Université Louis Pasteur Strasbourg I

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis Pasteur Strasbourg I THÈSE présentée à la FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Domaine : Biologie Moléculaire Végétale par Esther GERBER Localisation cellulaire de protéines fluorescentes isoprénylables dans des cellules de tabac BY-2 Soutenue le 22 Septembre 2005 devant la Commission d'Examen : Thomas J. BACH Directeur de thèse Université Louis Pasteur, Strasbourg Nathalie GIGLIOLI-GUIVARC'H Examinateur Université de Tours, Tours Anne-Lise HAENNI Rapporteur externe Institut Jacques Monod, Paris Francis KARST Rapporteur interne Institut National de la Recherche Agronomique, Colmar Michel ROHMER Examinateur Université Louis Pasteur, Strasbourg Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE Rapporteur externe Institut des Sciences du Végétal, Gif-sur-Yvette

  • modifications co-traductionnelles

  • réactions post-isoprénylation

  • super-famille des protéines ras

  • voies de biosynthèse

  • localisation cellulaire de protéines fluorescentes

  • modification post-traductionnelle des protéines par isoprénylation


Publié le : jeudi 1 septembre 2005
Lecture(s) : 160
Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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Université Louis Pasteur
Strasbourg I
THÈSE
présentée à la
FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
Domaine : Biologie Moléculaire Végétale
par
Esther GERBER
Localisation cellulaire de protéines fluorescentes
isoprénylables dans des cellules de tabac BY-2
Soutenue le 22 Septembre 2005 devant la Commission d’Examen :
Thomas J. BACH Directeur de thèse
Université Louis Pasteur, Strasbourg
Nathalie GIGLIOLI-GUIVARC’H Examinateur
Université de Tours, Tours
Anne-Lise HAENNI Rapporteur externe
Institut Jacques Monod, Paris
Francis KARST Rapporteur interne
Institut National de la Recherche Agronomique, Colmar
Michel ROHMER Examinateur
Université Louis Pasteur, Strasbourg
Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE Rapporteur externe
Institut des Sciences du Végétal, Gif-sur-YvetteA ma MamanJe tiens à remercier B. Fritig et P. Benvéniste pour m’avoir accueillie au sein du département
Métabolisme et Fonction des Isoprénoïdes chez les Végétaux de l’Institut de Biologie
Moléculaire des Plantes. Je remercie aussi T.J. Bach d’avoir été le Directeur de cette thèse.
Je suis particulièrement reconnaissante à M.-A. Hartmann, A. Hemmerlin, A. Hoeft, E.
Guilley, S. Darnet et L. Wentzinger pour leur aide, leurs conseils et leur soutien précieux.
Merci à l’ensemble des collègues que j’ai eu la chance de côtoyer durant ces années.
Je remercie mes amis et ma famille pour leur présence à mes côtés.
Je tiens à remercier les membres du jury N. Giglioli-Guivarc’h, A.-L. Haenni, F. Karst,
M. Rohmer et B. Satiat-Jeunemaitre pour avoir accepté d’évaluer ce travail.


