Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteurde l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline: Sciences du vivantSpécialité: Aspects moléculaires et cellulaires de la biologiePar Claire PUJOL

De
Publié par

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteurde l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline: Sciences du vivantSpécialité: Aspects moléculaires et cellulaires de la biologiePar Claire PUJOL Rapporteur externe: Rapporteur externe: Rapporteur interne: Directrice de thèse: Pr. Catherine FLORENTZULP (Strasbourg) Dr. Norbert ROLLANDCEA (Grenoble) Pr. Christophe ROBAGLIAUniversité de la Méditerranée (Marseille) Dr. Anne-Marie DUCHENEULP (Strasbourg) Institut de Biologie Moléculaire des PlantesUPR-CNRS 2357 Importation de macromolécules dans les mitochondries etchloroplastes d'Arabidopsis thaliana:Etude des séquences de double adressage desaminoacyl-ARNt synthétases et de la voie desynthèse du Gln-ARNtGln Soutenue publiquement le 25 novembre 2008devant la commission d'examen

  • discours interminables sur l'inflation du prix de paquet de fraises tagada

  • arnt acide

  • ribonucléique de transfert atp

  • gfp gfp

  • gln glutamine


Publié le : samedi 1 novembre 2008
Lecture(s) : 62
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 274
Voir plus Voir moins

Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur
de l’Université Louis Pasteur Strasbourg I
Discipline: Sciences du vivant
Spécialité: Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Par Claire PUJOL
Importation de macromolécules dans les mitochondries et
chloroplastes d’Arabidopsis thaliana:
Etude des séquences de double adressage des
aminoacyl-ARNt synthétases et de la voie de
Glnsynthèse du Gln-ARNt
Soutenue publiquement le 25 novembre 2008
devant la commission d’examen
Directrice de thèse: Dr. Anne-Marie DUCHENE
ULP (Strasbourg)
Rapporteur interne: Pr. Catherine FLORENTZ
ULP (Strasbourg)
Rapporteur externe: Pr. Christophe ROBAGLIA
Université de la Méditerranée (Marseille)
Rapporteur externe: Dr. Norbert ROLLAND
CEA (Grenoble)
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes
UPR-CNRS 2357 Je remercie tout particulièrement Madame Catherine Florentz, Professeur à l'Université Louis
Pasteur de Strasbourg, Monsieur Christophe Robaglia, Professeur à l'Université de la
méditerranée, Aix-Marseille, ainsi que Monsieur Norbert Rolland, Directeur de Recherche à
l’Institut de Recherche en Technologies et Sciences du Vivant de Grenoble, qui ont accepté de
juger ce travail et d'en être les rapporteurs.

Je tiens à remercier vivement Anne-Marie qui m’a supportée quatre années durant… Malgré mes
questions stupides, mes Oups-j’ai-oublié-de-mettre-le-contrôle, mes discours interminables sur
l’inflation du prix de paquet de Fraises Tagada, et malgré touuuut le reste…Merci Anne-Marie,
merci, merci, merci, merci, mer….

A mes trois drôles de dames, S’mira, maman Sarah et Mamie Thalia, pour leurs gentillesse,
leurs patience (surtout leur patience !) pour tous les bons moments au labo et ailleurs…

Je tiens à remercier tous ceux qui font ou qui ont fait partie du 326 :
Surtout (déjà, avant tout …) Laurence merci pour la bonne humeur, l’énergie, les conseils, les
croissants, les Kinders, et tout le reste,
« Les femmes d’abord ! » Liza (Ohhh Liza ! THE funny girl of the lab), Morgane (digne
disciple, qui ne va pas tarder à dépasser le maître), Yasmina et Hélène
2Antonio, Arnaud, Baligh, (François) , Romaric, les garçons du 326 tous très gentils, mais avec
un énooorme défaut : leur capacité à déserter le laboratoire dès qu’il s’agit d’éplucher les
patates !
Sans oublier ceux que je n’ai pas pu remercier dans mon rapport de DEA : Merciiii Romary,
Marlyse et Fatime

Pas de merci assez « gigantesque » pour vous deux Monique et Anne, toujours prêtes à répondre
aux questions stupides, à dépanner, à discuter de la pluie et du beau temps (surtout de la pluie,
vive l’Alsace !)

