Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant par Audrey MONGE CONSEQUENCES FONCTIONNELLES ET STRUCTURALES DE L'ASSOCIATION DE DEUX MUTATIONS DU RECEPTEUR DES ANDROGENES DANS LE CANCER DE LA PROSTATE Soutenue publiquement le 24 septembre 2008 Membres du jury Directeur de thèse : Dr. Jocelyn CERALINE, ULP/EA3430, Strasbourg Rapporteur Interne : Dr. Daniel METZGER, IGBMC, Illkirch Rapporteur Externe : Pr. Bernard MALAVAUD, CHU de Rangueil, Toulouse Rapporteur Externe : Dr. Mohamed BENAHMED, INSERM U895, Nice Examinateur : Pr. Bruno KIEFFER, ESBS, Illkirch

  • terminale ?

  • protein

  • programme hospitalier de recherche clinique ?

  • estrogen responsive

  • e26 transformation-specific

  • hormone responsive

  • ton soutien…

  • cancer de la prostate ?

  • prostate-specific antigen


Publié le : lundi 1 septembre 2008
Lecture(s) : 292
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 206
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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant par Audrey MONGE CONSEQUENCES FONCTIONNELLES ET STRUCTURALES DE L’ASSOCIATION DE DEUX MUTATIONS DU RECEPTEUR DES ANDROGENES DANS LE CANCER DE LA PROSTATE Soutenue publiquement le 24 septembre 2008 Membres du jury Directeur de thèse : Dr. Jocelyn CERALINE, ULP/EA3430, Strasbourg Rapporteur Interne : Dr. Daniel METZGER, IGBMC, Illkirch Rapporteur Externe :Bernard MALAVAUD, CHU de Rangueil, Toulouse Pr. Rapporteur Externe :Dr. Mohamed BENAHMED, INSERM U895, Nice Examinateur : Pr. Bruno KIEFFER, ESBS, Illkirch
R e m e r c i e m e n t s Tout d’abord, je tien s à rem ercier les m em bres du jury qui on t accepté de juger m on travail de th èse. Soyez assurés de m a recon n aissan ce. J e rem ercie vivem en t Mon sieur le Professeur J ean -Pierre Bergerat de m ’avoir perm is de rejoin dre cette équipe pour réaliser m on DEA puis m a th èse. J e rem ercie particulièrem en t m on directeur de thèse le Docteur J ocelyn Céralin e pour son en th ousiasm e, son aide et son soutien duran t ces an n ées. J e tien s à rem ercier les deux organ ism es qui m ’on t perm is d’en arriver là. Merci à l’Alsace Th érapie Gén ique et Can cer (ATGC) et m erci à l’Association pour la Rech erch e sur les Tum eurs de la Prostate (ARTP) pour leur soutien fin an cier. J e rem ercie beaucoup toute l’équipe de réson an ce m agn étique n ucléaire pour leur aide précieuse sur ce projet. Merci à Eva Erdm an n pour ton aide et ta gen tillesse duran t toutes ces an n ées passées au laboratoire. Merci à Ch ristelle Siebert pour ton am itié ô com bien précieuse, surtout dan s les m om en ts difficiles. Merci égalem en t aux autres m em bres de l’équipe. Un gran d m erci à m es paren ts san s qui je n ’en serai pas là, m er ci pour votre présen ce, pour votre aide, pour votre am our. J e n e trouverai jam ais les m ots pour vous exprim er m a recon n aissan ce et m on am our. Merci pour tout. Merci à m a sœ ur pour tous les m om en ts de joie passés, et pour ceux à ven ir. Et en fin , en dern ier m ais pas le m oin dre, un én orm e m erci à Fred pour ton soutien pen dan t toutes ces an n ées. Il n ’existe pas de m ots pour t’exprim er m es sen tim en ts, alors tout sim plem en t m erci pour ta présen ce, tes con seils et ton soutien ….
ABREVIATIONS ___________________________________________________________________________
ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ
ADN : ADNc : AF-1 : AF-2 : AJCC : Akt : ARE : ARN : AP-1 : β-Gal : BAC : BET : BSA : C(3)1 : CaP : ChIP : CRE : CTE : DBD : DHT: DMEM : DR : DTT : ECACC : EDTA : EGFP : ELISA :
A B R EV IA TIO N S
Acide désoxyribonucléique Acide désoxyribonucléique complémentaire Activation Fonction 1 ; Fonction d’activation 1 Activation Fonction 2 ; Fonction d’activation 2 American Joint Committee on Cancer Oncogène du rétrovirus AKT (Acutely transforming retrovirus)
Androgen Responsive Elements ; Elément de réponse aux
androgènes
Acide ribonucléique
Activating protein 1
β-galactosidase
Blocage Androgénique Complet
Bromure d’éthidium
Bovine Serum Albumine Component Cancer de la prostate
Immunoprécipitation de la chromatine
cAMP Responsive Element
C-terminal extension ; Extension C-terminale
DNA Binding Domain ; Domaine de liaison à l’ADN