Plan de la thèseIntroduction 1
1. Les modifications co-traductionnelles ou post-traductionnelles des protéines par les
lipides de nature non isoprénique 2
1.1 La glypiation 2
1.2 La N-myristoylation 4
1.3 La S-palmitoylation 8
2. Modification post-traductionnelle des protéines par isoprénylation 11
2.1 Généralités 11
2.2 Le farnésyldiphosphate (FPP) et le géranylgéranyldiphosphate (GGPP) 12
a. Les isoprénoïdes 13
b. Les voies de biosynthèse 15
- La voie classique du MVA 15
Biosynthèse de l’IPP et du DMAPP ( Fig. I .10 ) :
16
Biosynthèse des isoprénoïdes : 17
- La voie du MEP 18
Biosynthèse de l’IPP et du DMAPP ( Fig. I .11) :
18
Une nouvelle cible pour le développement d’herbicides, d’antibiotiques et de
drogues permettant de lutter contre la malaria : 21
- Compartimentation cellulaire et interaction des deux voies chez les plantes
supérieures 22
2.3 Les protéines acceptrices de groupes isoprényles 23
a. Généralités 23
b. Les protéines animales modifiées 24
- La super-famille des protéines Ras 25
- La famille des protéines Ras
26
c. Les protéines végétales isoprénylées 28
2.4 Les protéines isoprényl transférases 31
a. Généralités 31
b. Les protéines farnésyl transférases
32
c. Les protéines géranylgéranyl transférases-I 33
d. Mécanisme catalytique des GGTases-I et FTases animales
34
e. Les protéines Rab-géranylgéranyl transférases 36
2.5 Après l’isoprénylation… 37
a. L’endoprotéolyse 37
b. La carboxyl méthylation 39
c. Localisation intracellulaire et réactions post-isoprénylation 40
3. Problématique de la thèse 40Chapitre I
Construction d’un outil permettant la visualisation in vivo de la
distribution de protéines isoprénylables 42
1. Choix de l’outil de travail 43
1.1 Un outil visuel : la protéine rapporteur « GFP »
43
a. Généralités 43
b. Caractéristiques de la GFP utilisée dans ce travail
44
c. Localisation intracellulaire de la GFP 44
1.2 Une protéine visuelle rendue isoprénylable 47
a. Les critères de sélection 47
b. Les calmodulines 47
- Généralités 47
- Structure, classification, expression
49
- Localisation intracellulaire des CaMs végétales 50
c. La calmoduline 61 de riz, OsCaM61 52
- Généralités 52
- Analyse informatique de la séquence protéique de OsCaM61 52
Analyse de la structure primaire de OsCaM61 : 53
Prédiction « in silico » de la distribution intracellulaire de la protéine
OsCaM61 : 55
- Localisation in vivo de la protéine OsCaM61 57
1.3 Matériel biologique choisi, les cellules végétales TBY-2 57
a. Propriétés des cellules TBY-2 57
b. Mise en évidence de l’isoprénylation des protéines dans les cellules TBY-2 61
2. Première étape : construction des protéines chimères isoprénylables à partir de
OsCaM61 64
2.1 Choix de la partie peptidique C-terminale de OsCaM61 à fusionner à la GFP 64
2.2 Clonage de l’extrémité C-terminale de OsCaM61 et création d’une protéine de
fusion GFP géranylgéranylable 65
2.3 Création d’une protéine GFP farnésylable 66
2.4 Création de protéines GFP contrôles non isoprénylables 68
2.5 Construction d’une protéine GFP modifiable par une Rab-GGTase 69
2.6 Analyse bioinformatique des séquences des protéines GFP, GFP-DBCaM-
CVIL, GFP-DBCaM-CVIM, GFP-DBCaM-CCG, GFP-DBCaM-SVIL et GFP-
DBCaM-SVIM 69
3. Expression transitoire des protéines de fusion GFP créées
71
3.1 Transformation par la technique de bombardement 71
3.2 Optimisation de la technique dans le cas des cellules TBY-2 72
a. Paramètres physiques 72 b. Paramètres biologiques 75
3.3 Expression transitoire des protéines GFP isoprénylables 76
a. Localisation intracellulaire des protéines isoprénylables GFP-DBCaM-CVIL,
GFP-DBCaM-CVIM et GFP-DBCaM-CCG dans les cellules TBY-2
77
- Observations sous la loupe binoculaire à fluorescence 77
- Observations au microscope à fluorescence 77
- Observations au microscope confocal 77
b. Localisation intracellulaire des protéines isoprénylables GFP-DBCaM-CVIL,
GFP-DBCaM-CVIM dans des cellules épidermiques de poireau ou d’oignon 80
c. Localisation intracellulaire des protéines non isoprénylables GFP-DBCaM-
SVIL et GFP-DBCaM-SVIM 82
d. Transformation stable des TBY-2 par bombardement 83
3.4 Discussion des résultats 84
4. Expression stable des protéines d’intérêt 86
4.1 Principes et avantages de la transformation stable des cellules avec le vecteur
pTA7001 86
4.2 Clonage des différentes constructions dans le vecteur pTA7001 et obtention de
transformants stables TBY-2 88
4.3 Localisation intracellulaire des protéines GFP, GFP-DBCaM-SVIL/M et GFP-
DBCaM-CVIL/M_____________________________________________________________91
4.4 Cinétique d’expression in vivo des protéines de fusion GFP isoprénylables 98
5. Localisation à la membrane plasmique des protéines GFP-DBCaM-CVIL et
GFP-DBCaM-CVIM 102
5.1 Traitement des cellules transgéniques avec un détergent 102
5.2 Le marqueur FM4-64 104
5.3 Expérience de colocalisation des protéines GFP isoprénylables avec le FM4-64
106
6. Suivi de la localisation in vivo des protéines GFP isoprénylables au cours du
cycle cellulaire
111
6.1 Simple synchronisation du cycle cellulaire 111
6.2 Etudes spatio-temporelles de la distribution intracellulaire des protéines GFP
au cours du cycle cellulaire 111
6.3 La cytocinèse et la formation de la plaque cellulaire chez les plantes supérieures 122
6.4 Traitement des transformants stables à la cafféine 124
7. Un outil-test
127
8. GFP-DBCaM-CVIL et GFP-DBCaM-CVIM, des protéines isoprénylées ? 131
Chapitre II
Utilisation de l’outil biologique 138Partie 1 : Transport intracellulaire des protéines GFP isoprénylables 139
1. Introduction 140
1.1 Trafic intracellulaire de protéines animales isoprénylées vers la membrane
plasmique 140
a. Protéines Ras 140
b. Protéines G (Michaelson et al., 2002) 142
1.2 Stratégie mise en place pour l’étude du transport intracellulaire d’une protéine
végétale isoprénylable vers la membrane plasmique
144

