UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR

De
Publié par

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
3 UNIVERZITA KARLOVA UNIVERSITÉ LOUIS-PASTEUR Charakterizace Na+/H+- antiportních systém? plasmatické membrány kvasinek Dizerta?ní práce 2001 Ing. Olga Kinclová

  • cht?la bych

  • charakterizace na

  • ústavu biochemie

  • bañuelos za podn?tné

  • contenu en cations monovalents dans les cellules par spectroscopie d'absorption

  • cations monovalents

  • ve ?trasburku

  • fyziologickém ústavu

  • tions monovalents dans les cellules


Publié le : mercredi 20 juin 2012
Lecture(s) : 41
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 129
Voir plus Voir moins
plasmatické membrány kvasinek
Dizertační práce
2001
3
+ + Charakterizace Na /H - antiportních systémů
UNIVERSITÉ LOUIS-PASTEUR
 Ing. Olga Kinclová
UNIVERZITA KARLOVA
2001
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE UNIVERSITÉ LOUIS-PASTEUR
plasmatické membrány kvasinek Dizertační práce  Ing.Olga Kinclová
4
+ + Charakterizace Na /H - antiportních systémů
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE UNIVERSITÉ LOUIS-PASTEUR - STRASBOURG
+ + Charakterizace Na /H - antiportních systémůplasmatické membrány kvasinek Etude fonctionnelle des antiporteurs membranaires de cations monovalents codés par le gèneNHA1 deSaccharomyces cerevisiaeet par ses orthologues Dizertační práce Thèse de doctorat2001Ing.Olga Kinclová
5
Poděkování
Na tomto místěbych chtěla nejvíce poděkovat RNDr. HaněSychrové, CSc. a Prof. Sergi Potierovi za odborné vedení při vytváření této práce, jejich všestrannou pomoc, ochotu a cenné rady během celého studia.  Mé poděkování patří také Dr. Marii A. Bañuelos za podnětné diskuze a za obětavou pomoc při realizaci experimentální práce v laboratoři ve Štrasburku.  Velké poděkování patří všem spolupracovníkům z oddělení Membránového transportu na Fyziologickém ústavu AVČR v Praze a z Laboratoře mikrobiologie a genetiky Botanického ústavu ve Štrasburku za vytvoření příjemného a přátelského pracovního prostředí pro vypracování této práce. Za všestrannou pomoc při pobytech ve Štrasburku bych chtěla poděkovat Collège Doctoral Européen.  Chtěla bych také poděkovat Prof. Josému Ramosovi za jeho odbornou pomoc v oblastech stanovování obsahu alkalických kationtův buňkách a spolu s ním také jeho spolupracovníkům, zejména Dr. Fernandu Calerovi, za vlídné přijetí v laboratořCordobi v ě a pomoc při experimentální práci. Za pomoc při mikroskopických pozorováních buněk bych chtěla poděkovat Dr. Axelle Balguerie, Dr. Marcu Bonneuovi a Prof. Michelu Aigleovi z laboratoře Ústavu biochemie a genetiky buněk v Bordeaux, Doc. Zdeněz P Pálkové řírodovědecké fakulty UK v Praze a RNDr. Lucii Kubínové, CSc. z Fyziologického ústavu AVČPraze a zaR v pomoc při stanovování obsahu kationtůatomovou absorpční spektroskopií patří můj dík také RNDr. VlastěKorunové z Ústavu analytické chemie AVČR v Praze.  Zvláštní poděkování patří všem mým nejbližším, rodičům a přátelům za jejich trpělivost a podporu během celé doby studia.
6
Remerciements
 Je tiens à remercier le Docteur Hana Sychrová et le Professeur Serge Potier pour m’avoir dirigée durant ce travail, ainsi que pour leur disponibilité et leurs conseils précieux pour mener à bien ce projet.  Je remercie le Docteur Maria A. Bañuelos pour nos nombreuses discussions et son aide dans la réalisation du travail expérimental au laboratoire de Strasbourg.  Merci a tous mes ami(e)s et collègues du Département du Trans-port Membranaire de l’Institut de Physiologie à Prague et du Laboratoire de Micro-biologie et Génétique de l’Institut Botanique à Strasbourg pour tous les coups de mains, les conseils et les fous rires. Je voudrais aussi remercier le Collège Doctoral Européen pour son aide lors mes séjours à Strasbourg.  