UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Sommaire UNIVERSITE LOUIS PASTEUR-STRASBOURG I SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE Présentée par Muller Arnaud en vue d'obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg Etude de la morphine endogène dans le système nerveux de mammifères Soutenue publiquement le 17 octobre 2008 Membres du jury Directeur de Thèse : Dr Yannick GOUMON Rapporteur Interne : Pr Pierrick POISBEAU Rapporteur Externe : Pr Martine DAOUST Rapporteur Externe : Dr Jean-Christophe DELOULME Examinateur : Dr Dominique AUNIS

  • effets sur le système gastro

  • dérivés en milieu hospitalier

  • soif de nouvelles techniques

  • structure du récepteur µ

  • sciences de la vie et de la sante

  • rapporteur externe

  • catabolisme de la morphine


Publié le : mercredi 1 octobre 2008
Lecture(s) : 102
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
Nombre de pages : 195
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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR-STRASBOURG I
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
THESE
Présentée par

Muller Arnaud

en vue d’obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur de Strasbourg



Etude de la morphine endogène dans le système
nerveux de mammifères




Soutenue publiquement le 17 octobre 2008


Membres du jury

Directeur de Thèse : Dr Yannick GOUMON
Rapporteur Interne : Pr Pierrick POISBEAU
Rapporteur Externe : Pr Martine DAOUST
Rapporteur Externe : Dr Jean-Christophe DELOULME
Examinateur : Dr Dominique AUNIS
Sommaire Sommaire Je tiens à remercier,


Le Dr. Dominique Aunis pour m’avoir accueilli au sein de son unité.

Le Dr. Yannick Goumon pour son m’avoir transmis son amour des Sciences, en espérant
avoir un jour sa persévérance. Merci aussi pour m’avoir fait confiance et pour m’avoir laissé
libre dans mes recherches et dans ma soif de nouvelles techniques. Et surtout merci pour tous
les bons moments qu’on a passé ensemble, vivement le prochain congrès de la FENS.....

Le Dr. Marie-Hélène Metz-Boutigue pour le temps et la confiance qu’elle m’a accordé, pour
son aide précieuse dans l’obtention de me DEA. En espérant vous recroisez bientôt dans un
sommet pyrénéen.

Le Pr. Poisbeau, le Pr. Daoust et le Dr. Deloulme pour avoir évalué ce travail.

L’ensemble du personnel de l’Unité 575 pour son soutien et sa bonne humeur, et plus
particulièrement Alexis et Elise pour leur aide précieuse et pour m’avoir supporté si
longtemps, Guy, Martine et Monique pour avoir transmis leur savoir et m’avoir presque
accueilli dans leur équipe.

Tous mes amis du centre de neurochimie pour les bons moments passés durant ces 4 ans, plus
particulièrement Marc, Morgane pour nos virés nocturnes, Peiman pour ta passion de la
littérature et ce voyage que je n’oublierai jamais.

Tous mes amis. La liste est trop longue pour vous remercier tous. Meinau forever, on se
revoit tous au prochain match du racing…

Wendela. I meet you the week before my thesis in Chamonix, hope to climb lot of other summit
with you.

Ma famille, plus particulièrement mes parents qui ont toujours été là pour moi et qui m’ont
soutenu dans mes choix, mon frère pour son expérience de la morphine et des drogues sans
produit, ma mamie, ma mamama et mon papy en espérant qu’il se rétablisse au plus vite.

Sommaire Sommaire
Sommaire


Sommaire ............................................................................................................. 5

Abréviations ................................................................. Erreur ! Signet non défini.