Aux « jeunes précaires » de l’étage Alexis, Kamel (Amddaklinou), Jéremie, Romain
(« Orange-Doudoune-Man » qui pendant trois ans n’a eu de cesse de critiquer mon goût prononcé
pour les couleurs !), Noha, sans oublier les « imposteurs » de viro Celine, Diane et Rrrrulia ; à
ceux qui ne sont pas rester assez longtemps Carolina la Brésilienne et Carolina l’Argentine,
Elina, Dasha…

A tous les « vieux permanents » (et oui, on ne peut pas tout avoir…) : André, Danièle,
« Félipé », Frédérique, Gag, Géraldine, Heike, Le Grand Chef Jean-Michel, Jean, José,
Patrice, Véronique…

A tous les gens-gentils qui remplissent l’IBMP, a tous ceux que j’ai forcément oubliée

A la Laiterie et à mes Binômes de Concert, à mes Amis (cf. Binômes de concert et binômes
tout court) à ma Famille. ABBREVIATIONS


A Adénine
aa Acide aminé
aaRS Aminoacyl-ARNt synthétase
ADN Acide désoxyribonucléique
AdT Amidotransférase ARNt dépendante
ADP Adénosine-5'-diphosphate
APS Persulfate d’ammonium
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique méssager
ARNt Acide ribonucléique de transfert
ATP Adénosine triphosphate
BET Bromure d’éthidium
°C Degré (s) Celsius
Cam Chloramphénicol
CIP Phosphatase intestinale de veau
Ci Curie
Da Dalton
DO Densité optique
DTT Dithiothréitol
EDTA Ethylène diamine tétraacétate
g Gramme
g Multiple de la gravitation naturelle de la terre
Glu Glutamate
GluRS Glutamyl-ARNt synthétase
Gln Glutamine
GlnRS Glutaminyl-ARNt synthétase
GFP GFP « Green Fluorescent Protein »
h Heure
Hepes Acide N-2 hydroxy éthyl pipérazine N’-2 éthane sulfonique
IPTG Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside Kan Kanamycine
kb Kilo bases
LB Luria broth
µ Micro
M Molaire
mA Milliampère
min Minute
mt Mitochondrial/mitochondriaux
PAGE Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
PM Poids moléculaire
SDS Dodécyl sulfate de sodium
SSC Standard sodium citrate
TBE Tris borate EDTA
TCA Acide trichloroacétique
Tris Tris(hydroxyméthyl)aminométhane
U Unité
UV Ultra-violet
V Volt
p/v Poids à volume
v/v Volume à volume
W Watt
X-GAL 5-bromo-4-chloro-3-indole-β-D-galactopyrranoside
Table des matières
INTRODUCTION

I.MITOCHONDRIES ET CHLOROPLASTES, GENERALITES 1

1.LES MITOCHONDRIES 2
A-STRUCTURE ET FONCTIONS 2
B.GENOME DES MITOCHONDRIES 3
1.Contenu des génomes mitochondriaux 3
2.Organisation du génome 4
3.Particularité du code génétique mitochondrial 5
2.LES PLASTES 5
A-STRUCTURE ET FONCTIONS 6
B-GENOMES DES CHLOROPLASTES 8
1.Contenu des génomes 8
2.Organisation du génome chloroplastique 9
3.ECHANGES ENTRE GENOMES 9
A-TRANSFERT ET PERTE DE GENES 10
1.Gènes codant pour les ARNr 10
2.Gènes codant pour les ARNt 10
3.Gènes codant pour les protéines 11
B-POURQUOI LES ORGANITES PERDENT LEUR GENOME ? 11
C-POURQUOI LES ORGANITES CONTIENNENT ENCORE UN GENOME ? 11