Je remercie vivement le Professeur José Ramos de m’avoir accueillie dans son laboratoire à Cordoba et son aide concernant la détermination du contenu en ca-tions monovalents dans les cellules. Je ne saurais oublier tous les collègues de son laboratoire pour leur sympathique accueil et en particulier le Dr. Fernando Calero, qui m’a aussi aidé lors mes expériences. Je remercie le Dr. Vlasta Korunová de l’Institut de Chimie Analytique à Prague pour son aide lors de la détermination du contenu en cations monovalents dans les cellules par spectroscopie d’absorption atomique. Je tiens aussi à remercier le Professeur Michel Aigle et les Dr. Axelle Bal-guerie et Marc Bonneu de l’Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires à Bor-deaux ainsi que les Dr. Zdena Pálková de Faculté de Sciences Naturelles de l’Université Charles et Lucie Kubínová de l’Institut de Physiologie à Prague pour la réalisation des observations microscopiques Enfin, tout particulièrement, je voudrai remercier ma famille et mes ami(e)s pour leurs encouragements et leur soutien constant tout au long de ces années.
7
Obsah
Préface 1 1. 1 1. 2 1. 2. 1 1. 3 1. 3. 1 1. 4 1. 4. 1 1. 4. 2
1. 4. 2. 1
Předmluva Současný stav problematiky Saccharomyces cerevisiae Transport alkalických kationtův kvasinkách Charakterizace transportních systémůalkalických kationtůvS. cerevisiaeBuněčná odpověďna osmotický stres Signální dráha HOG + + Na /H -antiportní systémy + + Bakteriální Na /H -antiportní systémy + + Na /H -antiportní systémy kvasinek + + Srovnání struktury a vlastností Na /H -antiportních systémůplasmatické membrány kvasinek + + Rostlinné Na /H -antiportní systémy + + Na /H -antiportní systémy živočichůCíl práce Les objectifs Materiál a metody Materiál Kultivační půdy Kmeny baktérií a kvasinek Vektory Metody Molekulárně-biologické metody Biochemické metody Fyziologické metody
1. 4. 3 1. 4. 4 2 2A 3 3. 1 3. 1. 1 3. 1. 2 3. 1. 3 3. 2 3. 2. 1 3. 2. 2 3. 2. 3
8
8 9
10 11 12
12 18 21 24 27 28
31 33 35
42 43
44 44 44 44 45 46 46 50 51
4 Přehled výsledkůa diskuze 4. 1 Funkční studium C-konce proteinu Nha1p z kvasinkyS. cerevisiae4. 1. 1 Lokalizace zkrácených verzí proteinu Nha1p v buňce 4. 1. 2 Vliv transkripčního faktoru Imp2p na expresi genuNHA14. 2 Izolace a charakterizace genůz dalších kvasinek 4. 2. 1C. albicans CAN14. 2. 2Z. rouxiiZrSOD2-224. 2. 3Z. rouxiiZrHOG14. 2. 4S. pombe sod2+ + 4. 2. 5 Charakterizace transportních vlastností Na /H -antiporterůz kvasinek 4. 2. 6 Konstrukce chimérního přenašeče Nha1p-sod2p a jeho exprese vS. cerevisiae4. 2. 7 Mutageneze genuZrSOD2-224. 2. 8 Studium lokalizace proteinůZrSod2-22p a sod2p exprimovaných vS. cerevisiae+ + 4. 3 Exprese živočišných genůkódujících Na /H -antiportní systémy vS. cerevisiae4. 3. 1 Klonování cDNA antiporterůNHE1-3 za promotorNHA14. 3. 2 Exprese NHE1 a NHE2 v kvasinceS. cerevisiae4. 3. 3 Studium lokalizace a funkce přenašečůNHE1 a NHE2 exprimovaných vS. cerevisiaePublikaceč. 1:Functional study of theSaccharomyces cerevisiaeNha1p C-terminus + + Publikaceč. 2: TheCandida albicansNa /H antiporter exports potassium and rubidium Publikaceč. 3:TheZygosaccharomyces rouxiistrain CBS732 contains only one copy of theHOG1and theSOD2genes Publikaceč. 4:difference in substrate specificity divides the yeast alkali- The + metal-cation/H antiporters in two subfamilies5 Závěr
9
54 54 59 63 64 64 65 65 66 68
71 73
7
7
80 80 83
8
8
8
5
8
9
9
9
0
1
92
6 7 8
Seznam použitých symbolůa zkratek Seznam literatury Résumé de la thèse
10
94 95
121
 Předmluva
Předkládaná dizertačrámci kombinovanéhoní práce byla vypracována v česko-francouzského postgraduálního studia „doctorat en co-tutelle“ mezi Univerzitou Karlovou v Praze a Univerzitou Louise Pastera ve Štrasburku a je založena zejména na následujících publikacích: Publikaceč. 1:O., Ramos, J., Potier, S., and Sychrová, H.: Functional Kinclová, study of theSaccharomyces cerevisiaeNha1p C-terminus.Mol. Microbiol.40, 656-668 (2001). Publikaceč. 2:O., Potier, S., and Sychrová, H.: The Kinclová, Candida albicans+ + Na /H antiporter transport potassium and rubidium.FEBS Lett.504, 11-15 (2001). Publikaceč. 3:O., Potier, S., and Sychrová, H.: The Kinclová, Zygosaccharomyces rouxiistrain CBS732 contains only one copy of theHOG1and SOD2genes.J. Biotechnol.88 (2) 151-158 (2001).