Liste des figures ................................................................................................. 13

Liste des tableaux .............................................................................................. 16

Rappels bibliographiques ................................................................................. 18
1) La morphine: historique de son utilisation ....................................................................... 20
2) L’utilisation de la morphine et de ses dérivés en milieu hospitalier ................................ 22
3) Le catabolisme de la morphine et ses métabolites ........................................................... 22
3.1 Le catabolisme de la morphine. .................................................................................. 22
3.2 Les métabolites dérivés du catabolisme de la morphine ............................................ 24
4) Les transporteurs de la morphine ..................................................................................... 25
4.1 Les ABC transporteurs (ATP Binding Cassette) ........................................................ 25
4.2 Les Organic Anion Transporter Polypeptide (OATPs) .............................................. 28
5) Les protéines liant la morphine ........................................................................................ 28
6) Les récepteurs à la morphine ........................................................................................... 29
6.1 Découverte des récepteurs opioïdes. .......................................................................... 29
6.2 Structure du récepteur µ et voie de transduction du signal. ....................................... 30
6.3 Les différents variants de récepteur µ. ...................................................................... 31
6.4 Distribution des récepteurs µ ..................................................................................... 33
6.5 Existe-t-il un récepteur spécifique à la M6G ? ........................................................... 34
7) Les effets biologiques de la morphine et de la M6G ....................................................... 35
7.1 Effets analgésiques de la morphine ............................................................................ 35
7.2 Effets sur le système respiratoire ............................................................................... 38
7.3 Effets sur le système gastro-intestinal ........................................................................ 38
Sommaire 7.4 Effets sur le système neuroendocrine ......................................................................... 39
7.5 Effets sur le système immunitaire .............................................................................. 39
7.6 Les effets biologiques de la M6G 40
8) Découverte de la morphine endogène chez les mammifères ........................................... 40
8.1 Les peptides opioïdes endogènes. 41
8.2 Les premières évidences de l’existence de morphine endogène ................................ 44
8.3 La voie de synthèse de la morphine endogène ........................................................... 45
8.4 La localisation tissulaire et cellulaire de la morphine endogène 48
9) Quel est le rôle de cette morphine endogène ? ................................................................ 51
9.1 Expression de la morphine endogène lors d’états de stress ....................................... 51
9.2 Le rôle de la morphine endogène au sein du SNC ..................................................... 52

Matériels et Méthodes ....................................................................................... 64
1) Animaux utilisés pour les expériences ............................................................................. 64
2) Isolement des protéines solubles de la matrice intragranulaire des cellules chromaffines
de bœuf ................................................................................................................................. 64
3) Préparation d’extraits déprotéinisés des aires cérébrales ................................................. 65
4) Culture de cellules chromaffines ..................................................................................... 65
5) Stimulation de la sécrétion des cellules chromaffines ..................................................... 66
6) HPLC de phase inverse .................................................................................................... 66
7) Electrophorèse monodimensionnelle ............................................................................... 67
8) Electrotransfert sur membrane de PVDF ......................................................................... 68
9) Technique de Western blot .............................................................................................. 68
10) Chromatographie d’affinité ............................................................................................ 69
11) Co-immunoprécipitation ................................................................................................ 70
12) Digestion trypsique ........................................................................................................ 70
13) Coloration des protéines au nitrate d’argent .................................................................. 71
14) Spectrométrie de masse .................................................................................................. 71
15) Synthèse de novo de M6G ............................................................................................. 72
16) Déglycosylation de l’UGT2B ........................................................................................ 72
17) Extraction du matériel non protéique ............................................................................. 72
18) Dosage protéique ........................................................................................................... 73
19) Culture primaire de neurones et d’astrocytes ................................................................. 73
19.1 Culture primaire de neurones d’hippocampe de souris ............................................ 73
Sommaire 19.2 Culture primaire d’astrocytes de souris. ................................................................... 74
20) Culture de lignée cellulaire ............................................................................................ 75
20.1 La lignée cellulaire SH-SY5Y .................................................................................. 75
20.2 La lignée cellulaire U373-MG ................................................................................. 75
20.3 Condition de culture ................................................................................................. 75
21) Stimulation de la sécrétion des cellules SH-SY5Y ........................................................ 76
22) Extraction du matériel intracellulaire ............................................................................. 76
23) Immunohistochimie ....................................................................................................... 77
23.1 Préparation des tissus ............................................................................................... 77
23.2 Immunomarquage ..................................................................................................... 77
24) Immunocytochimie ........................................................................................................ 79
24.1 Préparation des cellules ............................................................................................ 79
24.2 Immunomarquage 80
25) Spécificité du marquage de la morphine ........................................................................ 81
26) Extraction des ARN totaux 82
27) RT-PCR .......................................................................................................................... 82
28) Electrophorèse des produits de RT-PCR ....................................................................... 82
29) Electrophysiologie ......................................................................................................... 83
30) Test ELISA ................................................................................................................... 84