Dihydrotestostérone Dulbecco’s Modified Eagle Medium Direct Repeat ; Répétition Directe Dithiothréitol European Collection of Cell Cultures
Ethylène Diamine Tetra-Acetate de sodium
Enhanced Green Fluorescent Protein
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ABREVIATIONS ___________________________________________________________________________
ƒEMSA : ƒERE : ƒERG : ƒETS : ƒETV : ƒFDA : ƒFGC : ƒFITC : ƒFSH : ƒGnRH : ƒGPD : ƒGST : ƒGTA : ƒGRE : ƒHAT : ƒHBP : ƒHDAC : ƒHMG1 : ƒHMG2 : ƒHRE :
ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ
HSP : HSQC : IκK : IL-6: IPTG : IR : kb : LB : LBD : LH :
Electrophoretic Mobility Shift Assay Estrogen Responsive Elements ; Elément de réponse aux Estrogènes
V-ETS Avian Erythroblasosis Virus E26 Oncogen Related E26 Transformation-specific oncogen E26 Transformation-specific oncogen (ETS) variant gene
Food and Drug Administration
Fast Growth Cells
Fluorescein IsoThioCyanate
Follicle-Stimulating Hormone ; Hormone Folliculo-Stimulante
Gonadotropin-Releasing Hormone Glycéraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Glutathione-S-Transferase
General Transcription Apparatus
Glucocorticoïde Responsive Elements ; Elément de réponse aux
glucocorticoïdes
Histone Acétyl-transférase
Hyperplasie bénigne de la prostate Histone DéACétylase High Mobility Group protein 1
High Mobility Group protein 2 Hormone Responsive Elements ; Eléments de réponse aux hormones
Heat Shock Protein ; Protéine de choc thermique
Heteronuclear Single Quantum Coherence IκB Kinase Interleukine-6
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
Inverted Repeat ; Répétition Inversée Kilobase Luria-Bertani
Ligand Binding Domain
Luteinizing Hormone ; Hormone Lutéinisante
ABREVIATIONS ___________________________________________________________________________
ƒƒƒƒƒ
ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ
LH-RH : LNCaP : LTR : MAPK : MMTV : MSS : MST : NCoR : NES : NF-κB : NGF1-B :NL-1 : NL-2 : NLS : NTD : ONPG : PAP : pb : pb : PBS : p/CAF : PDB : PES : PEI : PHRC :
ƒPI3K : ƒPIAS1 : ƒPIN : ƒPKB : ƒPSA : ƒRA :
Luteinising Hormone Releasing Hormone Lymph Node Cancer Prostate
Long Terminal Repeat ; Longue repetition terminale
Mitogen-Activated Protein Kinase
Mouse Mammary Tumor Virus ; Virus de la tumeur mammaire
de la souris
Milieu sans sérum
Milieu sérum traité
Nuclear receptor CoRepressor
Nuclear Export Signal ; Signal d’export nucléaire
Nuclear FactorκB
Nerve Growth Factor 1 Nuclear Localisation 1 Nuclear Localisation 2
Nuclear Localisation Signal ; Signal de localisation nucléaire
N-Terminal Domain ; Domaine N-Terminal Ortho Nitro Phényl Galactopyranoside Prostatic Acid Phosphatase ; Phosphatase acide prostatique Probasine Paire de bases
Phosphate Buffered Saline p300/CBP-Associated Factor Protein Data Bank
Polyethersulfone
Polyéthylènimine
Programme Hospitalier de Recherche Clinique
Phosphoinositol-3-kinase Protein Inhibitor of Activated STAT1 ; Protéine inhibitrice de STAT-1 activé
Néoplasie intra-épithéliale prostatique
Protein Kinase B Prostate-Specific Antigen ; Antigène Spécifique de la Prostate Récepteur des Androgènes
ABREVIATIONS ___________________________________________________________________________
ƒRAC3 : ƒRARE : ƒRE : ƒRG : ƒRM : ƒRMN : ƒRP : ƒrpm : ƒRT-PCR : ƒsc : ƒSer : ƒSHBG : ƒSIA : ƒslp : ƒSMRT :
Receptor Associated Coactivator 3 Retinoic Acid Response Element ; Elément de réponse à l’acide Rétinoique Récepteur des œstrogènes Récepteur des Glucocorticoïdes Récepteur des Minéralocorticoïdes Résonance Magnétique Nucléaire Récepteur à la Progestérone Rotation Par Minute Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction Secretory Component Sérine Sex Hormone Binding Globulin ; Protéine de transport des stéroïdes sexuels Syndrome d’insensibilité aux androgènes Sex Limited Protein Silencing Mediator for Retinoid and Tyroid Hormone Receptors ƒSRC-2 / SRC-3 : Steroid Receptor Coactivator 2 / Steroid Receptor Coactivator 3 Molécules modulatrices spécifiques des récepteurs nucléaires Steroïdogenesis activator protein ; Protéine activatrice de la stéroïdogénèse Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Sérum de veau foetal Switching / sucrose nonfermenting TATA-Binding Protein ; Protéine de liaison à la boite TATA Transcriptional Intermediary Factor 2 TransMembrane Proteases Serine2 Tumeur Ganglion Métastase Thyroïd Hormone Response Element ; Element de réponse pour l’hormone thyroïde Tryptophane Unités Arbitraires Untranslated Terminal Region 3’ ; Région 3’ non traduite