II.LES MOLECULES IMPLIQUEES DANS LA SYNTHESE DES PROTEINES 14

1.GENERALITES 15
2.LES ARN DE TRANSFERT (ARNt) 15
A-STRUCTURE DES ARNt 15
B-DU GENE A L’ARNt 16
C-ELEMENTS D’IDENTITE DES ARNt 18
D-EXPORTATION DES ARNt DU NOYAU VERS LE CYTOPLASME 18
3.LES AMINOACYL-ARNt SYNTHETASES (aaRS) 19
A-LES DEUX CLASSES D’aaRS 19
1.Les aaRS de classe I 19
2.Les aaRS de classe II 20
B-ORGANISATION DES AARS 20
1.Structure modulaire 20
2.Complexes multisynthétasiques 21
3-Autres fonctions des aaRS 22
C-ORGANISATION DES GENES CODANT POUR LES AARS D’ORGANITES 22
4.VOIES ALTERNATIVES DANS L’AMINOACYLATION DES ARNt 24
GlnA-SYNTHESE DU GLN-ARNt DANS LES ORGANITES 25
1.Dans les chloroplastes 25
2.Dans les mitochondries 25
2.a - Dans les mitochondries de protozoaires 26
2.b - Dans les mitocies de Saccharomyces cerevisae 26
2.c - Dans les mitochondries d’ Homo sapiens 26
2.d - Dans les mitocies végétales 26
C-LES ENZYMES IMPLIQUEES DANS LA VOIE INDIRECTE 27
1.Amidotransférases ARNt dépendante 27
Table des matières
1.a – Généralités 27
1.b - Réactions catalysées par l’AdT 28
1.c - Rôles des différentes sous-unités 28
1.d - Reconnaissance des ARNt par l’AdT : 29
2.AaRS non discriminante 29
2.a - GluRS 29
2.b – AspRS 30
3.Complexe entre Adt, ARNt et aaRS 30
D-AUTRE VOIES INDIRECTES 31
1.Aminoacylation de l’ARNt Cystéine 31
2.Aminoacylation de l’ARNt Selenocystéine 31

III.IMPORTATION DES MACROMOLECULES DANS LES MITOCHONDRIES ET
LES CHLOROPLASTES 32

1.IMPORTATION DES ACIDES NUCLEIQUES 33
A-DANS LES MITOCHONDRIES 33
1.Importation des ARNt 33
1.a - Importation des ARNt dans les mitochondries de levure : 33
1.b - Importation des ARNt dans les mitochondries de protozoaires : 34
1.c - Importation des ARNt dans les mitochondries de plantes : 34
2. Importation des autres ARN 35
3.Importation ADN 35
B-DANS LES CHLOROPLASTES 35
1.Importation des ARNt 36
2.Importation des ARNm 36
2.IMPORTATION DES PROTEINES 36
A-LES ELEMENTS REQUIS POUR L’IMPORTATION : LES SEQUENCES
D’ADRESSAGE 36
1.Séquences d’adressage pour les protéines destinées aux mitochondries :
préséquences 37
2.Séquences d’adressage pour les protéines destinées aux chloroplastes :
peptides transit 38
3.Les logiciels de prédiction 38
B-SYSTEME DE RECONNAISSANCE ET DE TRANSLOCATION 39
1.Importation dans les mitochondries 39
1.a - Importation dans les mitochondries de S. cerevisae 40
1.b - Importation dans les mitochondries de plante 42
2.Importation des protéines dans les chloroplastes 43
C-CLIVAGE DE LA SEQUENCE D’ADRESSAGE : MPP ET SPP 46
D-CAS PARTICULIER : PROTEINES DOUBLEMENT ADRESSEES AUX
MITOCHONDRIES ET AUX CHLOROPLASTES. 47
1. Généralités sur le double adressage 47
2.Double adressage mitochondrial/chloroplastique 48
3. Séquences d’adressage ambiguës 49

PROJET DE THESE

Table des matières
MATERIEL ET METHODES

I.MATERIEL 52

1.MATERIEL VEGETAL 53
2.SOUCHES BACTERIENNES 53
A-LES SOUCHES D’ESCHERICHIA COLI 53
B-SOUCHE D’AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 54
3.PLASMIDES 54
4.CONSTRUCTIONS 56
5.ANTICORPS POLYCLONAUX 56
6.OLIGONUCLEOTIDES 57
7.OUTILS INFORMATIQUES 57

