UN I V E R S I T E LO U I S PA S T E U R –S T R A S B O U R G I

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UN I V E R S I T E LO U I S PA S T E U R –S T R A S B O U R G I U.F.R. des Sciences de la Vie et de la Terre THESE Présentée par Claire GASNIER En vue d'obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Soutenue le 23 juin 2006 devant la commission d'examen : Mr Dominique AUNIS (Examinateur) Mme Marie-Hélène METZ-BOUTIGUE (Directeur de thèse) Mr Yves-Marie PIEMONT (Rapporteur interne) Mme Françoise SCHOENTGEN (Rapporteur externe) Mr Joël MAZURIER (Rapporteur externe) Mme Marie CHARVERON ((Examinateur) Nouvelles données sur les relations structure/fonction des chromogranines et leurs applications

  • glandes surrenales

  • systeme immunitaire

  • nouvelles données sur les relations

  • cellules chromaffines de la glande surrenale

  • implication des cellules chromaffines

  • role de l'immunite innee dans la stimulation des reponses immunitaires

  • immunite naturelle

  • relations entre le systeme nerveux


Publié le : jeudi 1 juin 2006
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 249
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UN I V E R S I T ELO U I SPA S T E U R– ST R A S B O U R GI
U.F.R. des Sciences de la Vie et de la Terre
THESE
Présentée par C l a i r e G A S N I E R
En vue d’obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
Nouvelles données sur les relations structure/fonction
des chromogranines et leurs applications
Soutenue le23 juin 2006devant la commission d’examen : Mr Dominique AUNIS(Examinateur) Mme Marie-Hélène METZ-BOUTIGUE(Directeur de thèse) Mr Yves-Marie PIEMONT(Rapporteur interne) Mme Françoise SCHOENTGEN(Rapporteur externe) Mr Joël MAZURIER(Rapporteur externe) Mme Marie CHARVERON((Examinateur)
A Térence et à Philippe
La subtilité humaine ne concevra jamais une invention plus belle, plus simple ou plus juste que la nature car dans ses inventions rien ne manque, et rien n’est superflu.
Leonardo da Vinci (Peintre, sculpteur, ingénieur, architecte et savant, 1452-1519)
Merci !
Ce travail a été effectué dans l’unité Inserm 575, Physiopathologie du système nerveux. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au DrDominique Aunis, directeur de recherche à l’Inserm et directeur de l’U575, pour m’avoir accueillie dans son unité et m’avoir donné l’opportunité de réaliser mes recherches dans des conditions très favorables. Je dois un grand remerciement au DrMarie-Hélène Metz-Boutiguem’avoir pour accueillie dans son équipe comme ingénieure, et m’avoir permis cependant de réaliser ce travail de thèse. Merci pour sa confiance, son soutien, sa compréhension et ses encouragements. Merci encore pour ses conseils scientifiques avisés, ainsi que pour son intérêt dans mes recherches. Je tiens à adresser mes plus vifs remerciements au ProfesseurYves-Marie Piemont, ainsi qu’aux docteursFrançoise Schoentgen,Marie Charveron,Joël Mazurieravoir pour chaleureusement accepté de juger ce travail, et pris la peine de lire ce manuscrit. Je remercie également les docteursJean-Claude Voegel,Christophe Egles et Olivier Etienne de l’U595 pour m’avoir permis de collaborer avec succès à un projet enrichissant et prometteur. Ma reconnaissance va au PrYoussef Haikel, doyen de la faculté d’odontologie, qui m’a soutenu financièrement cette année. Je remercie particulièrementJean-Marc Strub pour son aide en spectrométrie