Direktgekoppelte miniaturisierte Analysensysteme

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Direktgekoppelte miniaturisierte Analysensysteme zum Nachweis pharmakologisch aktiver Substanzen aus biologischen Proben DISSERTATION der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2004 vorgelegt von Manfred Krucker
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Publié le : mardi 27 mars 2012
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Direktgekoppelte miniaturisierte Analysensysteme
zum Nachweis pharmakologisch aktiver Substanzen
aus biologischen Proben




DISSERTATION



der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Eberhard-Karls-Universität Tübingen
zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften



2004



vorgelegt von
Manfred Krucker

























Tag der mündlichen Prüfung: 20. Februar 2004

Dekan: Professor Dr. H. Probst
1. Berichterstatter: Professor K. Albert
2. Dr. Th. Ziegler Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie der Eberhard-Karls-
Universität Tübingen unter der Anleitung von Herrn Professor Dr. Klaus Albert im
Zeitraum von August 2001 bis Februar 2004 durchgeführt.





















Bei Herrn Professor Dr. Klaus Albert möchte ich mich sehr herzlich für die attraktive
Themenstellung, für sein stetiges Interesse an meiner wissenschaftlichen Arbeit und
für die Bereitstellung der optimalen Analysengeräte-Ausstattung, ohne welche die
Durchführung dieser Arbeit unmöglich gewesen wäre, bedanken. Zudem förderte er
die Vertiefung meines fachlichen Wissens durch viele Forschungsaufenthalte sowie
durch die Teilnahme an unzähligen nationalen wie internationalen Tagungen und
interdisziplinären Workshops. Mein Dank gilt allen meinen Kollegen und Kooperationspartnern, ohne deren
Unterstützung die erfolgreiche Fertigstellung der vorliegenden Arbeit undenkbar
gewesen wäre. Besonders möchte ich mich bedanken bei:

Karsten Putzbach für die perfekte Zusammenarbeit und Arbeitsteilung, sowie die
unzähligen wissenschaftlichen Diskussionen und außeruniversitären Unternehmungen.
Paul Schuler und allen anderen Mitarbeitern der NMR-Abteilung, für die freundliche
Unterstützung bei der Durchführung von NMR-Experimenten.
Gerd Fischer, als „gute Seele“ des Arbeitskreises unverzichtbar.
Dr. Tobias Glaser, Dr. Annette Lienau und Dr. Daniel Zeeb für das Einarbeiten in die
Analytik bioaktiver Substanzen.
Prof. Hong-Bin Xiao für die Zusammenarbeit bei der Analyse des Radix Astragali.
Meinen Kollegen Marc-David Grynbaum, Dr. Urban Skogsberg, Christoph Meyer,
Siri Schauf, Dr. Heidrun Händel, Dr. Elke Gesele, Norbert Welsch, Dr. Ismail Warad
und Sascha Pelz für die Hilfsbereitschaft bei allen Fragen und Problemen, sowohl
fachlicher als auch organisatorischer Natur, sowie das freundschaftliche Arbeitsklima.
Prof. Elsa Lundanes, Prof. Tyge Greibrokk und Thomas Bjellas für die freundliche
Aufnahme und fachliche wie persönliche Hilfestellungen während meines
Aufenthaltes an der Universität Oslo, sowie der Europäischen Union für die
Gewährung eines Marie-Curie Stipendiums.
Prof. Rainer Bischoff für die Bereitstellung der phosphorylierten Peptide.
Dr. Vassiliki Exarchou und Prof. Teris van Beek für die gemeinsamen Messungen zum
Vergleich der Sensitivität unterschiedlicher LC-NMR Systeme sowie die CapLC-
NMR Untersuchungen des Rosmarin-Extraktes.
Dr. Beata Janoszka für die gute Zusammenarbeit und Einladung zu einer Konferenz in
Polen.
Prof. Cynthia Larive für die Möglichkeit, meine Ergebnisse bei der SMASH 2003
Konferenz zu präsentieren. Prof. Andrew Webb für die Einweisung und Hilfe bei der Herstellung eines solenoiden
NMR-Mikroprobenkopfes.
Dr. Gregory Dolnikowski und Dr. Guangwen Tang vom Human Nutrition Research
Center der Tufts University, Boston, USA, für die Zusammenarbeit auf dem Gebiet
der Bioverfügbarkeit von Carotenoiden.
Der Firma Bischoff Chromatography, insbesonders Dr. Stefan Lamotte, für die
Bereitstellung unterschiedlichster stationärer Phasen zur Verwendung in der Kapillar-
HPLC.
Dr. Ulrich Braumann von Bruker Biospin für die tatkräftige Unterstützung bei der
Installation des Kapillar-HPLC-NMR Systems.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, meiner Familie und meinen Freunden für
ihre uneingeschränkte Unterstützung während des gesamten Studiums.
Inhaltsverzeichnis I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG.......................................................................................................1
2 PROBLEMSTELLUNG ......................................................................................2
3 UNTERSUCHTE BIOMEDIZINISCH AKTIVE SUBSTANZKLASSEN....3
3.1 Natürlich vorkommende Antioxidantien .......................................................3
3.1.1 Protektive Wirkungen natürlicher Antioxidantien....................................3
3.1.2 Tocopherole (Vitamin E) ..........................................................................4
3.1.3 Flavonoide ................................................................................................7
3.1.4 Phenolsäuren ..........................................................................................14
3.1.5 Anwendung von Radix Astragali in der traditionellen chinesischen
Medizin (TCM)........................................................................................15
3.2 Peptide .............................................................................................................17
3.2.1 Biomedizinisch aktive Peptide................................................................18
3.2.2 Zellregulation durch Peptid-Phosphorylierung .....................................21
4 ANALYTIK VON BIOMEDIZINISCH AKTIVEN SUBSTANZEN ...........23
4.1 Schonende Extraktion instabiler Analyten..................................................23
4.1.1 Flüssig-Flüssig-Extraktiontechniken......................................................24
4.1.2 Mikro-SPE-HPLC-Kopplung (on-line µSPE) ........................................24
4.1.3 Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) ................................................26
4.2 Kapillar-Hochleistungsflüssigchromatographie (CapLC) .........................27
4.2.1 HPLC-Grundlagen .................................................................................27
4.2.2 Miniaturisierung in der HPLC ...............................................................29
4.3 Grundlagen moderner miniaturisierter Kopplungsmethoden ..................31
4.3.1 Kapillar-HPLC-ESI/MS-Kopplung ........................................................31
II Inhaltsverzeichnis
4.3.2 Kapillar-HPLC-NMR-Kopplung............................................................33
4.3.2.1 Experimenteller Aufbau......................................................................33
4.3.2.2 Mikroprobenkopf-NMR gekoppelt zur Kapillar-HPLC .....................35
5 ERGEBNISSE.....................................................................................................39
5.1 Herstellung hocheffizienter Kapillartrennsysteme.....................................39
5.1.1 Partikuläre stationäre Phasen................................................................40
5.1.2 Monolithische Phasen ............................................................................46
5.2 Kapillar-HPLC-NMR-System Sensitivität ..................................................50
5.3 Trennung und Identifikation von Tocopherol-Homologen........................53
5.3.1 Etablierung der Kapillar-HPLC-Trennung ...........................................53
5.3.2 Kapillar-HPLC-ESI/MS-Kopplung ........................................................55
5.3.3 Continuous-flow Kapillar-HPLC-NMR-Kopplung ................................58
5.3.4 Stopped-flow 2D-NMR-Experimente......................................................61
5.4 Identifikation von Isoflavonoiden in Radix Astragali .................................64
5.4.1 Kapillar-HPLC-NMR-Messungen einer Flavonoid
Standardmischung ..................................................................................65
5.4.2 Kapillar-HPLC-ESI/MS-Experimente einer Standardmischung ...........71
5.4.3 HPLC-ESI/MS-Messungen eines Radix Astragali MSPD-Extraktes .....73
5.4.4 Stopped-flow Kapillar-HPLC-NMR-Experimente eines gepoolten
Radix Astragali MSPD-Extraktes...........................................................76
5.5 µSPE-Kapillar-HPLC-System zum Nachweis bioaktiver Peptide in
Gewässerproben .............................................................................................80
5.6 Bestimmung von Phosphorylierungsstellen in synthetischen Peptiden ....90
5.6.1 Mikroprobenkopf-NMR-Experimente.....................................................90
5.6.2 Kapillar-HPLC-NMR-Kopplung............................................................98

