Thèse présentée pour obtenir le grade de

De
Publié par

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : physique Etalement de vésicules bioadhésives sur des tapis d'ADN Présentée par Marie-Laure Hisette-Jourdainne Soutenue publiquement le 21 septembre 2007 Membres du jury : Président du jury : M. Stefan Haacke Professeur ULP, IPCMS, Strasbourg Directeur de thèse : M. Carlos Marques Directeur de recherches, ICS, Strasbourg Rapporteur externe : M. Pierre Nassoy Chargé de recherches, HDR, Institut Curie, Paris Rapporteur externe : M. Thomas Duke Professeur, Cavendish Laboratory, Cambridge Examinateur : Mme Rumiana Dimova Directrice de recherches, MPI, Gölm-Potsdam Membre-invité : M. André Schröder Chargé de recherches, ICS, Strasbourg

  • savoir-faire concernant la manipulation des molécules d'adn

  • molécule d'adn

  • méthodes de fabrication de vésicules

  • tapis d'adn présentée

  • membrane

  • vésicules adhésives


Publié le : samedi 1 septembre 2007
Lecture(s) : 92
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 136
Voir plus Voir moins
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : physique
Etalement de vésicules
bioadhésives sur des tapis d'ADN
Présentée par Marie-Laure Hisette-Jourdainne
Soutenue publiquement le 21 septembre 2007
Membres du jury : Président du jury:
Directeur de thèse:
Rapporteur externe:
Rapporteur externe: Examinateur : Membre-invité :
M. Stefan HaackeProfesseur ULP, IPCMS, StrasbourgM. Carlos MarquesDirecteur de recherches, ICS, Strasbourg M. Pierre Nassoy
Chargé de recherches, HDR, Institut Curie, Paris
M. Thomas Duke
Professeur, Cavendish Laboratory, Cambridge Mme Rumiana Dimova Directrice de recherches, MPI, Gölm-Potsdam M. André SchröderChargé de recherches, ICS, Strasbourg
Remerciements
Mes remerciements les plus chaleureux vont tout d'abord à mes directeurs de thèse, Carlos Marques et André Schröder. Tout au long du stage de DEA, puis de la thèse, ils ont été disponibles, prêts à répondre à mes nombreuses sollicitations. Ils ont cherché à m'apporter la formation la plus complète possible. Travailler sous leur direction fut un grand plaisir. Je tiens à remercier Stefan Haacke, Pierre Nassoy et Thomas Duke d'avoir accepté d'assumer le rôle de rapporteurs. Merci également à Rumiana Dimova d'avoir accepté de faire partie du jury. Ce travail a pu être mené à bien grâce à la collaboration avec l'Université de Constance dans le cadre du collège doctoral européen "Soft Condensed Matter". Je remercie Georg Maret, qui dirige le groupe avec lequel nous collaborons. Mes remerciements les plus sincères vont à Thomas Gisler, pour toutes les discussions fructueuses que nous avons eues. Enfin, ce travail n'aurait jamais vu le jour sans leur aide concernant la fonctionnalisation de surfaces avec des molécules d'ADN : un grand merci à Juha Koota et Ina Seuffert. J'en profite pour remercier Paula Haddad, qui avait initié ce travail en apprenant le savoir-faire concernant la manipulation des molécules d'ADN à Constance avant de repartir pour le Brésil. Je remercie tous les membres de l'équipe "Membranes", présents et passés, pour l'aide qu'ils m'ont apportée dans mon travail, ou tout simplement pour leur soutien, et en particulier : Marc Basler, pour son aide technique, notamment sur le nouveau montage sur le Leica, Fabrice Thalmann, pour son travail théorique sur les bulles, et Armelle Zinck, pour son aide en matière d'expériences. Un grand merci également à tout le laboratoire. Je remercie le directeur, Jean-François Legrand, de m'y avoir accueillie. Mes remerciements vont ensuite au personnel administratif et technique. Merci également à toutes les personnes avec qui j'ai pu discuter, pour leur aide, ou tout simplement pour leur gentillesse. Je remercie aussi mes collègues de bureau, et en particulier Philippe et plus récemment Manuel, pour nos nombreuses conversations et pour leur amitié. Merci enfin à tous les autres thésards. Mes remerciements vont aussi à Joyce Wong et à son équipe pour m'avoir accueillie quelques temps dans son laboratoire à Boston. Ce séjour fut riche d'enseignements, et l'accueil formidable. Enfin, je remercie mon mari, mes parents et ma belle-famille pour leur soutien sans faille.
- 3 -
- 4 -
Sommaire
AVANT-PROPOS.....................................................................................................................9
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION ...........................................................................................11
1MEMBRANES CELLULAIRES ET MEMBRANES MODELES.......................................................131.1 Composition des membranes cellulaires........................................................................... 131.2 Les membranes modèles .................................................................................................. 161.3 Méthodes de fabrication de vésicules ............................................................................... 181.4 Domaines d'application industrielle ................................................................................... 191.4.1 Applications cosmétiques.................................................................................................... 191.4.2 Applications pharmaceutiques ............................................................................................ 191.5 Propriétés mécaniques des membranes ........................................................................... 201.6 Adhésion de membranes................................................................................................... 251.6.1 Les mécanismes de l'adhésion cellulaire ............................................................................ 251.6.2 Adhésion de vésicules ........................................................................................................ 30