de masse, etSylvie Grosch pour son expertise en microscopie confocale. Un grand merci à Corinne Taddéi(une autre grande amatrice de thé) pour la relecture attentive et critique de ce manuscrit. Je remercie tous mes collègues de laboratoire, passés et présents, cette thèse n’aurait pas été un plaisir sans quelques personnes formidables :Yannick Goumon, ton aide et tes conseils me seront utiles encore longtemps. Pour ce que tu m’as donné, reçois ici mon amitié, mon respect, et ma profonde reconnaissance. Il n’y a pas de travail sans plaisir ; la joie, la bonne humeur et l’humour, sont autant d’atouts qui contribuent au bon déroulement d’une thèse, pour tout cela je tiens à adresser mes plus vifs remerciements àElise(notre grande sœur à tous),Patricia(surtout ne change rien, mais avec une double dose de chocolat),Dan(merci pour l’enrichissement culturel),Martine S.bien précieusement tes amitiés (conserve pâtissières…),Aziza(bon courage avec les parasites),Peimantu es beau  (que !),Arnaud(Président du Comité d’Extermination par Phagocytose des Crayons Innocents),Bernard(désolée, je ne m’appelle toujours pas Hélène),François(désolée que nous n’ayons pas eu le temps de faire plus ample connaissance), qui ont su avec beaucoup de stoïcisme supporter et peut-être parfois apprécier (?) mes blagues et mes jeux de mots (Elise, je compte sur toi pour reprendre dignement le flambeau !). Tous les stagiaires qui m’ont croisée pendant ces 5 années, et plus particulièrement Véronique Piel,Céline Trometer, etNathalie Tien-Mi-Tiee, 3 stagiaires que j’ai pu encadrer avec plaisir, mais aussiPerrine,Aurélia,Mélanie,Priscille,Thierry,Julien,Abdeslam,Stéphaneet tous les autres, merci à tous les étudiants qui sont passés dans le laboratoire, pour
les bons moments que nous avons partagés, j’ai plus appris grâce à vous que je ne vous ai appris… Je n’oublie pas ceux qui sont déjà partis vers des contrées plus lointaines (c’est-à-dire plus loin que l’Esplanade) :Jenny, ma voisine de paillasse pendant 3 ans, merci de ta spontanéité, de ta simplicité et de ta sincérité, je te souhaite un avenir riche et créatif,Amaret Jean-Eric, souriants et drôles, soyez de gentils papas,Gérard Nullans, merci de tes qualités humaines, profite pleinement de ta retraite. Aux personnes croisées au détour d’un couloir (ou dans la pièce 3401), un sourire, quelques mots, ou blagues, merci pour cela,Delphine,Stella,Laetitia,MartineR,Olivier, Patrice,Jean-Paul… Merci à toutes les personnes de l’unité qui ont, grâce à leurs conseils, contribué à l’avancement de mes travaux de thèse. La thèse est avant tout une expérience humaine où se succèdent certitudes et désillusions, enthousiasme et découragement. Je voudrais exprimer toute ma gratitude à celles qui ont contribué à me remonter le moral durant cette thèse, qu’elles soient depuis peu docteur, ou en passe de l’être,Isabelle,Céline M, etCéline S, je vous remercie pour ces 5 années d’amitié. Vous avez été là quand j’en ai eu besoin, c’est beaucoup, pour cela je vous dis un grand merci. Et parce qu’il y a une vie hors du labo, je tiens à remercier tous ceux qui m’ont encouragée et réconfortée dans les moments difficiles :Sara Hardy, Louis Calaferte, Emmanuel Decelle, Priscilla Decelle, Terry Pratchett, Céline Buyse, Marie Gaumé, JK Rowling, Jérome Rageot, Fabrice Goulven, Vincent Rinche, Didier van Cauwelaert, Marlène Cot, Céline Théron, Christelle Gabaston, Emeline