ƒSRM : ƒStAR : ƒSTAT 3: ƒSVF : ƒSWI / SNF : ƒTBP : ƒTIF2 : ƒTMPRSS2: ƒTNM : ƒTRE : ƒTRP : ƒUA : ƒ3’UTR :
ABREVIATIONS ___________________________________________________________________________
ƒƒ
ƒ
VDR : wt :
Récepteur de la vitamine D
wild-type ; sauvage
Acides Am in és :
A :Alanine (Ala)
R: Arginine (Arg)
N: Asparagine (Asn)
D: Acide Aspartique (Asp)
C: Cystéine (Cys)
E: Acide Glutamique (Glu)
Q: Glutamine (Gln)
G: Glycine (Gly)
H: Histidine (His)
I: Isoleucine (Ile)
L: Leucine (Leu)
K: Lysine (Lys)
M: Méthionine (Met)
F: Phénylalanine (Phe)
P: Proline (Pro)
S: Sérine (Ser)
T: Thréonine (Thr)
W: Tryptophane (Trp)
Y: Tyrosine (Tyr)
V: Valine (Val)
LISTE DES FIGURES ___________________________________________________________________________
LIS TE D ES FIG U R ES
Figure 1 : Biosynthèse des hormones stéroïdes dans les gonades Figure 2 : Représentation schématique de l’axe hypathalamo-hypophysaire Figure 3 : Conversion de la testostérone en dihydrotestostérone par  l’enzyme 5α-réductase Figure 4 : Organisation génique et principaux domaines fonctionnels du  récepteur des androgènes Figure 5 : Classification de la superfamille des récepteurs nucléaires Figure 6 : Représentation schématique du récepteur des androgènes Figure 7 : Région amino-terminale des récepteurs stéroïdes Figure 8 : Représentation du domaine de liaison à l’ADN du récepteur des
Figure 9 : Figure 10 : Figure 11 : Figure 12 : Figure 13 : Figure 14 : Figure 15 :
Figure 16 : Figure 17 : Figure 18 : Figure 19 :
androgènes Structure tridimensionnelle du domaine de liaison à l’ADN Complexes formés par le récepteur des androgènes (A) et le récepteur de la vitamine D (B) avec des éléments de réponse en répétition directe Structure du domaine de liaison au ligand du récepteur des Androgènes Mode d’action des androgènes Modèle de formation du complexe de transcription du récepteur des androgènes Lieu d’interaction des cofacteurs du récepteur des androgènes Modèle de contribution des co-activateurs et co-répresseurs dans la détermination de l’activité agoniste / antagoniste des
molécules modulatrices spécifiques des récepteurs nucléaires (SRM)Liste de différents facteurs de transcription interagissant avec le récepteur des androgènes Promoteur du gène PSA Représentation schématique de la région régulatrice du gène TMPRSS2 Représentation de la prostate
3 4
5
8 10 11 11
15 16
18
20 22
24 25
27
31 34
35 38
LISTE DES FIGURES ___________________________________________________________________________
Figure 20 : Zones anatomiques de la prostate Figure 21 : Relation entre les différents types cellulaires de la prostate Figure 22 : Origine du cancer Figure 23 : Biomarqueurs candidats pour la détection de cancers de la prostate
Figure 24 :
Figure 25 :
Figure 26 :
Figure 27 :
Figure 28 :
Figure 29 :
Figure 30 :
Figure 31 : Figure 32 : Figure 33 : Figure 34 : Figure 35 : Figure 36 : Figure 37 : Figure 38 :
Représentation schématique des stades T de la classification TNM du cancer de la prostate (AJCC de 2002) Système de classement des tumeurs réalisé par D. Gleason en 1974 Caractère de différentiation des tumeurs Incidence du nombre de cancer de la prostate en fonction de l’âge des hommes Incidence standardisée pour le cancer de la prostate en fonction de l’origine ethnique Portraits de Charles B. Huggins
Traitement du cancer de la prostate par les agonistes de la LH-RH
Réponse d’un patient atteint d’un cancer de la prostate métastatique à différentes tentatives d’hormonothérapie Mutations du gène du récepteur des androgènes dans le cancer de la prostate Récapitulatif des origines de l’échappement hormonal dues au récepteur des androgènes Vecteur d’expression du récepteur des androgènes Gap Repair Principe du test fonctionnel du récepteur des androgènes chez la levure Résultats du test fonctionnel du récepteur des androgènes chez la levure Exemple de mutations détectées par le test fonctionnel chez la levure au sein du laboratoire Classification des différents éléments de réponse aux androgènes
