UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG ECOLE DOCTORALE VIE ET SANTE

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG ECOLE DOCTORALE VIE ET SANTE THESE pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Discipline : Sciences du vivant Spécialité : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie présentée et soutenue publiquement par Barbara FISCHER Le 26 Novembre 2004 Titre : ETUDE DE LA SIGNALISATION CELLULAIRE DE L'APOPTOSE INDUITE PAR DIFFERENTS TYPES DE RAYONNEMENTS IONISANTS DANS DES CELLULES LYMPHOBLASTOÏDES HUMAINES DIFFERANT PAR LEUR STATUT P53 Directeur de Thèse : Dr. P. BISCHOFF JURY Pr. R. HERBRECHT Président du Jury Dr. P. BISCHOFF Directeur de Thèse Pr. W. SAUERWEIN Rapporteur Externe Dr. G. LIZARD Rapporteur Externe Dr. J.P. LOEFFLER Rapporteur Interne Dr. I. FLORENTIN Examinateur

  • absorption des neutrons par la matière vivante

  • leucine-glutamate-histidine-aspartate

  • isoleucine-glutamate-thréonine-aspartate

  • science du vivant spécialité

  • mitogen activated protein

  • radiations ionisantes

  • aspartate-glutamate- valine- aspartate


Publié le : lundi 1 novembre 2004
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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
ECOLE DOCTORALE VIE ET SANTE
THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
DE STRASBOURG
Discipline : Sciences du vivant
Spécialité : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
présentée et soutenue publiquement par
Barbara FISCHER
Le 26 Novembre 2004
Titre :
ETUDE DE LA SIGNALISATION CELLULAIRE DE L’APOPTOSE
INDUITE PAR DIFFERENTS TYPES DE RAYONNEMENTS
IONISANTS DANS DES CELLULES LYMPHOBLASTOÏDES
HUMAINES DIFFERANT PAR LEUR STATUT P53
Directeur de Thèse : Dr. P. BISCHOFF
JURY
Pr. R. HERBRECHT Président du Jury
Dr. P. BISCHOFF Directeur de Thèse
Pr. W. SAUERWEIN Rapporteur Externe
Dr. G. LIZARD
Dr. J.P. LOEFFLER Rapporteur Interne
Dr. I. FLORENTIN ExaminateurAbréviations
LISTE DES ABREVIATIONS
AIF : Apoptosis Inducing Factor
amc : amino-méthyl-coumarine
ANT : Adenine Nucleotide Translocastor
Apaf-1 : Apoptotic Protease Activating Factor 1
ASPP : Apoptotic Stimulating Proteins of p53
ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated
BER : Base Excision Repair
CAD/ICAD : Caspase Activated DNase / Inhibitor of Caspase Activated DNase
CAPK : Ceramide Activated Protéine Kinase
CARD : Caspase Activation Recruitment Domain
Caspase : Cystéinyl Aspartic Acid-Protease
CDB : Cassures Double-Brin de l’ADN
CFSE : 5(et 6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
CMX-Ros : ChloroMéthyl-X-Rosamine
CSB : Cassures Simple-Brin de l’ADN
DD : Death Domain
DED : Death Effector Domain
DEVD : aspartate-glutamate- valine- aspartate
DFF : DNA Fragmentation factor
DISC : Death Inducing Signaling Complex
DNA-PK : Protéine Kinase Dépendante de l’ADN
DR4, DR5 : Death Receptor 4, Death Receptor 5 : (DR4=TRAILR1, DR5=TRAILR2)
∆ψm : Potentiel transmembranaire mitochondrial
EBR : Efficacité Biologique Relative
ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase
eV : électron Volt
FADD : Fas Associated Death DomainAbréviations
FasL : Fas Ligand
FITC : Fluorescein IsoThioCyanate
fmk : fluoromethylketone
GANIL : Grand Accélérateur National d’Ions Lourds de Caen
Gy : Gray
HRR : Homologous Recombination Repair
IAP : Inhibitor of Apoptosis
iASPP : inhibitor of Apoptotic Stimulating Proteins of p53
IETD : isoleucine-glutamate-thréonine-aspartate
IP : Iodure de Propidium
IR : Ionizing Radiation
JC-1 : 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide
LEHD : leucine-glutamate-histidine-aspartate
LMDS : Locally Multiply Damage Sites
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase
MMP : Mitochondrial Membrane Permeabilization
MMR : MisMatch Repair
MNNG : N-méthyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine
NER : Nucleotide Excision Repair
NHEJ : Non Homologous End-Joining
