Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur, Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Présentée par : Daniel MULLER ANALYSE GÉNÉTIQUE ET MOLÉCULAIRE DU STRESS ARSENIC DE SOUCHES BACTÉRIENNES ISOLÉES D'ENVIRONNEMENTS CONTAMINÉS PAR L'ARSENIC Soutenue publiquement le 20 décembre 2004 Membres du jury : Directrice de thèse Mme Marie-Claire LETT Professeur à l'Université Louis Pasteur, Strasbourg I Rapporteur interne M. Yves PIÉMONT Professeur à l'Université Louis Pasteur, Strasbourg I Rapporteur externe Mme Violaine BONNEFOY Chargé de recherche CNRS, Marseille Rapporteur externe M. Max MERGEAY Directeur de Recherche, CEN/SCK, Mol, Belgique

  • arsenic de souches bactériennes

  • rapporteur externe

  • grade de docteur de l'université

  • directeur de la recherche

  • expression des génomes de micro-organimes


Publié le : mercredi 1 décembre 2004
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Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université
Louis Pasteur, Strasbourg I
Discipline : Sciences du vivant
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Daniel MULLER
ANALYSE GÉNÉTIQUE ET MOLÉCULAIRE DU STRESS
ARSENIC DE SOUCHES BACTÉRIENNES ISOLÉES
D’ENVIRONNEMENTS CONTAMINÉS PAR L’ARSENIC
Soutenue publiquement le 20 décembre 2004
Membres du jury :
Directrice de thèse Mme Marie-Claire LETT Professeur à l’Université Louis Pasteur, Strasbourg I
Rapporteur interne M. Yves PIÉMONT
Rapporteur externe Mme Violaine BONNEFOY Chargé de recherche CNRS, MarseilleM. Max MERGEAY Directeur de Recherche, CEN/SCK, Mol, BelgiqueIl entre dans toutes les actions humaines plus de hasard que de décision.
André Gide
À ma Céline
1Ce travail de thèse a été réalisé au sein du laboratoire Dynamique, Évolution,
Expression des Génomes de Micro-organimes de l’Université Louis Pasteur de Strasbourg
(FRE2316) dirigé par Monsieur le Professeur Jean-Claude Hubert lorsque j’ai débuté ce
travail, puis par Monsieur le Professeur Serge Potier qui a pris sa succession. Je les
remercie vivement de m’avoir accueilli au sein de leur unité.
Je tiens à remercier Madame le professeur Marie-Claire LETT qui m’a accueilli au
sein de son équipe et qui a su me guider et me former tout au long de ses quatre années.
Il m’est extrêmement agréable d’exprimer ma reconnaissance à Monsieur Didier
Lièvremont pour les remarques constructives et son aide précieuse.
Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur Philippe Bertin, pour cet œil
nouveau qu’il a apporté et qui a donné un nouvel élan à cette étude.
Un grand merci à Madame Marie-France Demouveau et Madame Sandrine
Koechler, pour leur convivialité et leur travail qui m’a beaucoup aidé.
Je n’oublie pas toutes les personnes du laboratoire qui d’une manière ou d’une autre
ont su m’aider dans l’accomplissement de ce travail. Je tiens également à remercier toutes
celles et ceux qui ont rendu aussi agréables et conviviales ces quatre années au sein du
laboratoire. Je remercie également Yann Brelivet, Nicolas Diebolt, Aurélie Auguste et
Frank Den Hartog qui nous ont apporté leur aide durant leurs stages respectifs.
Je remercie Évelyne Krin (Institut Pasteur), pour m’avoir accueilli et appris la
technique de construction de banque d’ADN génomique.
Madame le docteur Violaine Bonnefoy (CNRS Marseille) et Messieurs les professeurs
Max Mergeay (CEN/SCK, Mol, Belgique) et Yves Piémont (Université Louis Pasteur de
Strasbourg) qui me font l’honneur de juger ce travail. Je tiens à leur exprimer toute ma
reconnaissance.
iTable des matièresChapitre I. Définition, propriétés physico-chimiques et biologiques de l’arsenic 1
I. Introduction 1
II. Cycle biogéochimique de l’arsenic 1
II.1. La géosphère-pédosphère 2
II.2. L’atmosphère 3
II.3. L’hydrosphère 4
II.3.1. Les eaux de surface 6
II.3.2. Les eaux souterraines 6
II.4. La biosphère 6
III. Historique 7
III.1. L’arsenic : médicament ou poison ? 9