Inhaltsverzeichnis III
5.7 Stopped-flow Kapillar-HPLC-NMR-Experimente eines kommerziellen
Rosmarin-Extraktes .....................................................................................100
6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ..................................................104
7 EXPERIMENTELLER TEIL .........................................................................107
7.1 Geräte ............................................................................................................107
7.1.1 HPLC- und Kapillar-HPLC-Anlagen...................................................107
7.1.2 Herstellung von Kapillartrennsäulen108
7.1.3 Massenspektrometer .............................................................................108
7.1.4 NMR-Spektrometer ...............................................................................108
7.2 Chemikalien ..................................................................................................109
7.3 Probenvorbereitung und Extraktion..........................................................109
7.3.1 Standards ..............................................................................................109
7.3.2 Extraktion von biologischen Proben ....................................................110
7.3.3 On-line µSPE zur Bestimmung von Peptiden aus Wasserproben ........111
7.4 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC).........................................111
7.4.1 Chromatographische Bedingungen ......................................................111
7.5 Kapillar-HPLC-MS-Experimente ..............................................................113
7.6 NMR-Spektroskopie.....................................................................................113
7.6.1 Flow-Injektion-NMR-Experimente .......................................................113
7.6.2 Kapillar-HPLC-NMR-Kopplungsexperimente .....................................115
8 LITERATUR.....................................................................................................117
IV Abkürzungsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

α Trennfaktor
δ Chemische Verschiebung
1DEindimensional
2D Zweidimensional
ACE Angiotensin Converting Enzyme
ADP Adenosin-Diphosphat
A-D Wandler Analog-Digital Wandler
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
ATP Adenosin-Triphosphat
BETBrunner-Emmett-Teller-Messungen
BHT Butylated Hydroxytoluene
DVBDivinylbenzen
CapLC Kapillar-HPLC
CIDCollision-InducedDissociation, Kollision-induziert Dissoziation,
COSY Correlated Spectroscopy
CP Cross Polarization, Kreuzpolarisation
d Day, Tag
DADDioden-Array UV-Detektor
DNS Desoxyribonucleinsäure
DODeuteriumoxid 2
ESI ElectrosprayIonisierung
FID Free Induction Decay, freier Induktionsabfall
GABA γ-Aminobuttersäure
h Hour, Stunde
HOWasser2
HETP Höhenequivalent eines theoretischen Bodens
HPLC High Performance Liquid Chromatography
I.D. Innendurchmesser
k´Retentionsfaktor

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