NIRS : National Institute of Radiological Sciences
OER : Oxygen Enhancement Ratio
p300/CBP : p300/Creb Binding Protein
PARP : Poly(ADP-Ribose) Polymérase
PE : Phycoerythrin
PERP : p53 apoptosis Effector Related to PMP-22
PIG : p53-Inducing-Genes
PTPC : Permeability Transition Pore Complex
Rb : protéine du rétinoblastome
ROS : Reactive Oxygen Species
RPA : Replication Protein AAbréviations
RTPCR : Reverse Transcription Polychain Reaction
SAPK/JNK : Stress-Activated Protein Kinase/c-Jun N-terminal Kinase
SMase : SphingoMyélinase
TNF : Tumor Necrosis Factor
TEL : Transfert d’Energie Linéique
TRAIL : Tumor necrosis factor (TNF)-Related Apoptosis-Inducing Ligand (=Apo-2L)
TRAILR : Récepteur de TRAIL
VDAC : Voltage Dependent Anion Channel
z-VAD-fmk : Benzoloxy-valine-alanine-aspartate-O-methyl-fluoromethylketoneTable des Matières
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION 1
Chapitre 1 : Les radiations ionisantes et leurs effets biologiques 6
1. Définitions 9
1.1. Les radiations ionisantes 9
1.2. Origine des radiations ionisantes 9
1.3. Les différents types de radiations ionisantes 10
1.3.1. Les radiations directement ionisantes 11
1.3.2. Les radiations indirectement ionisantes 13
2. Effets physiques des radiations ionisantes 15
2.1. Notion de dose absorbée 15
2.2. Absorption des photons (rayons X ou γ) par la matière vivante 15
2.3. Absorption des neutrons par la matière vivante 17
2.4. Absorption des ions lourds par la matière vivante 19
2.5. Notion de transfert d’énergie linéique 20
3. Effets physico-chimiques des radiations ionisantes 23
3.1. Action directe et indirecte des radiations 23
3.2. Influence du TEL sur les effets physico-chimiques des radiations 25
3.3. Effet oxygène 26
4. Effets biologiques des radiations ionisantes 29
4.1. Effets induits au niveau des constituants cellulaires par les radiations 29
ionisantes
4.1.1. Cibles cellulaires des radiations ionisantes 29
4.1.2. Importance du TEL dans les dommages induits par les radiations 34
4.2. Effets cellulaires des radiations ionisantes 36Table des Matières
4.2.1. Conséquences des lésions dues à l’irradiation 36
4.2.2. Effets cytotoxiques des radiations ionisantes 38
4.3. Effets tissulaires des radiations ionisantes 43
4.3.1. Effets déterministes et probabilistes 43
4.3.2. Facteurs influençant les effets tissulaires 45
5. Hadronthérapie : avantages et clinique 47
Chapitre 2 : L’apoptose radio-induite 51
1. Généralités sur l’apoptose 51
1.1. Définition 51
1.2. Rôles de l’apoptose 53
1.3. Description de l’apoptose 55
1.3.1. Caractéristiques morphologiques 55
1.3.2. Caractéristiques biochimiques 58
1.4. Les principaux effecteurs de l’apoptose 59
1.4.1. Les caspases 61
1.4.2. La famille BCL-2 68
2. Voies de signalisation induites par les radiations ionisantes 73
2.1. Mécanismes cellulaires activés par les dommages de l’ADN 73
2.1.1. Détection des dommages 73
2.1.2. Rôle de p53 dans la réponse aux radiations ionisantes 74
2.1.3. Réponses cellulaires indépendantes de p53 87
2.1.4. Les systèmes de réparation de l’ADN 88
2.2. Voies de signalisation de l’apoptose radio-induite 92
2.2.1. Voie mitochondriale 92
2.2.2. Voie des céramides 96
2.2.3. Voie des récepteurs de mort 98Table des Matières
MATERIELS ET METHODES 104
1. Lignées cellulaires 104
2. Irradiations 104
2.1. Irradiation par les rayons X 105
2.2. Irradiation par les neutrons rapides 105
2.3. Irradiation par les ions carbone 106
3. Traitement des cellules 108
3.1. Traitement par l’anticorps anti-Fas CH11 ou par FasL 108
3.2. Traitement des cellules à la méthyl β cyclodextrine 108
4. Cytométrie en flux 108
5. Analyse de l’apoptose 109
5.1. Mesure des particules hypodiploïdes 109
5.2. Externalisation des phosphatidylsérines 110
6. Mesure du potentiel transmembranaire mitochondrial ∆Ψm 111
6.1. Utilisation du JC-1 111
6.2. Utilisation de la chlorométhyl-X-rosamine 112
7. Mesure de l’activation des caspases 112