2. Les microtubules et le trafic intracellulaire des protéines de fusion GFP isoprénylables 145
2.1 Le taxol 146
a. Traitement des cellules au taxol 146
b. Distribution intracellulaire des différentes protéines GFP dans des cellules
traitées au taxol 148
2.2 L’oryzaline 149
a. Conditions de traitement 149
b. Effets de l’oryzaline sur la localisation des protéines d’intérêt 150
2.3 Conclusion 151
3. Le système endomembranaire et les protéines isoprénylées 151
3.1 Introduction 151
3.2 Système endomembranaire et protéines Rab 153
3.3 Hypothèse d’un transport via une voie exocytique 154
4. Utilisation de la bréfeldine A 156
4.1 Généralités 156
4.2 Conditions de traitement des cellules TBY-2 à la BFA 158
4.3 Observation des effets de la bréfeldine A sur le transport intracellulaire des
protéines d’intérêt dans les cellules TBY-2 160
4.4 Hypothèse d’une révélation de « compartiments BFA »
164
4.5 Hypothèse d’une révélation de « compartiments hybrides RE-Golgi » 165
4.6 Observation des cellules en fin de cytocinèse 166
5. Implication des filaments d’actine dans le trafic intracellulaire des protéines GFP
d’intérêt ? Utilisation de la cytochalasine D 170
5.1 Conditions de traitement des transformants stables 170
5.2 Localisation intracellulaire des protéines GFP d’intérêt dans les cellules TBY-2
traitées à la cytochalasine D 171
6. Conclusion 173
Partie 2 : Origine des substrats isopréniques utilisés pour modifier une
protéine GFP isoprénylable
177
1. Introduction 178
2. Construction d’une nouvelle GFP farnésylable à partir de AtRop6 180
2.1 Les protéines Rops, une sous-famille propre aux plantes 180
2.2 Choix de la partie C-terminale à fusionner à la GFP 183 2.3 Isolement de AtRop6, construction de protéines de fusion GFP et expression
transitoire dans les cellules TBY-2 185
2.4 Construction de la protéine de fusion GFP-AtRop6 et expression transitoire
dans les cellules TBY-2 188
2.5 Expression stable des protéines GFP-AtRop6-CSIM et GFP-AtRop6-C/S dans
les cellules TBY-2 190
® 2.6 Expériences de colocalisation de la protéine GFP-AtRop6-CSIM avec le FM 4-64 195
2.7 Conclusion 197
3. Etudes métaboliques : traitement des transformants stables par différents inhibiteurs
des voies de biosynthèse 197
3.1 Introduction 197
3.2 La mévinoline 197
a. Propriétés pharmacologiques des statines 198
b. Les statines sont des inhibiteurs de l’HMGR 200
c. Conditions de traitement des cellules TBY-2 avec la mévinoline 200
d. Effets de la MV sur la localisation intracellulaire des protéines
GFP-DBCaM-C/S, GFP-AtRop6-C/S et GFP
202
e. Effets de la MV sur la distribution intracellulaire des protéines
GFP-DBCaM-CVIM, GFP-AtRop6-CSIM et GFP-DBCaM-CVIL 202
f. Discussion des résultats 204
3.3 La fosmidomycine 205
a. Données bibliographiques 205
b. Choix des conditions de traitement des cellules avec la FOS 206
c. Effets de la FOS sur la localisation cellulaire des protéines de fusion GFP
206
d. Discussion des résultats 209
3.4 La kétoclomazone 211
a. Données bibliographiques 211