Publikaceč. 4: Kinclová, O., Potier, S., and Sychrová, H.: Two subfamilies of + yeast alkali-metal-cation/H antiporters.Microbiology UK, v tisku (2001). Výsledky obsažené v práci jsem získala na oddělení Membránového transportu Fyziologického ústavu Akademie vědČeské republiky a během tří šestiměčních stáží v Laboratoři mikrobiologie a genetiky ve Štrasburku ve Francii. Metody měření výstupu alkalických kationtů z buněk a stanovení obsahu těchto kationtůbu v ňkách jsem si osvojila v rámci pobytu v laboratoři Mikrobiologického ústavu E.T.S.I.A.M. Univerzity v CordoběŠpan ve ělsku. Zkušenosti v oblasti fluorescenční mikroskopie kvasinek jsem získala během pobytu v laboratoři Institutu biochemie a genetiky buněk v Bordeaux ve Francii.
11
Préface
La thèse du doctorat a été élaborée dans le cadre des études de doctorat combiné tchèque français, “doctorat en co-tutelle“ entre l’Université Charles à Pra-gue et l’Université Louis Pasteur à Strasbourg. La thèse est basée principalement sur les publications suivantes : Publication no. 1:Kinclová, O., Ramos, J., Potier, S., and Sychrová, H.: Functional study of theSaccharomyces cerevisiaeNha1p C-terminus.Mol. Microbiol.40, 656-668 (2001). Publication no. 2:Kinclová, O., Potier, S., and Sychrová, H.: TheCandida albicans+ + Na /H antiporter transport potassium and rubidium.FEBS Lett.504, 11-15 (2001). Publication no. 3:Kinclová, O., Potier, S., and Sychrová, H.: TheZygosaccharomy-ces rouxiiCBS732 contains only one copy of the strain HOG1andSOD2 genes.J. Biotechnol.88 (2) 151-158 (2001). Publication no. 4:O., Potier, S., and Sychrová, H.: Two subfamilies of Kinclová, + yeast alkali-metal-cation/H antiporters.Microbiology UK, sous presse (2001). Je suis également co-auteur d’un article dont les résultats ne sont pas rapportés dans ce manuscrit (Matejčková-Forejtová A., Kinclová O., Sychrová H.:FEMS Microbiol. Lett.176 (1) 257-62 (1999)). Le travail expérimental a été réalisé dans le laboratoire du Département du Transport Membranaire de l’Institut de Physiologie de l’Académie des Sciences de la République tchèque et pendant les trois séjours de six mois dans le Laboratoire de Microbiologie et Génétique de l’Institut Botanique à Strasbourg en France. J’ai appris les méthodes de détermination du contenu en cations monovalents dans les cellules au cours de mon séjour d’un mois dans le laboratoire de l’Institute de Microbiologie E. T. S. I. A. M. de l’Université à Córdoba en Espagne. Les expériences de microscopie par fluorescence des levures ont été réalisées lors de mon séjour de 2 semaines dans le laboratoire de l’Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires à Bordeaux en France.
12
1
1. 1
Současný stav problematiky
Saccharomyces cerevisiae
KvasinkaS. cerevisiae patří mezi nejlépe prostudované eukaryotní mikroorganismy. Buňky roduSaccharomyces mají elipsoidní až protáhlý tvar a rozmnožují se multilaterálním pučením (obr. 1. 1 A) (Šilhánková, 1983).  A B haploidy (n) a a konjugace α aα α a α zygota diploidy (2n) a příznivé nepříznivé podmínky podmínky α a askus (tetráda spor) Obr. 1.1(A) Buňky kvasinkyS. cerevisiaesv ve ětelném mikroskopu (Nomarski, zvětšeno 1000 x), (B) životní cyklus kvasinkyS. cerevisiae.
Na obr. 1. 1 B je zobrazen životní cyklus kvasinkyS. cerevisiae: Většina kmenůS. cerevisiae tvoří tzv. heterothalické kmeny, tj. kmeny pohlavně odlišené, jednotlivé párovací typy se označujíMATa aMATα. Splynutím dvou haploidních buněk opačného párovacího typu vzniká diploidní buňka zygota, která se může dále buď vegetativně rozmnožovat v diploidním stavu, nebo, za nepříznivých životních podmínek, v ní proběhne sporulace (meiotické dělení jádra) za vznikučtyřpohlavněodlišených spor a celá buňka se přemění ve vřecko (askus). V příznivých růstových podmínkách se spory mohou vegetativněvznikají klony haploidních rozmnožovat, buněk o určitém párovacím typu. U haploidních buněk opačného párovacího typu může dojít opět ke spájení za vzniku zygoty,čímž se celý cyklus uzavře (Šilhánková,
13
Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.