 67

L’immunoprécipitation de la chromatine (ChiP) 68

Activités transcriptionnelles par gène rapporteur (tests luciférases) 71

Cytométrie en flux 72

Dosage du PSA 72

Co-cultures et cultures en milieu conditionné (MC) 73

Principe de la microscopie confocale à balayage laser 74

Immunofluorescence par microscopie confocale à balayage laser 76

Dosage de l’Interleukine 6 77

Western blot 77

Etude de l’ostéoclastogenèse par la mise en évidence de l’activité de la phosphatase acide
résistante à l’acide tartrique (TRAP) 78

RT-PCR 9


RESULTATS ET DISCUSSION 81

1. Impact de la perte de la région CTE sur les activités transcriptionnelles du récepteur des
androgènes 81

- 4 -
1.1. Activités transcriptionnelles du RA Q640X sur des promoteurs
androgènodépendants artificiels
81
1.2. Activités transcriptionnelles du RA Q640X sur des promoteurs entiers
androgènodépendants 85
1.3. Conceptualisation des activités transcriptionnelles du RA Q640X 89

2. Formation d’un complexe d’activation transcriptionnelle spécifique en présence du RA
Q640X 90
2.1. Distribution intranucléaire spécifique 91
2.2. Recrutement des cofacteurs 93
2.3. L’appareil général de transcription et le RA Q640X 96
2.4. Conclusion 98

3. Expression génique différentielle en présence du RA Q640X 100

4. Interconnexions du RA Q640X avec des facteurs de transcription impliqués dans la
prolifération et la survie cellulaire. 103
4.1. Impact du RA Q640X sur les activités transcriptionnelles du facteur de transcription
AP-1 104
4.2. Im
NFAT 106
4.3. Impact du RA Q640X sur les activités transcriptionnelles du facteur de transcription
NF-κB 107
4.4. Conclusion 110

5. Modèle d’action du récepteur des androgènes Q640X 112

6. Actions paracrines des cellules LNCaP exprimant le récepteur des
androgènes Q640X 114
6.1. Impact du RA Q640X sur l’expression du PSA dans les cellules LNCaP 114
6.2. Impact du RA Q640X sur l’expression du RA endogène dans les
cellules LNCaP 117
6.3. Impact du RA Q640X sur l’activation du RA endogène dans les

- 5 -
cellules LNCaP 120

7. Voies de communication conduisant à l’activation à distance du
récepteur des androgènes 124
7.1. Les voies de signalisation de l’IL-6 et de l’IL-4 124
7.2. Les voies de signalisation de l’IGF (Insulin-like Growth Factor) 126
7.3. Les voies de signalisation d’Akt 129

8. Récepteur des androgènes Q640X et ostéoclastogenèse 131

9. Intégration des activités paracrines des cellules LNCaP exprimant le RA Q640X 134


CONCLUSION 135

PERSPECTIVES 140

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 144

PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS PERSONNELLES 156

ANNEXES 158

- 6 -
INTRODUCTION

4 Le récepteur des androgènes

4.1 Description du récepteur des androgènes

Les molécules lipophiles telles que les hormones stéroïdes, les hormones
thyroïdiennes, les acides rétinoïques (vitamine A) et la vitamine D jouent un rôle
central dans le maintien de l’homéostasie et sont impliquées dans le développement de
nombreuses pathologies humaines. Les récepteurs de ces hormones forment la
superfamille des récepteurs nucléaires (RNs). Il s’agit de facteurs de transcription
intervenant dans le contrôle de l’expression de gènes impliqués dans la prolifération et
la différenciation cellulaire. Les séquences codantes de ces récepteurs sont retrouvées
dans le génome de nombreuses espèces de C.elegans à l’homme. Reflet d’une
évolution à partir d’un ancêtre commun, les RNs partagent les mêmes caractéristiques
fonctionnelles et structurales, et sont divisés en sept classes (Tableau 1) (Aranda et
Pascual, 2001).

Le récepteur des androgènes (RA) appartient à la classe III des RNs, la classe
des récepteurs des hormones stéroïdes, comprenant les récepteurs α et β des
oestrogènes, des glucocorticoïdes, des minéralocorticoïdes et de la progestérone. Le
gène du RA, situé en position Xq11-12, s’étend sur environ 80 kilobases et comprend
huit exons. Ces exons représentent une phase ouverte de lecture de 2757 paires de
bases, codant pour une phosphoprotéine de 919 acides aminés, d’un poids moléculaire
de 110 kDa.







- 7 -
Récepteur Sous-type Nom Ligand
Récepteur des hormones Thyroïdes Classe I TR α, β Thyroïdes
RAR Récepteur de l’acide rétinoïque Acide tout trans-α, β, γ
rétinoïque

VDR Récepteur à la vitamine D 1-21(OH) 2
vitamine D 3

PPAR Récepteur des péroxysomes Prostaglandine α, β, γ
proliférateurs activés
Classe II RXR Récepteur rétinoïde X Acide 9-Cis-α, β, γ
retinoïque
TR2 Récepteur des testicules Inconnu α, β
RG Récepteur des glucocorticoïdes Glucocorticoïdes Classe III
RA s androgènes Androgènes
RP Récepteur de la progestérone progestérone
RE α, β Récepteur des oestrogènes Oestrogènes
Classe IV NGFI-B Clone B induit par le NGF Inconnu α, β, γ
Classe V SF-1/FTZ-F1 Facteur I stéroïdogénique Oxystérols α, β
Classe VI GCNF Facteur nucléaire des cellules Inconnu
germinales
Classe O SHP Petit partenaire hétérodimérique Inconnu
DAX-1 Dosage-sensitive sex reversal Inconnu
Tableau 1 : Classification de la superfamille des récepteurs nucléaires.
Présentation non exhaustive des membres de la famille des récepteurs nucléaires mais qui
répertorie les membres les plus importants (inspiré de Aranda et Pascual, 2001).


