UNIVERSITÉ STRASBOURG I LOUIS PASTEUR

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
1 UNIVERSITÉ STRASBOURG I – LOUIS PASTEUR ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ Doctorat Sciences Médicales Spécialité : Biologie Médicale Arnaud AGIN DOSAGE DES ANALOGUES DE L'INSULINE À L'AIDE DE DEUX IMMUNODOSAGES DE L'INSULINE HUMAINE : Évaluation analytique et application à l'étude de la biotransformation de la glargine Thèse dirigée par Rémy Sapin Soutenue le 14 décembre 2006 Jury : Rapporteur interne : Pr Laurence KESSLER, PU-PH, Strasbourg Rapporteur externe : Pr Marc KLEIN, PU-PH, Nancy Rapporteur externe : Dr François ROUX, MCU-PH, Marseille Examinateur : Pr Nathalie JEANDIDIER, PU-PH, Strasbourg Examinateur : Dr Didier CHEVENNE, Attaché des Hôpitaux, Paris

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Publié le : vendredi 1 décembre 2006
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Source : scd-theses.u-strasbg.fr
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UNIVERSITÉ STRASBOURG I – LOUIS PASTEUR
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ Doctorat Sciences Médicales Spécialité : Biologie Médicale Arnaud AGIN DOSAGE DES ANALOGUES DE L’INSULINE À L’AIDE DE DEUX IMMUNODOSAGES DE L’INSULINE HUMAINE : Évaluation analytique et application à l’étude de la biotransformation de la glargine Thèse dirigée par Rémy Sapin Soutenue le 14 décembre 2006 Jury : Rapporteur interne :Pr Laurence KESSLER, PU-PH, Strasbourg Rapporteur externe :Pr Marc KLEIN, PU-PH, Nancy Rapporteur externe :Dr François ROUX, MCU-PH, Marseille Examinateur :Pr Nathalie JEANDIDIER, PU-PH, Strasbourg Examinateur :Dr Didier CHEVENNE, Attaché des Hôpitaux, Paris
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Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Rémy Sapin pour avoir accepté d’encadrer ma thèse, m’avoir guidé dans la découverte de l’immunoanalyse et m’avoir transmis une partie de ses compétences. Un grandMERCI pour sa disponibilité, ses nombreux conseils et la liberté qu’il m’a laissé pour réaliser ce travail. Mercià Mme Nathalie Jeandidier pour sa disponibilité, ses conseils, pour avoir facilité mon travail et pour avoir engagé une discussion avec les laboratoires qui commercialisent les analogues. Merci aux biologistes du laboratoire, Mme Christine Demangeat et Françoise Gasser, pour leur soutien et leurs conseils. Mercià M. Daniel Grucker pour m’avoir accueilli au sein de son équipe et pour m’avoir donné l’opportunité de poursuivre ma carrière dans son laboratoire. Merciaux membres du jury, Mme Laurence Kessler, M. Marc Klein, M. François Roux, Mme Nathalie Jeandidier et M. Didier Chevenne, pour avoir lu attentivement le manuscrit et y avoir apporté des corrections. Mercil’ensemble du personnel du laboratoire d’Explorations Fonctionnelles par les à Isotopes des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, en particuliermerciaux techniciennes et aux secrétaires pour leur accueil et leur aide. D’une façon plus générale,mercià l’ensemble des enseignants, des chercheurs et du personnel de l’Institut de Physique Biologique. Merci à Françoise Gasser, à Christine Demangeat, à Margot Sapin et à Béatrice Heurtault pour leur relecture et leurs corrections. Enfin, je me réjouis d’avoir la chance de continuer mon travail au sein de cette même équipe. Une pensée pour toute ma famille.