Résultats ............................................................................................................. 88

Publication I: Identification de la morphine-6-glucuronide au sein des
granules de sécrétion des cellules chromaffines. ............................................ 90
Etude de la localisation subcellulaire des composés apparentés à la morphine par
microscopie laser confocale ................................................................................................. 94
Caractérisation biochimique 95
Caractérisation d’une protéine intragranulaire liant la M6G ............................................... 97
Mise en évidence d’un enzyme synthétisant la M6G .......................................................... 98

Publication II : Etude de l’implication de la morphine endogène dans les
cellules SH-SY5Y et dans le système nerveux central de souris. ................ 102
Localisation subcellulaire de la morphine dans les cellules SH-SY5Y ............................. 105
Caractérisation biochimique des alcaloïdes présents dans les cellules SH-SY5Y ............. 106
Sommaire Sécrétion de morphine par les cellules SH-SY5Y ............................................................. 108
Localisation de morphine dans le SNC de souris ............................................................... 111

Résultats non publiés ...................................................................................... 114
Identification des cellules contenant de la morphine dans la zone sous-granulaire du gyrus
denté de souris adulte ......................................................................................................... 117
Mise en évidence d’une immunoréactivité à la morphine dans les astrocytes et les neurones
en culture primaire: hypothèse d’une capture astrocytaire ................................................. 122
Présence de morphine endogène lors du développement cérébral ..................................... 125

Discussion ......................................................................................................... 130
1) Présence de morphine endogène au sein des cellules chromaffines .............................. 130
2) Présence de la morphine endogène dans le système nerveux central ............................ 132
2.1) La morphine endogène est-elle un neurotransmetteur ? ......................................... 132
2.2) Présence de morphine endogène dans le cervelet de souris .................................... 139
2.3) Présence de modans l’hippocampe de souris .............................. 142

Conclusion ........................................................................................................ 146

Bibliographie .................................................................................................... 150

Liste des publications ...................................................................................... 174

Liste des communications ............................................................................... 175

Annexe: Publication III (revue) ..................................................................... 178













Sommaire
Sommaire Abbreviations


ABC : ATP Binding Cassette
ATCC : American Type Cell Collection
ARNm : Acide RiboNucléique messager
BSA : Albumine Sérique Bovine
AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique
ATP : Adénosine TriPhosphate
BHE : Barrière HématoEncéphalique
GABA : GAmma Butyric Acid
CA: Corne d’Ammon
CGA : ChromoGranine A
CGB : ChromoGranine B
Cod : Codéine
CTZ : Chemoreceptor Trigger Zone
Da : Dalton
DAMGO : D-Ala2,N-Me-phe4,Gly5-OL-enkephalin acetate
DAT : DopAmine Transporter
DG: Gyrus Denté
DOPAL : 4-hydroxyphénylacétaldhéhyde
DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium
EC: Cortex Entorhinal
EDTA : Ethylene-Diamine-TetraAcetic Acid
ELISA : Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay
GABA : GAmma Butiric Acid
GAD : Glutamic Acid Decarboxylase
GAPDH : GlycérAldéhyde-3-Phosphate DéHydrogénase
GFAP : Glial Fibrillary Acidic Protein
GMPc : Guanosine Mono Phosphate cyclique
GTP γS : Guanosine Tri-Phosphate gamma S
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
Abréviations 10

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