H N A/B C D E/F COOH2
1 538 618 662 919
H N AF-1 DBD HR LBD/AF-2 COOH2
Exon 1 2 3 4 5 6 7 8
Figure 1 : Structure du récepteur des androgènes. Le domaine d’activation AF-1
ou le domaine A/B représente la région amino-terminale, le domaine de liaison à l’ADN
(DBD) et la région charnière (HR) ou domaines C et D représentent la région centrale. La
région carboxy-terminale est représentée par le domaine E/F qui contient le domaine de
liaison du ligand (LBD) et AF-2.

Le RA possède de nombreux sites de modifications post-traductionnelles qui
comme nous verrons plus loin sont déterminantes pour moduler les activités

- 8 -
transcriptionnelles du RA. Ainsi, le RA peut être phosphorylé, et les résidus cibles de
cette phosphorylation sont principalement les résidus sérines en position 16, 81, 94,
213, 256, 308, 424, 515, 650 et 791 (Gioeli et al., 2005 ; Taneja et al., 2005). La
phosphorylation du RA est induite soit par la liaison de l’hormone, soit par l’activation
de voies de signalisation intracellulaires, sauf la sérine en position 94 qui est
constitutivement phosphorylée.
Des sites de sumoylation représentés par les lysines K386 et K520, sont aussi
retrouvés au niveau du RA. Les ligases Ubc9 et E3 sont responsables de la
sumoylation du RA suite à une stimulation hormonale. Les effets de la sumoylation
sont essentiellement répressifs, conduisant à une diminution des activités
transcriptionnelles du RA à partir de certains promoteurs non spécifiques du RA. Il
existe aussi trois sites potentiels d’acétylation. Il s’agit des résidus K630, K632 et
K633. Le RA est acétylé en réponse à une stimulation hormonale, et cette modification
augmente les activités transcriptionnelles du RA sur plusieurs promoteurs (Fu et al.,
2004).
Comme les autres membres de la famille des RNs, le RA est constitué de trois
régions majeures qui déterminent le mode d’action du RA, c'est-à-dire la région
amino-terminale, la région centrale et la région carboxy-terminale (Shen et Coetzee,
2005 ; Robyr et al., 2000).

4.1.1 La région amino-terminale

La région amino-terminale (NTD, Amino-terminal Domain), appelée aussi
région A/B, est le domaine le plus variable à la fois par la taille et par la séquence dans
la famille des RNs. D’ailleurs, le RA est le seul à posséder une région NTD
représentant plus de la moitié de sa protéine (Figure 2). Les autres RNs ont des
domaines NTD plus petits. Le NTD du RA se compose des 538 premiers acides
aminés et est codé entièrement par l’exon 1. Il comprend deux domaines d’activation,
la fonction d’activation TAU-1 (acides aminés 142 à 485), qui est responsable de la
transactivation, et la fonction d’activation TAU-5 (acides aminés 351 à 528). Ces deux
fonctions d’activation sont généralement regroupées sous le terme d’AF-1. Bien qu’il

- 9 -
existe peu d’homologie entre les différents domaines AF-1 des RNs, 14 acides aminés
de ce domaine sont hautement conservés au niveau des récepteurs des hormones
stéroïdes. Cette séquence signature appelée ANTS pour « AR NTD signature
sequence », joue un important rôle dans la transactivation et notamment assure la
liaison aux protéines de choc thermique (Heat Shock protein, HSP) quand le RA est
inactif (Shen et Coetzee, 2005).

H N A/B C D E/F COOH RA2
HHHH NNNN A/A/A/A/BBBB CCCC DDDD E/E/E/E/FFFF CCCCOOHOOHOOHOOH RGRGRG2222
HHHH NNNN A/BA/BA/BA/B CCCC DDDD E/E/E/E/FFFF CCCCOOHOOHOOHOOH RERERE2222
H N A/B C D E/F COOH TR2
2
H N A/B C D E/F COOH VDR
2
H N A/B C D E/F COOH RXRα
2

Figure 2 : Schéma de plusieurs membres de la famille des récepteurs nucléaires.
Le récepteur des androgènes (RA), le récepteur des glucocorticoïdes (RG) et le récepteur des
oestrogènes (RE) représentent les récepteurs nucléaires de classe III. La région NTD est plus
grande pour le RA que pour les autres membres de la classe III, mais aussi par rapport aux
RNs des autres classes, comme comme le récepteur à la vitamine D (VDR) pour la classe I et
le Récepteur rétinoïde X (RXRα) et le récepteur des testicules (TR2) pour la classe II.
Schéma inspiré de Kishomoto et al., 2006.

D’autres séquences d’acides aminés présentes dans cette région sont
importantes pour la régulation des activités transcriptionnelles du RA, comme les
nombreux sites de phosphorylation, les sites de sumoylation et les motifs « WHTLF »
et « FQNLF » importants pour les interactions protéine – protéine (Figure 3).

23 27 233 246 434 438FQNLF ANTES SUMO-3 WHTLF SUMO-3
********** ** ** **
1 538
58 78 449 472polyQ polyG
351 528TAU-5
141422 484855TAUTAU--11
Figure 3 : Structure de la région amino-terminale (NTD). Les principaux sites de
régulation des activités du NTD sont représentés. Les sites d’interaction protéine – protéine
sont représentés en rose, les séquences poly-glutamine (poly-Q) et poly-glycine (poly-G) en
bleu et la séquence signal ANTES en vert. Les sites de phosphorylation sont signalés par des
astérisques et ceux de sumoylation en violet. Les fonctions activatrices TAU-1 et TAU-5 sont
aussi indiquées.

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