Fabre, Douglas Adams, Johanna Gourmaud, Delphine ThéardJe tiens à remercier mes parents qui ont toujours veillé de près, malgré la distance, à mon bien-être avec une confiance sans borne.Sylvie, maman, grâce à toi maintenant je suis une grande fille, mais la petite fille qui demeure en moi aura toujours besoin de toi.Gérard, papa, tu as su me faire grandir dans l’amour de la science, merci.Vincent, qu’il est bon de te connaître mon frère. Mes grands parents,RenéetSimone, qui m’ont toujours soutenu, et ont fait les frais de mes premières expériences scientifiques. MamieBerthe, là haut j’espère que tu es heureuse, merci pour tout ce que tu as été. Et enfin, à ceux qui sont jour après jour à mes côtés, me soutiennent, me supportent, me connaissent par cœur. Pendant toutes ces années, j’ai toujours pu compter sur un soutien indéfectible, riche en amour. MerciPhilippe, parce que c’est toi.Térence, merci mon bébé, j’ai du mal à croire que tu sois déjà si grand, tu es ma joie, merci d’être. Merci simplement parce que vous êtes là. Les mots ici ne diront pas tout. Merci de tout mon cœur.
SOMMAIRE
ABREVIATIONS
FIGURES
TABLEAUX
INTRODUCTION
Sommaire
Données bibliographiques
Sommaire
CHAPITRE I : LES CELLULES CHROMAFFINES DE LA GLANDE SURRENALE :
NOTRE MODELE D’ETUDE
I-LES GLANDES SURRENALES
II-LES CELLULES CHROMAFFINES
III-LES GRANULES DE SECRETION
IV-IMPLICATION DES CELLULES CHROMAFFINES LORS DES ETATS DE STRESS
CHAPITRE II : RELATIONS ENTRE SYSTEME NERVEUX ET SYSTEME
IMMUNITAIRE
a
h
l
o
- 1 -
- 5 -
-5--7--9--11-
- 13 -
I-LES FACTEURS DE LIMMUNITE -13-1-INTRODUCTION -13-2-L’IMMUNITE ADAPTATIVE -14-3-L’IMMUNITE NATURELLE OU INNEE -17-9Effecteurs mis en jeu - 18 -4-ROLE DE LIMMUNITE INNEE DANS LA STIMULATION DES REPONSES IMMUNITAIRES ADAPTATIVES-20-II-RELATIONS ENTRE LE SYSTEME NERVEUX ET LE SYSTEME IMMUNITAIRE INNE -22-1-INTRODUCTION -22-2-LES LIENS ENTRE LESNCET LIMMUNITE -22-
- a -
3-CONTROLE DUSNSSUR LIMMUNITE
9Effets du Neuropeptide Y sur les cellules immunitaires
4-EFFETS DES FACTEURS DE LA SURRENALE SUR L'IMMUNITE
a- L’axe HHS : agent de la régulation de la réponse immunitaire
b- Rôle de la médullo-surrénale sur l’immunité
5-CONCLUSION
CHAPITRE III : LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS (PAMS)
I-INTRODUCTIONII-LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS CATIONIQUES1-PEPTIDES LINEAIRES EN HELICEαAMPHIPATHIQUE2-LES PEPTIDES LINEAIRES RICHES EN PROLINE3-LES PEPTIDES ORGANISES EN FEUILLETβ
Sommaire
-24-- 26 --26-- 26 -- 27 --28-
- 30 -
-30--30--31--32--33-III-ACTION DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DANS LE CADRE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE -34--34--34--35--36--37--38--39--40--41--41--42--42--43--44--44--44--45--45--45--46--47--49-
1-INTRODUCTION2-IMPLICATION DESPAMS CATIONIQUES DANS LIMMUNITE3-PEPTIDES EXPRIMES CONJOINTEMENT AVEC DES ELEMENTS DU SYSTEME IMMUNITAIRE4-ROLES PHYSIOPATHOLOGIQUES DESPAMS5-ACTION DIRECTE DESPAMS SUR LES PATHOGENES6-MODULATION DU SYSTEME IMMUNITAIRE PAR LESPAMS7-ACTIVATION DU SYSTEME IMMUNITAIRE PAR LESPAMS8-SUPPRESSION DE LINFLAMMATION MEDIEE PAR LESPAMS9-LESPAMS COMME ADJUVANTS DANS LIMMUNITE10-MECANISME DE LA MODULATION DE LIMMUNITE PAR LESPAMS11-CONCLUSIONIV-MODES DACTION DIRECT DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS1-LE MODELE BARREL-STAVE2-LE MODELE CARPET-LIKE3-LE MODELE TOROÏDAL OU WORMHOLE4-AUTRES MODES DACTION DES PEPTIDES ANTIMICROBIENSV-APPLICATIONS THERAPEUTIQUES DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS1-INTRODUCTION2-ROLE DESPAMS CONTRE LES PATHOGENES3-ROLE CONTRACEPTIF ET ANTITUMORAL4-UNE VOIE POSSIBLE DADMINISTRATION DESPAMSVI-CONCLUSION