III.2. Les activités industrielles et la contamination anthropique 10
III.3. La contamination chronique 12
III.3.1 Les populations à risque 12
III.3.2. Les normes 12
IV. Métabolisme cellulaire de l’arsenic 13
IV.1. L’entrée dans la cellule 14
IV.2. La méthylation de l’arsenic 16
IV.3. L’opéron ars : un système de résistance 19
IV.3.1. ArsR : une famille de régulateurs 21
IV.3.2. ArsB : un système d’extrusion 22
IV.3.2.1. ArsA : une ATPase couplée à ArsB 23
IV.3.2.2.Systèmes d’extrusion eucaryotiques 25
IV.3.3. ArsC : réduction de As[V] en As[III] 25
IV.3.3.1. Réductases à glutarédoxine 27
IV.3.3.2. Réductases à thiorédoxine 27
IV.3.3.3. Réductases eucaryotes 27
IV.4. L’évolution des systèmes de type ars 28
IV.5. La respiration de As[V] ou réduction dissimilatrice 29
IV.6. L’oxydation de As[III] en As[V] 32
IV.6.1. L’historique 32
IV.6.2. L’arsénite oxydase 33
IV.6.3. L’oxydation par des chimiolithotrophes 35
IV.6.4. L’oxydation par des Archaea et des bactéries thermophiles 35
IV.6.5. Les cellules humaines : une oxydation non enzymatique ? 36
V. Toxicité de l’arsenic : le paradoxe 36
V.1. La spéciation 37
iiiV.1.1. Les formes organiques 37
V.1.2. Les formes inorganiques 38
V.1.2.1. As[V] 38
V.1.2.2. As[III] 38
V.2. Les effets sur l’ADN 39
V.3. Le stress oxydatif 40
V.4. Le paradoxe : carcinogène ou anti-cancéreux ? 42
V.5. L’induction de protéines de stress 43
Chapitre II. Objectifs 45
SECONDE PARTIE TRAVAUX PERSONNELS 49
Chapitre I. Arsenite Oxidase aox Genes from a Metal-Resistant ß-Proteobacterium
50
I. Introduction 51
II. Manuscrit 51
III. Résultats complémentaires 59
III.1. Le métabolisme énergétique 59
III.2. La protéine AoxC, une nitroréductase 60
III.3. La protéine AoxD, un cytochrome c 60
III.4. Régulation de l’opéron aoxAB 61
III.4.1. Initiation de la transcription 61
III.4.1.1. Le principe de la technique de l’extension d’amorce 62
III.4.1.2. Les résultats prémilinaires 62
IV. Conclusion 62
Chapitre II. Arsenite oxidase, an ancient bioenergetic enzyme 64
I. Introduction 65
II. Manuscrit 66
III. Résultats complémentaires : L’opéron aoxAB 75
IV. Conclusion 78
Chapitre III. Pleiotropic response of Cenibacterium arsenoxidans, ULPAs1 sp. nov.,
metalloresistant 79
I. Introduction 81
II. Manuscrit 81
III. Résultats complémentaires 112
III.1. Les protéines de réparation de l’ADN et de stress 112
III.1.1. La caractérisation des mutants 112
III.1.2. L’expression des gènes 113
III.1.3. Les tests de croissance 113
ivIII.1.4. La sensibilité des mutants aux rayons UV 114
III.2. Discussion 116
IV. Conclusion 117
Chapitre IV. Acquisition multiple de gènes de résistance à l’arsenic chez
Cenibacterium arsenoxidans 118
I. Introduction 119
II. Matériels et méthodes 119
II.1. Souches, milieux et conditions de culture 119
II.1.1. Souches bactériennes 119
II.1.2. Milieux de cultures 120
II.1.3. Concentration minimale inhibitrice (CMI) 120
II.2. Techniques d’analyse des protéines et des ARN messagers 120
II.3. Construction de la banque d’ADN génomique 120
II.3.1 Plasmide pcDNA2.1 120
II.3.2 Établissement d’une banque de plasmides contenant de petits fragments d’ADN génomique 120
II.4. Technique de complémentation 121
II.3.1 Culture de cellules compétentes 121
II.3.2 Transformation 122
II.3.3 Complémentation 122
II.5. Techniques ADN 122
II.4.1. Extraction des plasmides 122
II.4.2. Séquençage 122
II.4.3. Analyse des séquences 122
III. Résultats 123
III.1. Complémentation par une banque d’ADN génomique 123
III.1.1. Analyse protéomique 125
III.1.2. Expression différentielle des transcrits 126
IV. Discussion 127
IV1. Acquisition multiple de la résistance à l’arsenic 129
IV.2. Le système ars, commun à tous les microorganismes? 131
V. Conclusion 133
Chapitre V. Conclusions générales et perspectives 134
Références 139
Liste des tableaux et figures 159
Annexes 165
vPREMIÈRE PARTIE
INTRODUCTION ET OBJECTIFS

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