7.1. Mesure de l’activité enzymatique des caspases 112
7.2. Mesure de l’activation de la caspase-3 par cytométrie en flux 113
7.3. Inhibition des caspases 114
8. Quantification de la nécrose par mesure de l’activité lactate 114
déshydrogénase (LDH)
9. Extraction protéique et Western Blot 114
10. Tests de prolifération et de survie clonogénique 116
10.1. Test de prolifération UptiBlue 116
10.2. Survie clonogénique 116
10.3. Test CFSE 117
11. Etude de l’expression de Fas/FasL et de l’agrégation des récepteurs Fas 117
11.1. Analyse de l’expression de Fas et FasL par cytométrie en flux 117Table des Matières
11.2. Détection des agrégats de Fas et immunofluorescence 118
12. Mesure de l’activation de p53 par cytométrie en flux 118
13. Analyse de l’expression différentielle des gènes par tests d’hybridation
d’ADNc : technique de « cDNA expression arrays » 119
13.1. Extraction des ARN 119
13.2. Analyse de la qualité des ARN 121
13.3. « cDNA expression arrays » 121
13.3.1. Synthèse des sondes radioactives à partir de l’ARN total 121
13.3.2. Purification des sondes radioactives par chromatographie 122
sur colonne
13.3.3 Hybridation des sondes radioactives sur les membranes Atlas 122
Arrays
13.3.4 Révélation des membranes 123
13.3.5 Analyse des résultats avec le logiciel AtlasImage 1.01 123
14. Analyse statistique 124
PRESENTATION DES RESULTATS 125
ère1 partie : Etude de la signalisation cellulaire de l’apoptose induite par les
neutrons rapides dans des cellules lymphoblastoïdes humaines différant
par leur statut p53 127
Chapitre 1 : Rôle de p53 dans l’apoptose induite dans des 128
lignées lymphoblastoïdes humaines par des neutrons rapides
1. Introduction 129Table des Matières
2. Résultats 130
2.1. Expression de p53 après irradiation 130
2.2. Induction de l’apoptose par les neutrons rapides 130
2.3. Activation des caspases 132
2.4. Radiosensibilité vis-à-vis des neutrons rapides 135
3. Discussion 138
Chapitre 2 : Signalisation de l’apoptose induite dans des lignées 143
lymphoblastoïdes par les neutrons rapides
1. Introduction 144
2. Résultats 146
2.1. Externalisation des phosphatidylsérines et inhibition des caspases 146
2.2. Activités des caspases en fonction du statut p53 148
2.3. Analyse de l’activation des caspases par western blot 150
2.4. L’apoptose dépendante de p53 est caractérisée par des dommages 154
mitochondriaux causés par les caspases
2.5. L’apoptose p53-dépendante fait intervenir BID 156
2.6. Identification de la caspase responsable du clivage de BID 157
2.7. Libération du cytochrome c de la mitochondrie lors de l’apoptose p53- 158
dépendante 158
3. Discussion 160
3.1. Nature des caspases activées après irradiation par les neutrons rapides 160
3.2. Identification de la caspase initiatrice responsable de l’apoptose induite
par les neutrons rapides 161
3.3. p53 et la voie d’amplification mitochondriale 164Table des Matières
Chapitre 3 : Rôle du récepteur Fas dans l’apoptose induite dans des lignées 167
lymphoblastoïdes humaines par des neutrons rapides
1. Introduction 168
2. Résultats 170
2.1. Activation de la caspase-8 par les neutrons rapides 170
2.2. Les cellules TK6 et NH32 sont sensibles à l’apoptose induite par Fas 171
2.3. Etude de l’expression de Fas après irradiation par les neutrons rapides 174
2.4. Influence des neutrons rapides sur l’expression de FasL 179
2.5. Les neutrons rapides n’induisent pas d’agrégation des récepteurs Fas 182
3. Discussion 188
Chapitre 4 : Identification de gènes impliqués dans l’apoptose induite par 194
des neutrons rapides dans des lignées lymphoblastoïdes humaines
1. Introduction 195
2. Résultats 197
2.1. Mesure de l’apoptose 197
2.2. Rappel de la technique de « cDNA expression arrays » 198
2.3. Vérification de la qualité des ARN extraits des cellules 200
2.4. Analyse de l’expression de gènes après irradiation par les neutrons 201
rapides
3. Discussion 204

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