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LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 7INTRODUCTION.................................................................................................................... 8PREMIERE PARTIE ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................... 9CHAPITRE1 :GENERALITES SUR LINSULINE.................................................................................................... 101. Historique ................................................................................................................................................ 102. Structure .................................................................................................................................................. 133. Pancréas .................................................................................................................................................. 154. Biosynthèse .............................................................................................................................................. 164.1. Synthèse de l’insuline dans la celluleȕ............................................................................................................. 164.2. Enzymes participant à la synthèse de l’insuline................................................................................................. 195. Sécrétion .................................................................................................................................................. 216. Clairance et dégradation......................................................................................................................... 247. Le récepteur de l’insuline ........................................................................................................................ 278. Effets biologiques et physiologiques........................................................................................................ 29CHAPITRE2 :INSULINOTHERAPIE..................................................................................................................... 311. Place de l’insuline dans le traitement du diabète.................................................................................... 311.1. Généralités sur le diabète................................................................................................................................... 311.2. Place de l’insuline dans le traitement du diabète de type 1................................................................................ 331.3. Place de l’insuline dans le traitement du diabète de type 2................................................................................ 352. Voies d’administration de l’insuline........................................................................................................ 372.1. Sous-cutanée...................................................................................................................................................... 372.2. Intra-péritonéale ................................................................................................................................................ 412.3. Pulmonaire......................................................................................................................................................... 422.4. Orale .................................................................................................................................................................. 43CHAPITRE3 :ANALOGUES DE LINSULINE........................................................................................................ 451. Introduction : limites de l’insuline humaine recombinante ..................................................................... 452. Relations structure-activité...................................................................................................................... 502.1. Interaction de l’insuline avec son récepteur....................................................................................................... 502.2. Interaction de l’insuline avec le récepteur à l’IGF-1 ......................................................................................... 532.3. Modifications de l’insuline affectant sa stabilité ............................................................................................... 532.4. Modifications de l’insuline affectant la formation de dimères et hexamères ..................................................... 543. Les principaux analogues ........................................................................................................................ 563.1. Asp(B10) ........................................................................................................................................................... 563.2. Lispro ................................................................................................................................................................ 573.3. Asparte .............................................................................................................................................................. 613.4. Glulisine ............................................................................................................................................................ 623.5. NovoSol Basal ................................................................................................................................................... 633.6. Glargine ............................................................................................................................................................. 643.7. Détémir.............................................................................................................................................................. 683.8. « Nouveaux » analogues.................................................................................................................................... 72CHAPITRE4 :DOSAGE DE LINSULINE ET DE SES ANALOGUES........................................................................... 731. Milieu biologique..................................................................................................................................... 732. Méthodes chromatographiques ............................................................................................................... 733. Immunodosages ....................................................................................................................................... 763.1. Insuline .............................................................................................................................................................. 763.2. Analogues.......................................................................................................................................................... 80DEUXIEME PARTIE ETUDE EXPERIMENTALE......................................................... 82CHAPITRE1 :MATERIELS................................................................................................................................. 831. Insulines................................................................................................................................................... 831.1. Spécialités pharmaceutiques .............................................................................................................................. 831.2. Métabolites de l’insuline glargine...................................................................................................................... 842. Milieux de dilution des insulines ............................................................................................................. 852.1. Tampon.............................................................................................................................................................. 852.2. Diluant universel Elecsys .................................................................................................................................. 852.3. Pools de sérums ................................................................................................................................................. 852.4. Sérums et plasmas ............................................................................................................................................. 863. Trousses de dosage, calibrants et contrôles ............................................................................................ 874. Carboxypeptidase B................................................................................................................................. 87