- b -
CHAPITRE IV : LES CHROMOGRANINES / SECRETOGRANINES
I-LA FAMILLE DES GRANINES
II-LOCALISATION DES CHROMOGRANINES
III-MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES DES CHROMOGRANINES
IV-FONCTIONS BIOLOGIQUES DES CHROMOGRANINES
V-LA CHROMOGRANINEAET LA CHROMOGRANINEB
1-STRUCTURE PRIMAIRE DES CHROMOGRANINES
a- La CGA b- La CGB 2-LES PEPTIDES DERIVES DES CHROMOGRANINESa- La CGA 9Les vasostatines I et II
9La Prochromacine et La Chromacine
9La chromostatine
9La pancréastatine 9Le WE-14 9La catestatine
9La parastatine
9Protéolyse de la chromogranine A par la PC2 b- La CGB 9Le GAWK
9Le BAM -1745
9Le CCB (C-terminal Chromogranin B derived peptide)
9La Sécrétolytine
3-LOCALISATION DES CHROMOGRANINES
4-IMPLICATION DES CHROMOGRANINES DANS LES DESORDRES NEURODEGENERATIFSa- La CGA 9La maladie de Parkinson
9La sclérose latérale amyotrophique
9La schizophrénie
9La maladie d’Alzheimer
9Activation des cellules microgliales b- La CGB 9La schizophrénie
9La maladie de Creutzfeld-Jakob
Sommaire
5-UTILISATION DES CHROMOGRANINES COMME MARQUEUR DE TUMEURS NEUROENDOCRINES
- c -
- 50 -
-50--50--52--53--53--54-- 54 -- 58 --60-- 60 -- 61 -- 62 -- 62 -- 63 -- 63 -- 63 -- 64 -- 65 -- 65 -- 66 -- 66 -- 66 -- 67 --67--68-- 68 -- 69 -- 69 -
- 69 -- 69 -- 70 -- 70 -- 70 -- 70 --71-
a- La CGA b- La CGB 6-FONCTION BIOLOGIQUE DES CHROMOGRANINESa- La CGA 9Interaction CGA-SgIII 9Interaction de la CGA sur le récepteur de l’IP3
9Rôle dans les mécanismes de sécrétion 9Rôle de la CGA dans la circulation b- La CGB 9Implication dans les phénomènes de sécrétion 9Rôle potentiel dans la transcription VI-LA SECRETOGRANINEII
1-SYNTHESE ET EXPRESSION DE LASGII 2-STRUCTURE PRIMAIRE ET MATURATION PROTEOLYTIQUE3-LES PEPTIDES ISSUS DE LA MATURATION DE LASGII a- La sécrétoneurine b- Le peptide EM-66 c- La mansérine
d- Le peptide AMENM
VII-CONCLUSION
Résultats expérimentaux
Sommaire
- 71 -- 72 --72-- 72 -- 72 -- 72 -- 73 -- 74 -- 75 -- 75 -- 75 --77--77--78--81-- 81 -- 82 -- 83 -- 83 --84-
CHAPITRE I : ANALYSE DES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES DE LA CHROMOGRANINE B PRESENTE DANS LES GRANULES DE SECRETION DES CELLULES CHROMAFFINES BOVINES - 85 -
I-CONTEXTE DE LETUDEII-RESULTATS ACQUIS AVANT MON ETUDEIII-PRINCIPAUX RESULTATS1-PUBLICATION1 2-STRATEGIE EXPERIMENTALEa- Electrophorèse bidimensionnelle b- Digestion de la CGB par l’endoprotéase Lys-C : analyse des fragments c- Analyse du fragment naturel CGB1-192d- Analyse du fragment naturel CGB564-626IV-DISCUSSION-CONCLUSIONS
- d -
-85--86--88--88--88-- 88 -- 89 -- 89 -- 89 --90-
a- Les phosphorylations
b- Les glycosylations
c- Les sulfatations
d- Les oxydations
e- Le polymorphisme M/V
f- Conclusion
V-PERSPECTIVES
Sommaire
- 90 -- 90 -- 91 -- 91 -- 91 -- 92 --93-
CHAPITRE II : ANALYSE PROTEOMIQUE DE LA MATURATION PROTEOLYTIQUE DE LA SECRETOGRANINE II CONTENUE DANS LES GRANULES DE SECRETION DES CELLULES CHROMAFFINES DE LA MEDULLO-SURRENALE BOVINE - 107 -
I-INTRODUCTION
II-STRATEGIE EXPERIMENTALE
III-RESULTATS
1-CARTOGRAPHIE DES FRAGMENTS DERIVES DE LASGII
a- Electrophorèse bidimensionnelle
b- Identification des différents fragments dérivés de la Sg II
2-RECHERCHE ET LOCALISATION DES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES
IV-CONCLUSION
-107--109--110--110-- 110 -- 114 --115--119-
CHAPITRE III : MISE EN EVIDENCE DE L’EXISTENCE DE PEPTIDES A ACTIVITES ANTIMICROBIENNES ET ANTIFONGIQUES DERIVES DE LA SECRETOGRANINE II -121 -
I-INTRODUCTION
II-STRATEGIE EXPERIMENTALE
III-RESULTATS
1-RECHERCHE DE PEPTIDES ANTIMICROBIENS NATURELS
-121--121--122--122-
2-ANALYSE DE LACTIVITE ANTIMICROBIENNE DE LA SECRETONEURINE ET DU PEPTIDE AMENM -122-3-ANALYSE DE LA SEQUENCE DE LASGIIBOVINE -122-4-ACTIVITES ANTIMICROBIENNES DES PEPTIDES SYNTHETIQUES(A-D) -126-
5-ANALYSE DE LINTERACTION DES PEPTIDESAEETCEAVEC LE CHAMPIGNON FILAMENTEUX
NEUROSPORA CRASSA -129-6-RECHERCHE DE SIMILARITE DES PEPTIDES RETENUS AVEC DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS CONNUS -129-
- e -
IV-CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Sommaire
CHAPITRE IV : INSERTION D’UN PEPTIDE ANTIMICROBIEN DERIVE DE LA
CHROMOGRANINE A DANS UNE NANOSTRUCTURE
I-CONTEXTE DE LETUDE
II-PRINCIPAUX RESULTATS
1-PUBLICATION2
2-STRATEGIE EXPERIMENTALE
a- Construction des films de polyélectrolytes
b- Insertion de la chromofungine
c- Tests d’activité antifongique
d- Microscopie confocale
e- Tests de cytotoxicité
f- Etude in vivo
III-CONCLUSION ET PERSPECTIVES
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
MATERIELS ET METHODES
-132-
- 134 -
-134--134--134--135-- 135 -- 135 -- 135 -- 136 -- 136 -- 136 --137-
- 147 -
- 150 -
I-PREPARATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE -150-1-PURIFICATION DES PROTEINES SOLUBLES DE LA MATRICE INTRAGRANULAIRE DES CELLULES CHROMAFFINES -150-II-DOSAGE PROTEIQUE -151-III-SYNTHESE PEPTIDIQUE -151-IV-METHODES DE PURIFICATION DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES -152-1-PREPARATION DE LECHANTILLON -152-2-CHROMATOGRAPHIEHPLCDE PHASE INVERSE -153-a- Préparation de la phase mobile - 153 -b- Séparation - 153 -3-CHROMATOGRAPHIE DEXCLUSION -154-4-CHROMATOGRAPHIE DAFFINITE -154-a- Purification d’anticorps polyclonaux à partir de sérum de lapin - 154 -b- Fixation des anticorps sur la colonne d’affinité - 155 -c- Purification de l’échantillon - 155 -5-DESSALAGE DES ECHANTILLONS -155-
- f -
V-ANALYSE DES PROTEINES PAR GELS DELECTROPHORESE
1-ELECTROPHORESE MONODIMENSIONNELLE SUR GELDEPOLYACRYLAMIDE
2-ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE
a- Isoélectrofocalisation
9Réhydratation
9Migration
b- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes
9Réduction alkylation des molécules
9Migration
3-COLORATION DES PROTEINES AU BLEU DECOOMASSIE
4-COLORATION DES PROTEINES AU NITRATE DARGENT
5-ÉLECTROTRANSFERT ET IMMUNODETECTION
6-PREPARATION D'ANTICORPS POLYCLONAUX
VI-ETUDES STRUCTURALES
1-SEQUENÇAGE PEPTIDIQUE
2-SPECTROMETRIE DE MASSE(MALDI-TOF)
3-DIGESTION TRYPSIQUE IN GEL
VII-CARACTERISATION DES ACTIVITES BIOLOGIQUES
1-ACTIVITE ANTIBACTERIENNE
2-ACTIVITE ANTIFONGIQUE
3-ACTIVITE HEMOLYTIQUE
VIII-REACTIONS CHIMIQUES ET ENZYMATIQUES
1-OXYDATION
2-DIGESTIONS PROTEOLYTIQUES
a- Endoprotéase Lys-C
b- Trypsine
IX-MICROSCOPIE CONFOCALE
X-METHODES BIOINFORMATIQUES
XI-ANALYSE STATISTIQUE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LISTE DES PUBLICATIONS
LISTE DES COMMUNICATIONS
- g -
Sommaire
-156--156--157-- 157 -- 158 -- 158 -- 159 -- 159 -- 160 --160--160--161--163--163--163--163--165--166--166--167--167--168--168--168-- 168 -- 168 --168--169--169-
- 170 -
- 217 -
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