2L'ADN,UN POLYMERE MODELE POUR LES PHYSICIENS.......................................................362.1 Structure de la molécule d'ADN......................................................................................... 362.2 Greffage d'un polymère sur une surface ........................................................................... 382.3 Confinement d'un polymère entre deux surfaces .............................................................. 402.4 Techniques d'étirement de molécules d'ADN.................................................................... 412.4.1 Peignage moléculaire, étirement par rotation et soufflage d'air........................................... 422.4.2 Molécules d'ADN dans des écoulements ............................................................................ 42
3INTERACTION POLYMERE-MEMBRANE:DEFORMATION D'UNE MEMBRANE PAR UN POLYMERE GREFFE SUR UNE PAROI.......................................................................................................483.1 Description du système ..................................................................................................... 493.2 Les différents régimes de confinement pour le polymère ................................................. 50
CHAPITRE 2 : MATERIEL ET TECHNIQUES EXPERIMENTALES ....................................53
1LES MATERIAUX UTILISES..................................................................................................551.1 La colle moléculaire ........................................................................................................... 551.2 Les molécules d'ADN "collantes"....................................................................................... 561.3 Les vésicules adhésives .................................................................................................... 57
- 5 -
2PROTOCOLES EXPERIMENTAUX.........................................................................................592.1 Préparation des vésicules par électroformation ................................................................ 592.1.1 Sensibilité des vésicules à la pression osmotique .............................................................. 592.1.2 Méthode de fabrication........................................................................................................ 602.2 Fonctionnalisation de surfaces de verre avec de la streptavidine..................................... 612.2.1 Solutions tampon ................................................................................................................ 612.2.2 Préparation de surfaces silanisées ..................................................................................... 612.2.3 Fonctionnalisation avec la streptavidine.............................................................................. 622.3 Préparation et greffage de molécules d'ADN .................................................................... 622.3.1 Préparation de l’ADN .......................................................................................................... 632.3.2 Purification de l’ADN ........................................................................................................... 632.3.3 Greffage d’ADN sur une surface streptavidinée .................................................................. 65
3TECHNIQUES D'OBSERVATION............................................................................................653.1 RICM.................................................................................................................................. 653.1.1 Principe de fonctionnement................................................................................................. 653.1.2 Méthodes d'analyses de données ....................................................................................... 693.2 Microscopie de fluorescence ............................................................................................. 723.2.1 La fluorescence................................................................................................................... 723.2.2 Principe de fonctionnement................................................................................................. 733.2.3 Méthode d'analyse des données......................................................................................... 753.3 Système RICM-fluorescence simultanés .......................................................................... 77
CHAPITRE 3 : ÉTIREMENT DE MOLECULES D’ADN INDUIT PAR L’ETALEMENT DE VESICULES ...........................................................................................................................81
1CONFIGURATION APRES ETALEMENT..................................................................................841.1 Distribution spatiale et orientation des molécules d'ADN .................................................. 871.2 Degré de repliement .......................................................................................................... 91
2DYNAMIQUE D'ETALEMENT ET D'ETIREMENT.......................................................................94
3CONCLUSION..................................................................................................................101
ANNEXE AU CHAPITRE3 .....................................................................................................102L'écoulement de Poiseuille à une dimension ........................................................................ 102Ecoulement entre deux surfaces planes : le marteau de Poiseuille...................................... 103Sphère approchant d'une surface plane................................................................................ 104
- 6 -
CHAPITRE 4 : DEFORMATION D’UNE BICOUCHE PAR UNE MOLECULE D’ADN UNIQUE ...............................................................................................................................107