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5. Inhibiteurs enzymatiques et cations......................................................................................................... 885.1. Inhibiteurs enzymatiques ................................................................................................................................... 885.2. Cations............................................................................................................................................................... 906. Statistiques............................................................................................................................................... 90CHAPITRE2 :METHODES.................................................................................................................................. 911. Dosages ................................................................................................................................................... 911.1.Immunodosages de l’insuline ................................................................................................................... 911.2. Anti-insulin RIA ................................................................................................................................................ 952. Evaluation analytique des immunodosages d’insuline ............................................................................ 972.1. Comparaison de Bi-insulin IRMA et Insuline Elecsys ...................................................................................... 972.2. Choix d’un diluant ............................................................................................................................................. 972.3. Réactivité croisée des analogues........................................................................................................................ 982.4. Effet de l’hémolyse sur les analogues................................................................................................................ 982.5. Interférence des anticorps anti-insuline ............................................................................................................. 993. Etude de la biotransformation de la glargine in vitro ........................................................................... 1003.1. Réactivité croisée des métabolites ................................................................................................................... 1003.2. Biotransformationin vitro............................................................................................................................... 100CHAPITRE3 :RESULTATS............................................................................................................................... 1021. Evaluation analytique des immunodosages d’insuline .......................................................................... 1021.1. Comparaison de Bi-insulin IRMA et Insuline Elecsys .................................................................................... 1021.2. Choix d’un diluant ........................................................................................................................................... 1031.3. Réactivité croisée des analogues...................................................................................................................... 1091.4. Effet de l’hémolyse sur l’insuline humaine et les analogues ........................................................................... 1151.5. Interférence des anticorps anti-insuline ........................................................................................................... 1162. Etude de la biotransformation de la glargine in vitro ........................................................................... 1202.1. Réactivité croisée des métabolites ................................................................................................................... 1202.2. Biotransformationin vitro............................................................................................................................... 122CHAPITRE4 :DISCUSSION............................................................................................................................... 1301. Evaluation analytique des immunodosages d’insuline .......................................................................... 1301.1. Comparaison Bi-insulin IRMA et Insuline Elecsys ......................................................................................... 1301.2. Choix d’un diluant ........................................................................................................................................... 1301.3. Réactivité croisée des analogues...................................................................................................................... 1311.4. Effet de l’hémolyse sur les analogues.............................................................................................................. 1321.5. Interférence des anticorps anti-insuline ........................................................................................................... 1332. Etude de la biotransformation de la glargine in vitro ........................................................................... 135CONCLUSION..................................................................................................................... 139BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................... 142
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LISTE DES ABREVIATIONS
BSABovine serum albumin CLHPChromatographie liquide haute performance CPBCarboxypeptidase B CPHCarboxypeptidase H CPNCarboxypeptidase N CPUCarboxypeptidase U DCCTDiabetes Control and Complications Trial GLUT-2Transporteur membranaire du glucose de type 2 GLUT-4Transporteur membranaire du glucose de type 4 HbA1CHémoglobine A1CIDEInsulin degrading enzyme IGF-1Insulin-like growth factor 1 IRMAImmuno-radiometric assay IRSInsulin receptor substrate NPHNeutral protamine Hagedorn OMSOrganisation Mondiale de la Santé PBS-BSAPhosphate buffered saline – Bovine serum albumin PC2Proprotein Convertase 2 PC3Proprotein Convertase 3 PEGPolyéthylène glycol RIRécepteur de l’insuline RIARadio-immunoassay TAFIThrombin-activatable fibrinolysis inhibitor TAFIaThrombin-activatable fibrinolysis inhibitoractivé TRIStris-hydroxyméthylaminométhane, 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol UKPDSUnited Kingdom Prospective Diabetes Study
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INTRODUCTION
La quantification de l’insuline sérique dans les études de pharmacocinétique et en biochimie clinique courante est habituellement effectuée par immunodosage [1-3]. Des immunodosages spécifiques des analogues rapides ont été développés pour les études pharmacocinétiques [4, 5], mais ne sont pas commercialisés à l’exception de celui de la lispro. Les immunodosages « non spécifiques » de l’insuline humaine (non spécifiques pour les analogues mais spécifiques vis-à-vis de la proinsuline) sont couramment utilisés dans les études cliniques impliquant des analogues [6, 7], conduisant à un résultat appelé « insuline immunoréactive ». Les réactivités croisées de l’insuline et de ses analogues sont généralement déterminées en milieu tampon, mais les limites et les pièges de telles méthodes sont rarement évalués [8-10]. Les réactivités croisées des analogues ont été établies en milieu BSA (Bovine serum albumin) avec une sélection d’immunodosages de l’insuline humaine commercialisés et automatisés ; aucune de ces méthodes ne montre une réactivité croisée proche de 100% pour l’ensemble des analogues testés (lispro, asparte et glargine) [11, 12].
Nous avons sélectionné deux immunodosages pour leur différence de spécificité d’anticorps. Dans le but de pouvoir proposer une méthode simple de dosage de l’insuline et des analogues utilisable en pratique clinique courante, nous avons étudié dans la première partie de ce travail le comportement de ces deux immunodosages vis-à-vis des analogues de l’insuline en milieu tampon et en milieu sérique (spécificité) et leur sensibilité aux interférences.
Dans la seconde partie de ce travail, le profil de spécificité particulier du dosage Insuline Elecsys a été mis à profit pour l’étude de la biotransformationin vitrode l’insuline glargine. L’intérêt de l’étude de cette biotransformation est certain. En effet, en clinique cet analogue lent présente une variabilité d’action inter-individuelle relativement importante et l’implication du métabolisme de cette molécule dans cette variabilité est possible.