utilisés dans cette étude, en fonction de leur affinité et de leur spécificité vis-à-vis du récepteur des androgènes Figure 39 : Conditions de transfection employées lors des tests luciférase Figure 40 : Spectre de fluorescence des fluorochromes utilisés pour les études de microscopie confocale
39 42 45 50
52 54 55
56
58 64 67
70
77
81 83
84
86
88
93 98
103
LISTE DES FIGURES ___________________________________________________________________________
Figure 41 : Figure 42 : Figure 43 : Figure 44 : Figure 45 : Figure 46 : Figure 47 : Figure 48 : Figure 49 : Figure 50 : Figure 51 : Figure 52 :
Figure 53 : Figure 54 : Figure 55 : Figure 56 : Figure 57 : Figure 58 :
Amorces utilisées pour les études du niveau d’expression des gènes PSA, RA endogène, EGFP etβ-actine Représentation des séquences des domaines de liaison à l’ADN utilisés lors des études structurales Carte de restriction du plasmide pETM30-DBD Fractions d’élution obtenues suite à la gel filtration Hormonogramme obtenu chez un patient du protocole clinique Hormonogrammes du récepteur des androgènes sauvage, T877A, T575A et T575A/T877A Le niveau d’expression des récepteurs des androgènes sauvage ou mutants chez la levure est équivalentLocalisation des récepteurs des androgènes sauvage et mutants T575A, T877A et T575A/T877A La mutation T575A dans le domaine de liaison à l’ADN du récepteur des androgènes affecte son activité transcriptionnelle La mutation T575A modifie la spécificité de reconnaissance des éléments de réponse aux hormones du récepteur des androgènes La double mutation T575A/T877A confère de nouvelles propriétés au récepteur des androgènes double mutant La mutation T575A dans le domaine de liaison à l’ADN du récepteur
des androgènes augmente son activité transcriptionnelle dans une lignée cellulaire prostatique La mutation T575A n’influence pas l’activation transcriptionnelle du récepteur des androgènes à partir de promoteurs minimum Les deux mutations T575A et T877A ne coopèrent pas dans la lignée prostatique LNCaP Le gène PSA est sur-exprimé en présence du récepteur des androgènes T575A Le niveau d’expression du gène TMPRSS2 n’est pas augmenté par la mutation T575A Etude de la co-localisation de SRC-2 par le récepteur des androgènes sauvage ou mutant T575A Etude de la co-localisation de SRC-3 par le récepteur des androgènes
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107 108 110 112
115
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LISTE DES FIGURES ___________________________________________________________________________
 sauvage ou mutant T575A Figure 59 : Etude de la co-localisation de NCoR par le récepteur des androgènes  sauvage ou mutant T575A Figure 60 : Activité transcriptionnelle des récepteurs des androgènes sauvage et mutant T575A en présence de trois cofacteurs Figure 61 : Comparaison de séquence des domaines de liaison à l’ADN de différents récepteurs nucléaires
Figure 62 : Arbre de regroupement des séquences du domaine de liaison à l’ADN de différents récepteurs nucléaires chez l’Homme Figure 63 : Modélisation du complexe RA (DBD) – ADN Figure 64 : Représentation schématique des séquences du domaine de liaison à l’ADN employés lors des études structurales
Figure 65 : Affinité des domaines de liaison à l’ADN sauvage et mutant T575A  de forme courte Figure 66 : Affinité des domaines de liaison à l’ADN sauvage et mutant T575A  de forme longue Figure 67 : Structure des domaines de liaison à l’ADN des récepteurs des androgènes sauvage et mutant T575A Figure 68 : Etat de protonation de l’histidine en position 570 du récepteur des  androgènes sauvage et mutant T575A Figure 69 : Représentation des mutations de l’histidine en position 570 du domaine de liaison à l’ADN Figure 70 : Effet de deux mutations de l’histidine en position 570 du récepteur des androgènes sauvage et mutant T575A sur leurs activités transcriptionnelles dans les cellules LNCaP Figure 71: Effet de deux mutations de l’histidine en position 570 du récepteur des androgènes sauvage et mutant T575A sur leurs activités transcriptionnelles dans les cellules CV-1 Figure 72 : Mécanisme d’activation du RA ligand-indépendant par l’intermédiaire de SRC-3
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