1DESCRIPTION DU SYSTEME..............................................................................................1101.1 Rappel de la configuration expérimentale ....................................................................... 1101.2 Techniques et méthodes utilisées ................................................................................... 110
2RESULTATS EXPERIMENTAUX..........................................................................................1112.1 Déformation de la paroi de vésicules géantes par des molécules d'ADN....................... 1112.2 Analyse des bulles........................................................................................................... 1142.3 Les fluctuations des molécules d'ADN ............................................................................ 119
3CONCLUSION..................................................................................................................120
ANNEXE AU CHAPITRE4 .....................................................................................................121Détermination auto-consistante du profil d'une bulle de faible hauteur................................. 121Détermination de la fonction de Green.................................................................................. 122
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.......................................................................................125
BIBLIOGRAPHIE..................................................................................................................129
- 7 -
- 8 -
Avant-propos
L’auto-assemblage de phospholipides en solution conduit à de nombreuses structures : lamellaires, cylindriques, sphériques ... Parmi les assemblages planaires, les vésicules présentent un intérêt particulier. En effet, ces capsules constituent non seulement des systèmes modèle simples des parois cellulaires, mais elles possèdent aussi de nombreux domaines d’applications en pharmacologie, en cosmétique ou encore dans l’industrie alimentaire. Pour le physicien ou le physico chimiste travaillant sur des systèmes mous d’intérêt biologique, les vésicules de phospholipides s’imposent comme le système de choix lorsqu’il s’agit de comprendre certains mécanismes cellulaires comme l'adhésion. L'adhésion cellulaire est un phénomène complexe, d’une importance majeure pour la cellule, quelle que soit sa nature. Elle est en effet impliquée dans la plupart de ses activités : prolifération, migration, différenciation, … Par ailleurs, l’optimisation des cultures cellulaires ou le contrôle des interactions entre implants et tissus requiert la maîtrise de l'étalement de cellules sur des matériaux biocompatibles. Les mécanismes physiques mis en jeu au cours de l’adhésion d’une paroi cellulaire sur un substrat bio-fonctionnalisé ont fait l’objet d’études récentes, mais ne sont pas encore bien compris. En particulier, les surfaces de nature biologique possèdent souvent de nombreuses espèces macromoléculaires qui peuvent jouer un rôle promoteur ou au contraire de prévention de l’adhésion. Nous avons étudié plus particulièrement l'adhésion de vésicules géantes de phospholipides sur des surfaces fonctionnalisées, comportant une faible densité de molécules d'ADN greffées. La taille importante des vésicules géantes, jusqu`à 100μm, permet le suivi direct des événements adhésifs par les différentes techniques de microscopie optique. L’intercalation de molécules fluorescentes dans le double brin de l’ADN permet de les visualiser également sous microscope. Nous observons et quantifions les déformations des membranes et des molécules d’ADN lors de leurs interactions pendant l’adhésion.
Notre étude présente à la fois un intérêt fondamental et pratique. En effet, les déformations induites par un polymère sur une membrane autoassemblée n’ont jamais été expérimentalement mises en évidence, malgré les très nombreux travaux théoriques consacrés au sujet. Par ailleurs la compréhension des mécanismes de contact intime entre l’ADN et les membranes de phospholipides présente un intérêt certain pour la transfection. Le premier chapitre de ce manuscrit fait le point sur l’état de l’art dans le domaine. Nous y présentons les différents systèmes d’intérêt pour notre travail : les membranes et leurs mécanismes d'adhésion, les molécules d'ADN greffées, leur comportement en situation
- 9 -
de confinement ou sous écoulement. Enfin, nous rappelons quelques éléments théoriques de l'interaction entre un polymère et une membrane. Après cette introduction, nous décrivons dans un second chapitre les techniques de microscopie par contraste interférentiel en réflexion et de microscopie de fluorescence. Nous décrivons également un nouveau montage expérimental, jusqu'à présent unique, que nous avons mis en place et qui combine ces deux techniques. Nous expliquons ensuite les différentes méthodes utilisées pour l'analyse des données. Le troisième chapitre est consacré à l'étude du comportement de molécules d'ADN au voisinage d'une membrane en adhésion. Nous montrons que l'étalement de la membrane, ainsi que l'écoulement d'eau qu'elle induit, sont à l'origine d'un étirement radial des molécules d'ADN greffées sous la zone d'adhésion de la vésicule. Nous nous attachons à comprendre l'origine physique précise de cet étirement. Le chapitre quatre traite de la déformation de la membrane induite par la pression exercée par une molécule d’ADN confinée dans la région d’adhésion. Cette pression est suffisante pour induire des déformations mesurables par interférométrie optique. Nous comparons ces observations expérimentales aux modèles théoriques. Finalement, dans la conclusion, nous résumons les résultats les plus marquants de
notre travail et discutons les nouvelles perspectives qu’il ouvre.
- 10 -
Introduction
- 11 -
Chapitre 1
Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.