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PREMIERE PARTIE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
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1. Historique
Chapitre 1 : Généralités sur l’insuline
Paul Langerhans (1847-1888), un étudiant médecin allemand, est le premier à décrire dans sa thèse en 1869, les îlots du pancréas sans leur attribuer une fonction particulière. En 1893, E. Laguesse leur donne le nom d’îlots de Langerhans [13]. L’importance du pancréas pour le métabolisme des glucides est connue depuis les expériences de Freiherr von Mering (1849-1908) et Oscar Minkowski (1858-1931) en 1890 [14]. Après ablation, chez le chien, du pancréas, ils observent l’ensemble des symptômes du diabète, à savoir, une hyperglycémie (concentration sanguine de glucose élevée), une glycosurie (présence de glucose dans les urines) et finalement une mort en 2 à 3 semaines impliquant une cétose (accumulation sanguine des corps cétoniques) et un coma. Leurs résultats sont la première preuve expérimentale de l’origine pancréatique du diabète. En 1900, Eugène Lindsay Opie (1873-1971), un assistant à l’Université Johns-Hopkins (Baltimore, Etats-Unis), décrit la dégénérescence hyaline des îlots de Langerhans au cours du diabète [15]. Les îlots sont alors considérés comme la source probable d’une sécrétion interne du pancréas qui permet un métabolisme du glucose normal et l’absence de diabète [15, 16].
En 1905, Ernest Henry Starling (1866-1927) invente le terme « hormone » (grec : hormaein, mettre en mouvement) pour désigner les messagers chimiques sécrétés par les glandes endocrines de l’organisme. Dès 1894, Sir Edward Albert Sharpey-Schäfer (1850-1935) suggère, sur des bases morphologiques, que les îlots pourraient être responsables de la sécrétion interne par laquelle le pancréas produit son effet sur la concentration sanguine de glucose. En 1909 et 1913, Jean de Meyer (1878-1934) et E. A. Sharpey-Schäfer dénomment « insuline » (latin :insula, île) la substance hormonale encore hypothétique présente dans les îlots [16-18].
Pendant les deux premières décennies du 20ème siècle, plusieurs chercheurs préparent des extraits pancréatiques ayant la propriété de diminuer la glycémie ou celle de réduire la glycosurie chez l’animal [16]. Cependant, des difficultés de purification (présence
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d’impuretés) et des réactions toxiques (fièvre, abcès douloureux) empêchent toute administration au patient diabétique [19-23]. En 1921, Frederick Grant Banting (1891-1941), un jeune chirurgien orthopédique de l’Ontario, travaillant dans le laboratoire de John James Rickard Macleod (1876-1935), physiologiste à l’Université de Toronto, étudie la fonction des îlots pancréatiques. L’attention de Banting est attirée par un article de Moses Barron de l’Université du Minnesota (Etats-Unis) [24]. Il décrit un cas rare de lithiase pancréatique ayant obstrué entièrement le canal pancréatique principal : bien que les cellules acineuses aient disparues par dégénérescence (atrophie), la plupart des cellules d’îlots ont survécu intactes. Barron note les similitudes de cette observation avec la ligature expérimentale des canaux pancréatiques. En effet, en 1901, L.V. Ssobolev (1876-1919) avait montré que la ligature des canaux pancréatiques chez le lapin, le chat ou le chien conduit à une atrophie graduelle et une destruction des cellules acineuses secrétant les enzymes, alors que les cellules d’îlots restent intactes pendant des semaines, sans apparition de glycosurie [25]. L’assistant de Banting, Charles Herbert Best (1899-1978), ligature les canaux pancréatiques chez le chien avant d’extraire le pancréas [26]. Ceci permet de détruire les parties du pancréas sécrétant les enzymes tout en laissant les îlots de Langerhans intacts. En effet, Banting pense que les échecs antérieurs sont attribuables à l’action destructrice de la trypsine et des autres enzymes pancréatiques sur l’insuline [16]. Leurs expériences produisent un extrait pancréatique qui réduit l’hyperglycémie et la glycosurie chez des chiens rendus diabétiques par ablation du pancréas [27, 28]. Ils développeront par la suite un protocole d’extraction du pancréas entier sans ligature du canal. Le succès de la purification de l’insuline provient largement du travail de James Bertram Collip (1892-1965) [29]. L’extrait pancréatique permet alors les premiers traitements de patients diabétiques ; le premier patient ayant reçu ce traitement est un enfant diabétique âgé de 14 ans, Leonard Thompson [30-33]. Le rendement et la standardisation de l’extrait sont ensuite améliorés grâce à une collaboration avec Eli Lilly et Compagnie. Tout au long de ces découvertes, les querelles entre Banting et Macleod furent continuelles. Le prix Nobel leur fut décerné pour la découverte de l’insuline. Ils décidèrent de le partager avec Best et Collip, respectivement [16].
La compagnie Lilly commence la commercialisation de l’insuline animale dès 1923. Malheureusement, la préparation a une durée d’action inférieure à 6 heures et une recherche s’engage pour la prolonger. En 1936, Hans Christian Hagedorn montre que l’addition d’une protéine basique, telle que la protamine, à la préparation d’insuline, permet de garder
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