II.METHODES 59
1.TECHNIQUES SPECIFIQUES A L’ADN 60
A-AMPLIFICATION PAR PCR 60
B-MUTAGENESE PAR PCR 60
C-ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE 61
D-PURIFICATION DES FRAGMENTS D’ADN ISSUS DE GELS D’AGAROSE 62
E-TECHNIQUES DE CLONAGE 62
1.Clonage de fragments coupés par des enzymes de restriction 62
1.a - Digestion par des enzymes de restriction 62
1.b - Déphosphorylation de l’extrémité 5’-phosphate d’un plasmide 62
1.c – Ligation 62
1.d - Préparation des bactéries compétentes 63
1.e - Transformation et sélection 63
2.Clonage direct d’un produit PCR 64
2.a – Principe 64
2.b – Méthode 65
F-CRIBLAGE DE COLONIES PAR PCR 65
G-PREPARATION DE L'ADN PLASMIDIQUE 65
1.Minipréparation d'ADN plasmidique 65
2.Midipréparation d'ADN plasmidique 65
H-SEQUENÇAGE DE L'ADN 66
I-MARQUAGE D’OLIGONUCLEOTIDES 66
2.TECHNIQUES SPECIFIQUES A L’ARN 66
A.EXTRACTION D’ARNt 66
1.ARNt totaux 66
2.ARNt mitochondriaux et chloroplastiques 67
B-ELECTROPHORESE DENATURANTE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE 67
C-« NORTHERN BLOT » 68
1.Transfert des ARN 68
2.Hybridation de la sonde 68
D-TRANSCRIPTION IN VITRO 69
E-DETERMINATION DE L’ACTIVITE AMINOACCEPTRICE DES ARNt 69

Table des matières
1.Préparation des extraits enzymatiques 69
1.a - Extrait enzymatique total de feuilles d’A. thaliana 69
1.b - Extraits enzymatiques mitochondriaux et de chloroplastiques 70
2.Aminoacylation in vitro 70
3.Amidation in vitro 71
F-FRACTIONNEMENT DES ARNT PAR ELECTROPHORESE 2D 72
1.Préparation des gels de polyacrylamide et électrophorèse 72
2.Détection et élution des ARNt 73
3.QUANTIFICATION DE L’ADN ET DE L’ARN 73
4.TECHNIQUES RELATIVES AUX PROTEINES 74
A-QUANTIFICATION DES PROTEINES 74
B-TECHNIQUES DE CONCENTRATION DES PROTEINES 75
C-ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE 75
1.Electrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) 75
2.Détection des protéines après fractionnement électrophorétique 76
D-IMMUNOREVELATION DE TYPE « WESTERN BLOT » 76
1.Transfert des protéines sur membrane 76
2.Coloration des protéines après électrotransfert sur membrane 77
3.Fixation des anticorps 77
4.Révélation de la fixation des anticorps 77
E-PURIFICATION DES ANTICORPS 78
1.Obtention de l’anticorps anti-AdT 78
2.Purification des anticorps anti-AdT 78
F.SUREXPRESSION DE PROTEINES DANS E.COLI 79
5.TECHNIQUES RELATIVES AUX ORGANELLES DE PLANTES 79
A-PURIFICATION DES ORGANITES 79
1.Purification des mitochondries 79
1.a - Mitochondries de S. tuberosum 79
1.b - Mitocies d’A.thaliana 80
1.c - Mitochondries de P. sativum 81
2.Purification des chloroplastes 81
2.a - Chloroplastes de P. sativum 82
2.b - Chloroplastes d’A.thaliana 83
B-TEST D’IMPORTATION IN VITRO DES PROTEINES 83
1.Transcription et traduction in vitro 83
2.Test d’importation in vitro dans les mitochondries 84
3.Test d’importation in vitro dans les chloroplastes 85
4.Système in vitro de double importation 86
6.OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES 86
A-CARACTERISTIQUES DU MICROSCOPE CONFOCAL LSM 87
B-PREPARATION DES PROTOPLASTES DE N. BENTHAMIANA 87
1.Transformation des cellules végétales par A. tumefaciens 87
2.Préparation des protoplastes de N. benthamiana 88
C-COLORATION DES MITOCHONDRIES 88
D-COLORATION DU RETICULUM 88
E- BREFELDINE A 88
F-TRAITEMENT DES IMAGES 88

RESULTATS

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.