b. Conditions de traitement des cellules par la Kéto 213
c. Effets de la Kéto sur la localisation intracellulaire de la protéine GFP
géranylgéranylable 213
d. Discussion des résultats 217
3.5 Inhibition des deux voies par la FOS et la MV 218
a. Conditions de traitement 218
b. Effets du double traitement FOS/MV sur la distribution intracellulaire des
protéines GFP farnésylables 218
c. Effets du double traitement FOS/MV sur la distribution cellulaire de la
protéine GFP géranylgéranylable 221
3.6 Inhibition des deux voies par la Kéto et la MV 226
3.7 Conclusions sur l’inhibition des deux voies de biosynthèse des isoprénoïdes 228
4. Inhibition des deux voies de biosynthèse et réversion par un intermédiaire
biosynthétique isoprénique 230
4.1 Effets de l’addition de mévalonate sur des cellules traitées par la FOS et par la
MV 230
a. Le mévalonate 230
b. Choix de la concentration en MVA à utiliser et conditions de traitement 231
c. Effets du MVA sur la localisation in vivo de la protéine GFP
géranylgéranylable 233
d. Discussion des résultats 234
4.2 Essais de complémentation de l’inhibition FOS/MV et FOS/Kéto par des isoprénols 235
a. Existence d’une voie de recyclage pour le farnésol et le géranylgéraniol 235
b. Incorporation du farnésol et du géranylgéraniol dans les protéines 236
c. Les isoprénols lèvent l’effet inhibiteur des statines chez les animaux 238d. Conditions de traitement des transformants stables 238
e. Réversion de l’inhibition FOS/MV par les trois isoprénols (géraniol, farnésol
et géranylgéraniol) 239
f. Variation de la concentration en isoprénols
242
g. Réversion de l’inhibition Kéto/MV par les trois isoprénols
244
h. Discussion des résultats 247
i. Réversion de l’inhibition MV ou FOS par les isoprénols 249
5. Conclusion générale
253
Conclusions et perspectives 256
Matériel et Méthodes 261
Partie 1 : LE MATERIEL 262
1. Le matériel vivant 262
1.1 Le matériel végétal : conditions de culture 262
a. Les cellules de tabac 262
b. Le tissu épidermique de poireau et d’oignon 262
c. Les plantules de riz : conditions de croissance 263
d. Les cellules de ronce 264
1.2 Le matériel bactérien : conditions de culture 264
a. Les bactéries de type XL1-blue 264
b. Les agrobactéries LBA 4404 264
2. Les antibiotiques 266
2.1 Milieux de culture de plante 266
2.2 Milieux de culture pour bactéries 267
3. Le matériel génétique 268
® 3.1 Vecteur de clonage : pGEM -T 268
3.2 Vecteur de sous clonage et d’expression transitoire : pGFP-MRC 269
3.3 Vecteur de sous clonage et d’expression stable : pTA 7001 269
3.4 Les oligonucléotides 271
3.5 Banque d’ADNc d’Arabidopsis thaliana 271
4. Les outils moléculaires 271
5. Le matériel chimique 272
5.1 Composé radioactif 272
5.2 La dexaméthasone 272
5.3 Les inhibiteurs des voies de biosynthèse des isoprénoïdes 273
5.4 Les inhibiteurs d’isoprényl transférases 276
5.5 Le mévalonate et les isoprénols 278
5.6 Les autres inhibiteurs 280
5.7 Les autres produits 282

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